王錦軍

蛇床子素增強TNF-α對骨肉瘤細胞凋亡誘導(dǎo)活性及機制研究

王錦軍

目的觀察蛇床子素增強腫瘤壞死因子對骨肉瘤細胞的凋亡能力及其機制。方法將骨肉瘤細胞系HOS分為對照組、TNF-α組及蛇床子素聯(lián)合TNF-α組和蛇床子素+TNF-α+CYLD siRNA組；MTT法檢測HOS細胞的細胞活力，Annexin V/PI染色檢測HOS細胞的凋亡，免疫共沉淀聯(lián)合Western blot法檢測HOS細胞RIP1蛋白的泛素化，Western blot法檢測HOS細胞caspase-8的活化和CYLD去泛素化酶的相對表達量。結(jié)果與對照組比較，TNF-α組、蛇床子素+TNF-α組對HOS細胞活力的抑制率增加 [（12.5±0.9）%、（58.6±3.8）%比0，P＜0.05]，TNF-α組、蛇床子素+ TNF-α組對HOS細胞凋亡誘導(dǎo)率提高（8.3±0.5）%、（39.9±2.5）%比（1.9±0.3）%，P＜0.05]，而蛇床子素+TNF-α+CYLD siRNA組的HOS細胞活力抑制率、HOS細胞凋亡誘導(dǎo)率均低于蛇床子素+TNF-α組[（22.1±1.2）%比（58.6±3.8）%，P＜0.05；（13.5±0.9）%比（39.9±2.5）%，P＜0.05]。與對照組、TNF-α組比較，蛇床子素+TNF-α組RIP1泛素蛋白相對表達量降低（0.28±0.02比1.00±0.07、0.81±0.06，P＜0.05），蛇床子素+TNF-α組活化的caspase-8蛋白的相對表達量明顯提高（0.46±0.04比0.01±0.01、0.08±0.02，P＜0.05），蛇床子素+TNF-α組CYLD蛋白的相對表達量也明顯增加（0.81±0.05比0.28± 0.02、0.30±0.02，P＜0.05）。與蛇床子素+TNF-α組比較，蛇床子素+TNF-α+CYLD siRNA組RIP1泛素蛋白相對表達量增加（0.77±0.05比0.28±0.02，P＜0.05），顯示CYLD siRNA能顯著抑制蛇床子素對TNF-α的協(xié)同作用。結(jié)論蛇床子素通過上調(diào)去泛素化酶CYLD的表達水平，促進TNF-α依賴的RIP1蛋白的去泛素化，進而誘導(dǎo)骨肉瘤細胞caspase-8的活化和凋亡的發(fā)生。

骨肉瘤；蛇床子素；TNF-α；RIP1；去泛素化；caspase-8；細胞凋亡

骨肉瘤是最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，好發(fā)于兒童和青少年時期，很容易發(fā)生局部浸潤和早期全身性轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重危害少年兒童人群的健康[1]。腫瘤壞死因子（TNF-α）是一種由活化的巨噬細胞分泌的多功能細胞因子，能介導(dǎo)細胞凋亡和炎癥反應(yīng)。TNF-α能誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生凋亡，然而為了獲得令人滿意的腫瘤治療效果，臨床中往往需要較大的TNF-α使用劑量，而病人往往不能耐受高劑量TNF-α造成的副作用[2]。因此，尋找TNF-α的增敏藥物以降低它的使用劑量并避免其毒性反應(yīng)具有十分重要的意義。本文研究蛇床子素是否能增強腫瘤壞死因子對骨肉瘤細胞的凋亡能力并研究其機制。

1 材料與方法

1.1 材料 噻唑藍（3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT）、蛇床子素（osthole）、腫瘤壞死因子（TNF-α），Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒購于美國Sigma-Aldrich。細胞蛋白提取液、RIP1（受體相互作用蛋白激酶1）抗體、RIP1泛素蛋白抗體、活化型caspase-8（cleaved caspase-8）抗體、CYLD（頭帕腫瘤綜合征蛋白)抗體和β-actin抗體購于美國Cell Signaling。蛋白G免疫共沉淀瓊脂糖珠購于美國Santa Cruz。CYLD siRNA購于廣州銳博生物科技有限公司。Lipofectamine 2000購于美國Invitrogen。ECL（增強型化學(xué)發(fā)光底物）試劑盒購于美國Pierce。

1.2 細胞培養(yǎng) 人骨肉瘤細胞系HOS購于美國ATCC（美國模式菌種收集中心）。將細胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并通入5%CO2。

1.3 細胞活力檢測 將HOS細胞按5×103/孔接種在96孔板上，分為對照組，TNF-α組，蛇床子素+ TNF-α組和蛇床子素+TNF-α+CYLD siRNA組。對照組為HOS細胞不加藥物培養(yǎng)48h，蛇床子素組為在HOS細胞中加入100mol/L的蛇床子素培養(yǎng)48h，TNF-α組為在HOS細胞中加入10ng/mL的TNF-α培養(yǎng)48h，蛇床子素聯(lián)合TNF-α組為在HOS細胞中加入100mol/L的蛇床子素和10ng/mL的TNF-α培養(yǎng)48h，蛇床子素+TNF-α+CYLD siRNA組為先將50pmol/mL的 CYLD siRNA用 Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染入HOS細胞培養(yǎng)24h，之后更換培養(yǎng)基再加入100mol/L的蛇床子素和10ng/mL的TNF-α繼續(xù)培養(yǎng)48h。藥物處理完畢后在培養(yǎng)體系中加入20μL 5g/L MTT再培養(yǎng)4h，棄去上清，往孔中加入150μL

1.4 細胞凋亡實驗 將HOS細胞按1×106/孔接種在6孔板上，分為對照組，TNF-α組，蛇床子素+ TNF-α組和蛇床子素+TNF-α+CYLD siRNA組。藥物處理同上。藥物處理完畢后將細胞用生理鹽水洗滌2次，按照凋亡試劑盒說明書步驟將PI（碘化丙啶）和Annexin-V加入細胞中孵育20min，采用流式細胞術(shù)檢測腫瘤細胞的凋亡，凋亡率用Annexin-V陽性、PI陰性細胞數(shù)占總細胞數(shù)的百分比表示。

1.5 免疫共沉淀 將HOS細胞接種在細胞培養(yǎng)瓶中，待細胞鋪滿培養(yǎng)瓶后進行實驗，分組及藥物處理同上。藥物處理完畢后對HOS細胞進行計數(shù)，取2× 106的各組細胞用免疫沉淀緩沖液進行裂解，緩沖液的成分如下：50mmol/L Tris-HCl（pH 7.4)，1%NP-40細胞裂解液，150mmol/L NaCl，1mmol/L EDTA，1%混合蛋白酶抑制劑（Sigma-Aldrich）。HOS細胞在裂解液下處理15min后，將其在12 000g下離心10min，收取上清液并在其中加入RIP1抗體孵育過夜，之后加入蛋白G瓊脂糖珠孵育2h。孵育完成后將其在1200g速度下離心5min，將瓊脂糖珠離心至管底，之后將上清小心吸去，瓊脂糖珠用免疫沉淀緩沖液洗滌2次后加入Western blot上樣緩沖液，沸水浴煮5min后備用，用于檢測與RIP1結(jié)合的泛素蛋白。

1.6 Western blot實驗 將HOS細胞接種在細胞培養(yǎng)瓶中，待細胞鋪滿培養(yǎng)瓶后進行實驗。實驗分為對照組、蛇床子素組、TNF-α組、蛇床子素+TNF-α組和蛇床子素+TNF-α+CYLD siRNA組,藥物處理同上。藥物處理完畢后將細胞用生理鹽水洗滌2遍并提取總蛋白質(zhì)。將蛋白提取液或免疫共沉淀處理樣品用12.5%SDS-PAGE進行電泳分離。分離完畢后通過電轉(zhuǎn)方法將蛋白質(zhì)從分離膠上轉(zhuǎn)到PVDF膜上，用RIP1泛素蛋白抗體，cleaved caspase-8抗體，CYLD抗體或β-actin抗體孵育過夜，之后再用帶辣根過氧化物酶的二抗孵育2h，蛋白條帶用ECL試劑盒顯色發(fā)光。蛋白灰度值分析用Image J軟件處理。cleaved caspase-8和CYLD、相對表達水平用蛋白灰度值與β-actin灰度值比值表示。與RIP1結(jié)合的泛素蛋白的相對表達水平用以下公式計算：泛素蛋白相對表達水平=灰度值治療組/灰度值對照組。對雙邊t檢驗，P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 蛇床子素通過CYLD途徑顯著提高TNF-α對HOS的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng) 將HOS細胞用蛇床子素和TNF-α處理后用MTT法檢測它們的細胞活力并用Annexin V/PI染色法檢測細胞的凋亡。結(jié)果發(fā)現(xiàn)蛇床子素能顯著提高TNF-α對HOS細胞的殺傷活性和凋亡誘導(dǎo)活性，然而轉(zhuǎn)染CYLD siRNA后蛇床子素對TNF-α的協(xié)同效應(yīng)受到明顯抑制，見表1。

2.2 蛇床子素通過上調(diào)去泛素化酶CYLD的表達促進TNF-α依賴的RIP1去泛素化 為了明確蛇床子素對TNF-α發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)的分子機制，作者進行了后續(xù)實驗。通過免疫共沉淀及Western blot實驗我們發(fā)現(xiàn)蛇床子素能顯著促進TNF-α依賴的RIP1去泛素化，進而顯著活化HOS細胞內(nèi)的caspase-8誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡。通過進一步實驗作者發(fā)現(xiàn)蛇床子素促進RIP1蛋白去泛素化的機制可能和上調(diào)CYLD蛋白的表達量有關(guān)，將CYLD進行基因沉默后，蛇床子素喪失了對RIP1蛋白去泛素化的促進作用，同時caspase-8的活化受到了明顯抑制，結(jié)果見表2。

表1 蛇床子素顯著提高TNF-α對HOS細胞的抗腫瘤活性（±s）

表1 蛇床子素顯著提高TNF-α對HOS細胞的抗腫瘤活性（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與TNF-α組比較，#P＜0.05；與蛇床子素+TNF-α比較，△P＜0.05。TNF-α：腫瘤壞死因子-α；CYLD siRNA：頭帕腫瘤綜合征蛋白小干擾RNA

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表2 蛇床子素促進TNF-α依賴的RIP1蛋白去泛素化（±s）

表2 蛇床子素促進TNF-α依賴的RIP1蛋白去泛素化（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與TNF-α組比較，#P＜0.05；與蛇床子素+TNF-α組比較，△P＜0.05。TNF-α：腫瘤壞死因子-α；RIP1：受體相互作用蛋白激酶1；cleaved caspase-8：活化的半胱天冬酶8；CYLD：頭帕腫瘤綜合征蛋白；CYLD siRNA：頭帕腫瘤綜合征蛋白小干擾RNA

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3 討論

蛇床子素是從中藥蛇床子中提取的活性物質(zhì)，具有多種藥理活性。近年研究發(fā)現(xiàn)，蛇床子素除了具有抗?jié)裾睿蛊つw瘙癢，抗炎癥，抗肝炎等臨床作用外，還具有顯著的抗腫瘤活性[3-5]。TNF-α能誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生凋亡，因此TNF-α是一種有很好前景的抗腫瘤藥物[6]。然而大劑量TNF-α所誘發(fā)的副作用大大限制了TNF-α的臨床應(yīng)用，因此研究如何提高腫瘤細胞對TNF-α的敏感性以降低其使用劑量是目前研究工作的重點。本研究顯示蛇床子素能顯著提高TNF-α對骨肉瘤細胞的殺傷活性和凋亡誘導(dǎo)能力，因此蛇床子素是一種有良好前景的TNF-α輔助治療藥物。

在TNF-α誘導(dǎo)的凋亡通路中，RIP1蛋白的去泛素化是其中的關(guān)鍵步驟。當(dāng)TNF-α與其受體結(jié)合后，細胞中的RIP1蛋白會發(fā)生去泛素化，繼而形成RIP1依賴的死亡受體復(fù)合物，該復(fù)合物能進一步活化caspase-8最終導(dǎo)致凋亡的發(fā)生。在本研究中，筆者首次發(fā)現(xiàn)蛇床子素能顯著促進TNF-α依賴的骨肉瘤細胞RIP1蛋白的去泛素化。當(dāng)腫瘤細胞中的RIP1蛋白發(fā)生去泛素化后，腫瘤細胞中的caspase-8發(fā)生顯著活化，且凋亡程度顯著增加，實驗結(jié)果與文獻報道一致[7]，表明蛇床子素能通過RIP1途徑發(fā)揮對TNF-α的協(xié)同作用。

本研究發(fā)現(xiàn)蛇床子素在HOS細胞中的直接靶點是CYLD蛋白，它能顯著增加骨肉瘤細胞CYLD的表達水平。當(dāng)在骨肉瘤細胞中轉(zhuǎn)染CYLD siRNA抑制CYLD的表達后，蛇床子素對TNF-α的協(xié)同抗腫瘤作用喪失，證明CYLD的過表達是蛇床子素發(fā)揮對TNF-α協(xié)同作用的分子機制。去泛素化酶CYLD是一種腫瘤抑制因子，當(dāng)TNF-α與相應(yīng)受體結(jié)合后，凋亡通路被激活，CYLD被募集到RIP1蛋白周圍并特異性去除RIP1蛋白上的泛素蛋白，從而激活RIP1蛋白依賴的死亡受體復(fù)合物和凋亡信號通路，因此CYLD的表達水平在一定程度上決定了腫瘤細胞對TNF-α的敏感性。這些文獻報道[8-9]與本實驗結(jié)果一致，表明蛇床子素增強TNF-α對骨肉瘤細胞凋亡誘導(dǎo)活性的機制可能是通過CYLD/RIP1/caspase-8途徑。

綜上所述，本研究證明蛇床子素能顯著提高骨肉瘤細胞對TNF-α的敏感性。其機制是蛇床子素可能通過上調(diào)去泛素化酶CYLD的表達水平促進TNF-α依賴的RIP1蛋白的去泛素化進而誘導(dǎo)骨肉瘤細胞caspase-8的活化和凋亡的發(fā)生。這些研究為如何提高TNF-α的抗腫瘤活性，減少它的治療副作用提供了新的思路和理論依據(jù)。

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［2］Billiet T，Rutgeerts P，Vermeire S，et al.Targeting TNF-α for the treatment of inflammatory bowel disease［J］.Expert Opin Biol Ther，2014，14（1）：75-101.

［3］Wen YC，Lee WJ，Chien MH，et al.By inhibiting snail signaling and miR-23a-3p，osthole suppresses the EMT-mediated metastatic ability in prostate cancer［J］.Oncotarget， 2015，6（25）：21120-21136.

［4］Lin YC，Lin JC，Way TD，et al.Osthole inhibits insulin-like growth factor-1-induced epithelial to mesenchymal transition via the inhibition of PI3K/Akt signaling pathway in human brain cancer cells［J］.J Agric Food Chem，2014，62（22）：5061-5071.

［5］Gao Z，Wen Q，Zou S.Osthole augments therapeutic efficiency of neural stem cells-based therapy in experimental autoimmune encephalomyelitis［J］.J Pharmacol Sci，2014，124 （1）：54-65.

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（收稿：2016-04-15 修回：2016-05-29）

Osthole Promotes TNF-α-induced Apoptosis in Osteosarcoma and the Underlying Mechanism

WANG Jin->jun. Department of Pediatrics,Central Hospital of Jinhua City,Jinhua(321000),China

ObjectiveTo investigate the role of osthole in TNF-α-induced apoptosis in osteosarcoma and the underlying mechanism.MethodsHOS cells were divided into control group,TNF-α group,osthole group,osthole+TNF-α group,and osthole+TNF-α+CYLD siRNA group.The cell viability,cell apoptosis,ubiquitination of RIP1 protein, and the relative expression of cleaved caspase-8 and CYLD were detected by MTT assay,Annexin V/PI staining,coimmunoprecipitation together with Western Blot,respectively.Results The inhibitory rate of cell viability and the apoptotic rate of cells in TNF-α group group and osthole+TNF-α group were significantly higher than that in control group(12.5%±0.9%,58.6%±3.8%vs 0;8.3%±0.5%,39.9%±2.5%vs 1.9%±0.3%;all P＜0.05).Those index in osthole+ TNF-α+CYLD siRNA group were significantly lower than those in osthole+TNF-α group(22.1%±1.2%vs 58.6%±3.8%; 13.5%±0.9%vs 39.9%±2.5%;all P＜0.05).Compared with control group and TNF-α group,the relative expression of ubiquitin protein conjugated with RIP1 was significantly lower and the relative expression of cleaved caspase-8 was higher in osthole+TNF-α group(RIP1：0.28±0.02 vs 1.00±0.07,0.81±0.06;caspase-8：0.46±0.04 vs 0.01±0.01,0.08±0.02; CYLD：0.81±0.05 vs 0.28±0.02,0.30±0.02;all P＜0.05).The relative expression of ubiquitin protein conjugated with RIP1 in osthole+TNF-α+CYLD siRNA group was significantly higher than that in osthole+TNF-α group(0.77±0.05 vs 0.28±0.02,P＜0.05),indicating that transfection with CYLD siRNA significantly impaired the synergistic effect of osthole on the TNF-α-induced cell death and apoptosis.Conclusion Osthole promotes TNF-α-dependent deubiquitination of RIP1 and the subsequent cleavage of caspase-8 and apoptosis by upregulating the expression of CYLD.

osteosarcoma;osthole;TNF-α;RIP1;deubiquitination;caspase-8;apoptosis

浙江省金華市中心醫(yī)院兒一科（金華 321000）