王英，洪偉勇，王金明

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310053； 2.臺州市立醫(yī)院藥劑科，浙江 臺州 318000

高效液相色譜法同時測定大血藤中原兒茶酸和綠原酸的含量

王英1，2，洪偉勇2，王金明2

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310053； 2.臺州市立醫(yī)院藥劑科，浙江 臺州 318000

目的：建立高效液相色譜法測定大血藤中原兒茶酸和綠原酸的含量。方法：使用ODS2 C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）色譜柱。以甲醇-0.2%甲酸水為流動相進(jìn)行梯度洗脫，流速1 mL/min，柱溫為30℃，檢測波長為254 nm，進(jìn)樣量為10 μL。結(jié)果：原兒茶酸在0.017 0～1.70 mg/mL的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，加樣回收率為97.83%，RSD為2.31%；綠原酸在0.015 2～1.52 mg/mL的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，加樣回收率為96.87%，RSD為1.69%。結(jié)論：高效色相色譜法測定大血藤中原兒茶酸和綠原酸的方法具有專屬性強(qiáng)、回收率高、重復(fù)性好等突出特點(diǎn)，能夠比較快速、準(zhǔn)確地測定大血藤藥材中原兒茶酸和綠原酸的含量。

高效液相色譜法；大血藤；原兒茶酸；綠原酸

大血藤為木通科植物大血藤Sargentodoxa cuneata(Oliv.) Rehd.et Wils的干燥藤莖，具有活血、祛瘀、清熱解毒等功效，主要用于跌打損傷、風(fēng)濕痹痛、痛經(jīng)、腸癰腹痛等[1～2]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，大血藤含有的化學(xué)成分具有較明顯的抗炎、抑菌、鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)等作用[3]。大血藤中含有的原兒茶酸和綠原酸具有多方面的藥理活性，但關(guān)于其含量測定的報道相對較少。筆者采用高效液相色譜法測定大血藤中原兒茶酸和綠原酸的含量，以期為控制大血藤藥材質(zhì)量提供依據(jù)。

1 儀器與藥品

1.1 儀器 安捷倫高效液相色譜儀(包括柱溫箱，自動進(jìn)樣器，泵，紫外檢測器)；BT25S型電子分析天平(北京賽多利斯分析儀器有限公司)，電熱恒溫水浴鍋(上海醫(yī)療器械五廠)，2500DE超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，DFT-50手提式高速萬能粉碎機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司)。

1.2 藥品 原兒茶酸(中國食品藥品檢定所研究院，110761-201409)；綠原酸(中國食品藥品檢定所研究院，110542-201410)；甲醇(色譜純，西隴化工有限公司，20140318)；甲酸(Sigma公司，分析純)；大血藤藥材購自河北安國藥材市場，經(jīng)鑒定為木通科植物大血藤的干燥藤莖；水為超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Dkima ODS2 C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)。以甲醇(A)-0.2%甲酸水(B)為流動相進(jìn)行梯度洗脫，梯度洗脫程序：10%～25%B(0～20 min)；25%B(20～35 min)；25%～10%B(35～40 min)。流速：1 mL/min，檢測波長：254 nm，柱溫：30℃。

2.2 混合對照品溶液的制備 取原兒茶酸、綠原酸對照品適量，精密稱定，將其置于50 mL量瓶中，加適量的甲醇使其溶解并定容至刻度，搖勻，即得濃度為0.170 mg/mL、0.152 mg/mL的混合對照品儲備溶液，備用。

2.3 供試品溶液的制備 取大血藤藥材飲片適量，烘干、粉碎、過篩，取粉末(過65目)約0.5 g，精密稱定，置具塞的錐形瓶中，精密加入25 mL甲醇，精密稱定，超聲提取(功率300 W，頻率50 kHz)30 min，放涼，再精密稱定，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精密吸取混合對照品溶液0.1、0.2、0.5、1、2、5、10 mL，置于10 mL的量瓶中，加甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻。精密吸取各對照品溶液10 μL注入高效液相色譜儀，照2.1項的色譜條件測定原兒茶酸和綠原酸的峰面積。以原兒茶酸、綠原酸濃度對其峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，可得原兒茶酸的回歸方程為：Y1=76493X-48953，r= 0.999 6。綠原酸的回歸方程為：Y2=69821X-49731，r= 0.999 4。結(jié)果表明，原兒茶酸在0.017 0～1.70 μg的范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系；綠原酸在0.015 2～1.52 μg的范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗 取大血藤供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣量均為10 μL，按照2.1項的色譜條件測定，計算原兒茶酸峰面積的RSD值為1.97%，綠原酸峰面積的RSD值為1.75%。結(jié)果表明，精密度良好，符合含量測定的基本要求。

2.6 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液，于0、2、4、6、8、12、24 h精密吸取10 μL注入高效液相色譜儀，按照2.1項的色譜條件測定，計算原兒茶酸峰面積的RSD值為1.99%，綠原酸面積的RSD值為2.03%，結(jié)果表明，原兒茶酸和綠原酸在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗 取同一批大血藤藥材粉末(過65目)，按照2.3項的方法平行制備6份樣品，分別精密吸取10 μL注入高效液相色譜儀，按照2.1項的色譜條件測定，計算原兒茶酸峰面積的RSD值為1.67%，綠原酸峰面積的RSD值為1.46%。結(jié)果表明，用該方法測定大血藤中原兒茶酸和綠原酸的含量，重復(fù)性較好。

2.8 加樣回收率試驗 取同一批已知原兒茶酸和綠原酸含量的大血藤藥材粉末(過65目)6份，每份約0.2 g，精密稱定，分別加入混合對照品溶液適量，按照2.3項的方法制備溶液，分別精密吸取10 μL注入高效液相色譜儀，按照2.1項的色譜條件測定，計算回收率，結(jié)果見表1、表2。

表1 原兒茶酸加樣回收率 %

表2 綠原酸加樣回收率 %

2.9 樣品含量測定 根據(jù)已建立的含量測定方法，取3批大血藤藥材粉末(過65目)，每批3份，稱取適量，按照2.3項的方法制備樣品，并根據(jù)2.1項的色譜條件測定其峰面積，分別代入線性回歸方程，計算大血藤藥材中原兒茶酸和綠原酸的含量，結(jié)果見表3、表4。

表3 原兒茶酸含量測定結(jié)果(n=3) %

表4 綠原酸含量測定結(jié)果(n=3) %

3 討論

現(xiàn)代藥理學(xué)研究結(jié)果表明，大血藤中含有多種化學(xué)物質(zhì)，其中所含有的原兒茶酸具有較強(qiáng)的抗菌作用，對大腸桿菌、傷寒桿菌、痢疾桿菌及枯草桿菌等均有不同程度的抑菌作用；綠原酸具有抗菌、消炎、抗病毒、抗腫瘤、降血壓、降血脂等作用[4～6]。因而建立大血藤中原兒茶酸和綠原酸的含量測定方法，可為控制大血藤藥材的質(zhì)量提供依據(jù)。

本研究分別考察了加熱回流提取法、超聲提取法的效果，結(jié)果顯示，2種方法提取的原兒茶酸和綠原酸含量無統(tǒng)計學(xué)差異，但受熱時間及溫度對原兒茶酸和綠原酸含量的影響有較大的差異，受熱時間越長、溫度越高，原兒茶酸和綠原酸含量越低，故本研究采用超聲提取。本研究同時對流動相的種類及比例進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示，采用甲醇和0.2%甲酸水作為流動相，并采用梯度洗脫時，可獲得出峰時間、分離度及峰形等均較好的圖譜。

綜上所述，筆者建立的高效色相色譜法測定大血藤中原兒茶酸和綠原酸的方法，具有專屬性強(qiáng)、回收率高、重復(fù)性好等突出特點(diǎn)，能夠比較快速、準(zhǔn)確地測定大血藤藥材中原兒茶酸和綠原酸的含量，可為大血藤藥材質(zhì)量的評定提供一定的依據(jù)。

[1]李宛蓉，桂雙英，王舉濤，等.不同產(chǎn)地大血藤藥材指紋圖譜研究及紅景天苷和綠原酸的含量測定[J].安徽中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2014，33(6)：82-86.

[2]丁越，張永，丁文平，等.HPLC測定大血藤藥材中綠原酸的含量[J].中國實(shí)驗方劑學(xué)雜志，2013，19(4)：99-102.

[3]李霞，楊穎博，李君麗，等.HPLC法同時測定皺皮木瓜中原兒茶酸和綠原酸的含量[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2012，9 (34)：110-112.

[4]韋建華，李耀華，梁臣艷，等.HPLC測定桑葉配方顆粒中原兒茶酸、綠原酸和咖啡酸[J].中國實(shí)驗方劑學(xué)雜志，2011，17(3)：93-95.

[5]周燕園.HPLC測定醋五味子配方顆粒中的原兒茶酸和綠原酸[J].華西藥學(xué)雜志，2014，29(6)：688-690.

[6]郭曉璐，師子明，齊文，等.刺五加果TLC鑒別及原兒茶酸、綠原酸、金絲桃苷的含量測定[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2015，32(8)：618-622.

（責(zé)任編輯：吳凌）

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0256-7415（2016）02-0241-03

10.13457/j.cnki.jncm.2016.02.093

2015-10-10

王英（1982-），女，主管中藥師，主要從事藥物方面的研究工作。