王曉龍，盧天成，王秀然，楊艷玲

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，長(zhǎng)春130118；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長(zhǎng)春130112）

鹿結(jié)核分枝桿菌MPB70蛋白的表達(dá)與免疫原性鑒定

王曉龍1，盧天成1，王秀然1，楊艷玲2＊

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，長(zhǎng)春130118；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長(zhǎng)春130112）

摘 要：本研究以分離的鹿結(jié)核分枝桿菌DNA為模板擴(kuò)增免疫原性蛋白MPB70基因，獲得約590bp片段，并將其克隆，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET－30a－MPB70，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3），經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后純化和SDSPAGE分析，在20ku處可見(jiàn)特異性蛋白條帶。利用鹿結(jié)核陽(yáng)性血清進(jìn)行Western blotting鑒定，原核表達(dá)的融合蛋白可與鹿結(jié)核陽(yáng)性血清抗體結(jié)合，并出現(xiàn)特異的免疫反應(yīng)。該蛋白可作為特異性抗原進(jìn)行鹿結(jié)核病的檢測(cè)，從而為鹿結(jié)核病診斷方法的研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：結(jié)核分枝桿菌；MPB70基因；原核表達(dá)

結(jié)核病是由牛分枝桿菌（Mycobacteriubovis，M.bovis）和結(jié)核分枝桿菌（Mycobacteriumtuberculosis，M.tb）引起的一種慢性消耗性人畜共患病，在世界范圍內(nèi)廣泛存在，為養(yǎng)殖業(yè)和人類健康都帶來(lái)巨大的威脅［1］。全球約1／3人口感染過(guò)結(jié)核分枝桿菌，每年新發(fā)病例800～1 000萬(wàn)，死亡約300萬(wàn)［2］。中國(guó)每年新發(fā)病例450萬(wàn)，死亡13萬(wàn)人［3］。鹿結(jié)核病主要由牛分枝桿菌和人型分枝桿菌引起，但也有一些由結(jié)核分枝桿菌所致［4］。牛分枝桿菌和人型結(jié)核分枝桿菌同為人類結(jié)核病的主要病原菌，病鹿尤其是開放性結(jié)核病鹿是人類結(jié)核病的主要傳染源之一［5］。目前防制鹿結(jié)核病的疫苗主要是BCG減毒活疫苗，但其保護(hù)效果不穩(wěn)定，存在一定的缺陷。目前人們致力于研究一種高效穩(wěn)定的疫苗用于防制結(jié)核病，關(guān)鍵是需要研究一種高特異性、高敏感性的診斷方法。

本試驗(yàn)利用分子克隆方法獲得結(jié)核桿菌MPB70基因原核表達(dá)菌株；通過(guò)純化融合蛋白及鑒定其免疫原性，為結(jié)核桿菌診斷方法的研究工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1質(zhì)粒和菌株 pET－30a載體購(gòu)自Novagen公司；宿主菌株E.coliDH5α和E.coliBL21（DE3）均購(gòu)自TaKaRa公司；血液基因組和陽(yáng)性血清來(lái)源于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所左家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，分離于結(jié)核陽(yáng)性鹿外周血。

1.1.2主要試劑與儀器 dNTP Mix、DNA Marker、Pfu、10×Pfu Buffer、ExTaqDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶NdeⅠ、XhoⅠ均購(gòu)自TaKaRa公司；Ni－NTA His Bind Purification Kit購(gòu)自Novagen公司；HRP標(biāo)記的兔抗鹿酶標(biāo)二抗由生工生物工程（上海）股份有限公司研制；瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量抽提試劑盒均購(gòu)自北京莊盟國(guó)際基因有限公司。PCR儀；高速離心機(jī)；凝膠成像系統(tǒng)；電泳儀；酶標(biāo)儀；Western轉(zhuǎn)膜裝置；恒溫培養(yǎng)箱；水平搖床；超凈工作臺(tái)；超純水系統(tǒng)?；驕y(cè)序由上海生工生物工程股份有限公司完成。

1.1.3培養(yǎng)基 LB液體培養(yǎng)基：10g／L蛋白胨，10g／L NaCl，5g／L酵母粉，使用前加入終濃度50μg／mL的氨芐青霉素。

1.2方法

1.2.1引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank公布的結(jié)核分枝桿菌MPB70基因序列（登錄號(hào)：F0203509）設(shè)計(jì)引物，引物序列為：MPB70F：5′－CATATGCATATGAAGGTGAAGAACACCATCG－3′；MPB70R：5′－CTCGAGCAAGACGGAGTCGATCATATACACC－3′，下劃線為限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)。引物由長(zhǎng)春華大中天生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.2PCR擴(kuò)增 根據(jù)郭設(shè)平等［6］試驗(yàn)方法進(jìn)行結(jié)核桿菌基因組提取，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系50μL：反應(yīng)緩沖液5μL，模板DNA 1μL，10mmol／L dNTP 2μL，25μmol／L上、下游引物各1.5μL，Taq酶0.5μL，補(bǔ)水至50μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃變性3min；94℃變性30s，55℃退火45s，72℃延伸60s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保溫。1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)片段大小。

1.2.3重組質(zhì)粒的構(gòu)建 將PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收，然后將回收產(chǎn)物與pET－30a載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α克隆菌株，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切檢測(cè)，并對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coliBL21（DE3）表達(dá)菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)［7］。

1.2.4誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化 挑取表達(dá)菌株BL21（DE3）的單菌落于試管中（4mL LB培養(yǎng)基，30μg／mL卡那霉素），37℃、220r／min過(guò)夜培養(yǎng)。將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液按1∶100比例分別接種于3個(gè)4mL LB培養(yǎng)基中，加入30μg／mL卡那霉素，37℃，220r／min培養(yǎng)至D值達(dá)0.5～0.6時(shí)，添加終濃度為0.5mmol／L的IPTG，進(jìn)行誘導(dǎo)條件的篩選，分別為220r／min、20℃誘導(dǎo)過(guò)夜和220r／min、37℃誘導(dǎo)5h，未加IPTG誘導(dǎo)劑的作為陰性對(duì)照。誘導(dǎo)結(jié)束之后收集菌體進(jìn)行SDS－PAGE電泳檢測(cè)。電泳過(guò)后選擇最佳的蛋白表達(dá)誘導(dǎo)條件，進(jìn)行菌液大量誘導(dǎo)。將培養(yǎng)的菌液按1∶100比例接種于1 000mL的LB液體培養(yǎng)基中，添加30μg／mL卡那霉素，37℃、220r／min培養(yǎng)，當(dāng)D值達(dá)到0.5～0.6時(shí)，添加終濃度為0.5mmol／L IPTG，20℃、220r／min誘導(dǎo)過(guò)夜，離心收集菌體進(jìn)行純化［8］。

1.2.5融合蛋白的表達(dá)與純化 將收集的細(xì)菌菌體用破碎Buffer（50mmol／L Tris，500mmol／L NaCl，0.5%TritonX－100，1mmol／L EDTA，2mmol／L DTT，pH 8.0）溶解，冰浴中超聲破碎菌體，功率400W、20min（超聲2s，暫停6s為一個(gè)循環(huán)），超聲完畢，12 000r／min、4℃離心20min［6］，取上清使用鎳瓊脂糖親和層析方法進(jìn)行蛋白純化，取5mL鎳瓊脂糖親和色譜柱，用10倍柱床體積的Binding Buffer（50mmol／L Tris，300mmol／L NaCl，0.2% TritonX－100，1mmol／L DTT，pH 8.0）清洗平衡柱子，流速5mL／min；上柱，流速為2mL／min，收集穿透液；10倍柱床體積的Binding Buffer清洗柱子，流速10mL／min；Wash Buffer（50mmol／L Tris，300mmol／L NaCl，0.1%TritonX－100，20／50mmol／L Imidazole，pH 8.0）洗雜，流速5mL／min，收集洗脫液；Elution Buffer（50mmol／L Tris，300mmol／L NaCl，0.1%TritonX－100，500mmol／L Imidazole，pH 8.0）洗脫，流速2mL／min，收集洗脫液。將收集的樣品進(jìn)行SDS－PAGE電泳檢測(cè)，將50、500mmol／L咪唑洗脫液透析到50mmol／L Tris、300mmol／L NaCl、0.5%Triton－100緩沖液中，4℃透析過(guò)夜。將透析過(guò)夜的蛋白再進(jìn)行一次鎳瓊脂糖親和層析純化，步驟同上，目的蛋白用50mmol／L Tris、300mmol／L NaCl、500mmol／L Imidazole洗脫液進(jìn)行洗脫后透析到1×PBS，0.1%TritonX－100，pH 7.0緩沖液中，4℃透析過(guò)夜，0.45μm濾膜過(guò)濾分裝，－80℃保存。

1.2.6MPB70基因蛋白免疫原性分析 采用Western blotting方法檢測(cè)MPB70基因表達(dá)融合蛋白的免疫原性。取純化后的蛋白，加入蛋白上樣緩沖液，95℃煮樣10min后，進(jìn)行SDS－PAGE蛋白電泳，電泳過(guò)后將凝膠轉(zhuǎn)印至NC膜（20V，15min），取出轉(zhuǎn)印好的NC膜，甲醇固定后洗滌，用5%脫脂奶粉37℃封閉2h，洗滌2次后與臨床分離的結(jié)核陽(yáng)性血清37℃條件下孵育2h（結(jié)核陰性血清作為陰性對(duì)照）。洗滌2次后與HRP標(biāo)記的兔抗鹿IgG 37℃條件下孵育2h，洗滌2次后用DAB顯色，觀察結(jié)果，確定MPB70基因表達(dá)的融合蛋白是否能夠與鹿結(jié)核陽(yáng)性抗體發(fā)生特異性反應(yīng)［7］。試驗(yàn)所用一抗為鹿結(jié)核陽(yáng)性血清，該血清經(jīng)過(guò)商品化的結(jié)核膠體金快速檢測(cè)試紙條診斷為陽(yáng)性，按照1∶50的比例進(jìn)行稀釋，兔抗鹿HRP作為二抗，按照1∶1 000的比例進(jìn)行稀釋。

2 結(jié)果與分析

2.1MPB70基因擴(kuò)增及重組表達(dá)載體的構(gòu)建

將MPB70基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到約590bp的基因片段，該片段與預(yù)期片段大小一致（圖1A）。將獲得的MPB70基因片段連接到T載體上進(jìn)行克隆測(cè)序，比對(duì)結(jié)果顯示該片段與GenBank上公布的分枝桿菌序列100%同源（序列號(hào)：FO203509.1），重組質(zhì)粒酶切后連接到表達(dá)載體pET－30a，雙酶切鑒定顯示獲得590bp的基因片段，與目的基因大小一致（圖1B）；測(cè)序結(jié)果與GenBank上公布的序列100%同源。證明該表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖1　MPB70基因重組質(zhì)粒構(gòu)建Fig.1 Construction recombinant plasmid ofMPB70gene

2.2融合蛋白誘導(dǎo)純化

2.2.1MPB70基因的誘導(dǎo)表達(dá)及純化 將構(gòu)建好的表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coliBL21（DE3）表達(dá)菌中，加入終濃度0.5mmol／L IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，分別在220r／min條件下20℃誘導(dǎo)過(guò)夜和37℃誘導(dǎo)5h，結(jié)果顯示最佳誘導(dǎo)條件為37℃、220r／min誘導(dǎo)5h，表達(dá)產(chǎn)物為包涵體，蛋白大小為26ku（含組氨酸標(biāo)簽），實(shí)際蛋白大小為20ku（圖2）。

將誘導(dǎo)表達(dá)成功融合蛋白經(jīng)過(guò)二次鎳瓊脂糖親和層析純化后，經(jīng)SDS－PAGE檢測(cè)，蛋白大小為20ku（圖3），與目的蛋白大小一致。

圖2　重組蛋白表達(dá)產(chǎn)物和純化蛋白的SDS－PAGE分析Fig.2 SDS－PAGE analysis of the recombinant protein and the purified protein

圖3　MPB70融合蛋白純化SDS－PAGE分析圖Fig.3 SDS－PAGE analysis of MPB70fusion protein after purification

2.2.2MPB70基因免疫原性分析 表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS－PAGE電泳后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，以臨床采集得到的鹿結(jié)核陽(yáng)性血清作為一抗，結(jié)核陰性血清作為陰性對(duì)照，以HRP標(biāo)記的兔抗鹿IgG抗體為二抗，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）為底物進(jìn)行免疫印跡分析，可以明顯看出與結(jié)核陽(yáng)性血清作用在20ku處有一條明顯的蛋白印跡帶（圖4），而陰性對(duì)照沒(méi)有蛋白印跡條帶，說(shuō)明該MPB70基因表達(dá)產(chǎn)物對(duì)鹿分離得到的陽(yáng)性結(jié)核血清具有抗原性。

圖4　Western blotting分析Fig.4 Western blotting analysis

3 討 論

近年來(lái)動(dòng)物結(jié)核病的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年遞增的趨勢(shì)，且傳播范圍不斷擴(kuò)大。中國(guó)對(duì)動(dòng)物結(jié)核病的防控依然是采取檢疫、隔離與淘汰等措施，但由于檢測(cè)方法依然使用傳統(tǒng)的皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)［9］，該方法存在著特異性差，檢測(cè)過(guò)程繁瑣，操作技術(shù)要求高等缺點(diǎn)致使多年來(lái)很少被應(yīng)用，所以目前對(duì)于動(dòng)物結(jié)核病的檢測(cè)工作一直沒(méi)有開展。

MPB70蛋白是結(jié)核分枝桿菌的分泌型蛋白，具有較強(qiáng)的細(xì)胞免疫原性，能夠刺激T細(xì)胞產(chǎn)生較高水平的IFN－γ，MPB70是研制新型診斷試劑的理想抗原物質(zhì)。隨著不同實(shí)驗(yàn)室對(duì)牛結(jié)核分枝桿菌抗原的研究，慢慢的篩選出了部分優(yōu)良的重組蛋白。馮向輝等［10］利用DNAStar對(duì)牛結(jié)核分枝桿菌的3個(gè)主要抗原MPB70、MPB83及esat－6進(jìn)行預(yù)測(cè)分析后，成功構(gòu)建了具有良好反應(yīng)原性的重組蛋白；姜秀云等［11］以牛結(jié)核分枝桿菌Vallee111染色體DNA為模板擴(kuò)增成熟蛋白MPB70基因，成功構(gòu)建原核表達(dá)載體pET－28a－70，并通過(guò)鑒定發(fā)現(xiàn)該蛋白具有牛分枝桿菌抗原性，為亞單位疫苗及DNA疫苗奠定基礎(chǔ)；王志剛等［12］以牛分枝桿菌DNA為模板擴(kuò)增MPB70基因，成功構(gòu)建克隆載體pGEM－MPB70和表達(dá)載體pET30a－MPB70，并對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)的包涵體蛋白進(jìn)行純化及免疫印跡鑒定，發(fā)現(xiàn)原核表達(dá)的融合蛋白與兔抗牛分枝桿菌多克隆抗體結(jié)合并具有特異的免疫反應(yīng)性。

結(jié)核桿菌宿主范圍廣，幾乎能在所有的鹿亞種體內(nèi)分離到。2006年，李玉梅等［13］對(duì)長(zhǎng)春地區(qū)的鹿結(jié)核病調(diào)查發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性率為10.10%。2013年，付志金等［14］對(duì)長(zhǎng)春地區(qū)的鹿結(jié)核病調(diào)查發(fā)現(xiàn)其陽(yáng)性率上升至19.04%。2013年，王紅光等［15］對(duì)貴州某鹿場(chǎng)暴發(fā)的結(jié)核病診斷發(fā)現(xiàn)結(jié)核病鹿會(huì)出現(xiàn)精神不振、行動(dòng)遲緩、身體消瘦等癥狀，這直接影響鹿場(chǎng)梅花鹿產(chǎn)品的銷售和使用，且會(huì)傳染給養(yǎng)殖人員。為此，篩選鑒定特異性的結(jié)核病抗原，建立快速檢測(cè)方法，研制結(jié)核病快速檢測(cè)產(chǎn)品已成為當(dāng)前的重要研究?jī)?nèi)容。

4 結(jié) 論

本研究以結(jié)核分枝桿菌DNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增MPB70基因，PCR及雙酶切鑒定，證實(shí)了所克隆的基因與目的基因大小一致，通過(guò)測(cè)序發(fā)現(xiàn)與結(jié)核分枝桿菌高度同源，并成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET30a－MPB70，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后高效表達(dá)MPB70融合蛋白，經(jīng)過(guò)SDS－PAGE電泳分析，并對(duì)其免疫原性進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)MPB70蛋白能夠和鹿結(jié)核陽(yáng)性血清發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，這在國(guó)內(nèi)還是首次開展此項(xiàng)研究。MPB70蛋白可以作為鹿結(jié)核病的候選檢測(cè)抗原來(lái)建立快速診斷方法，并研制快速診斷產(chǎn)品。

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（責(zé)任編輯 秦 彤）

中圖分類號(hào)：S852.61＋8

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1671－7236（2016）12－3135－06

doi：10.16431／j.cnki.1671－7236.2016.12.008

收稿日期：2016－05－12

基金項(xiàng)目：吉林省科技攻關(guān)項(xiàng)目（20140204070NY）

作者簡(jiǎn)介：王曉龍（1991－），男，吉林榆樹人，碩士生，研究方向：微生物資源開發(fā)與利用，E－mail：15004314273＠163.com

通信作者：＊楊艷玲（1975－），女，吉林人，博士，研究方向：病原微生物與免疫學(xué)，E－mail：yangyanling12280＠sina.com

Expression of MPB70Protein and Identification the Immunogenicity of DeerMycobacteriumtuberculosis

WANG Xiao－long1，LU Tian－cheng1，WANG Xiu－ran1，YANG Yan－ling2＊
（1.CollegeofLifeScience，JilinAgriculturalUniversity，Changchun130118，China；2.Instituteof SpecialAnimalandPlantSciences，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Changchun130112，China）

Abstract：In this study，the immunogenicity proteinMPB70gene was amplified fromMycobacteriumtuberculosisgenome DNA which separated from deer，and about 590bp fragment was obtained.Then the fragment was cloned and constructed prokaryotic expression vector of pET－30a－MPB70，and the recombinant plasmid was put intoE.coliBL21（DE3）.Purified after IPTG induction，and analyzed by SDS－PAGE，a specificity protein band was observed at 20ku.Using the deer serum positive of tuberculosis in Western blotting，the fusion protein could be combined with deer serum positive of tuberculosis antibody and arise specific immune response.The protein could be used as a specific antigen to test the deer tuberculosis.The study laid a foundation for further studying the deer tuberculosis appraisal method.

Key words：Mycobacteriumtuberculosis；MPB70gene；prokaryotic expression