盧夢瑤 劉書亮,胡凱弟 張艾青

(1. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014；2. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品加工與安全研究所，四川 雅安 625014；3. 山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院食品與藥品科技系，山東 濰坊 261061)

酵素中一株高產(chǎn)酸醋酸菌的鑒定及其產(chǎn)酸特性

盧夢瑤1劉書亮1,2胡凱弟2張艾青3

(1. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014；2. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品加工與安全研究所，四川 雅安 625014；3. 山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院食品與藥品科技系，山東 濰坊 261061)

以10種酵素樣品為菌源，經(jīng)分離純化、產(chǎn)酸定性和定量試驗(yàn)，獲得1株高產(chǎn)酸量醋酸菌LMY-1，對其形態(tài)學(xué)、生理生化指標(biāo)測定及16S rDNA鑒定，確定其為芝庇儂醋酸桿菌(Acetobactercibinongensis)；以蘋果、梨、黃瓜作為果蔬培養(yǎng)基，研究菌株LMY-1的產(chǎn)酸特性。結(jié)果表明，菌株LMY-1的最適產(chǎn)酸溫度為30 ℃；菌株LMY-1在乙醇含量為4 mL/100 mL時，產(chǎn)酸量最高(22.72 g/L)，比對照菌株CICC7015 (Acetobacterpasteurianussubsp.pasteurianus) (19.05 g/L)產(chǎn)酸量高；在底酸濃度為1～5 mL/100 mL時，菌株LMY-1和菌株CICC7015的產(chǎn)酸量隨發(fā)酵時間的變化趨勢均先減少后增加再減少；相同條件下，菌株LMY-1產(chǎn)酸速率優(yōu)于菌株CICC7015；兩菌株均產(chǎn)2種有機(jī)酸，分別是乙酸和草酸，且乙酸量遠(yuǎn)高于草酸量。菌株LMY-1更適宜于果蔬酵素的釀造。

酵素；醋酸菌；鑒定；產(chǎn)酸

酵素即指以一種或多種新鮮蔬菜、水果、菌菇、中草藥等作為原料，經(jīng)多種有益菌發(fā)酵，得到的具有豐富維生素、酶、礦物質(zhì)和次生代謝產(chǎn)物等營養(yǎng)成分的功能性發(fā)酵產(chǎn)品[1]。一般為高酸性或酸性食品，既能提高發(fā)酵底物自身的營養(yǎng)價值，也能作為食品添加劑和功能成分應(yīng)用于食品加工生產(chǎn)[2]。酵素有改善腸胃功能[3]、抗氧化[4]、消炎、抗菌、促進(jìn)細(xì)胞新生[5-6]、降血壓、降血脂[7-8]等功效。

有益菌的種類及其特性對酵素的發(fā)酵過程至關(guān)重要[9]。有益菌通過自身的中間代謝，使發(fā)酵基質(zhì)產(chǎn)生一系列復(fù)雜的生物化學(xué)變化，從而實(shí)現(xiàn)三大物質(zhì)(糖類、脂質(zhì)、蛋白質(zhì))之間的相互轉(zhuǎn)化，或?yàn)楫a(chǎn)生新的生理物質(zhì)(活性維生素和活性酶等)提供前體物質(zhì)[10]。

目前，已從酵素產(chǎn)品中分離出多種有益菌，如醋酸菌[11]、酵母菌[12-13]、乳酸菌[14]等，而對有益菌在酵素中的特性等的進(jìn)一步研究基本上都是針對酵母菌的：趙光遠(yuǎn)等[15]、江忠麗等[16]分別以紅棗、大米為主要原料，均研究了酵母菌的接種量、時間和溫度3個因素對相應(yīng)酵素飲料生產(chǎn)的影響。對在酵素中主導(dǎo)產(chǎn)酸的醋酸菌的相關(guān)報道卻很少，醋酸菌是酵素發(fā)酵過程中的一大類產(chǎn)酸細(xì)菌，清楚醋酸菌的種類及發(fā)酵特性有助于合理控制酵素發(fā)酵進(jìn)程，有效提高酵素的風(fēng)味品質(zhì)，因此研究酵素中醋酸菌及其產(chǎn)酸特性十分必要。

本試驗(yàn)旨在從酵素樣品中分離出具有高產(chǎn)酸能力的醋酸菌，研究其在果蔬培養(yǎng)基中的產(chǎn)酸特性，為酵素生產(chǎn)提供菌種資源和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌源

本試驗(yàn)選用了不同蔬菜、水果及中草藥等10種酵素樣品作為菌種來源，具體見表1，樣品1～4號來自四川省瀘州市古藺縣的某公司，5～10號來自四川省綿陽市的某公司。

表1 10種不同原料的酵素樣品?

? 樣品種類一列括號中的數(shù)據(jù)為質(zhì)量比。

1.2 菌種

植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum) P158：由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品微生物實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保藏；

巴氏醋桿菌巴氏亞種(Acetobacterpasteurianussubsp.pasteurianus) CICC7015：中國工業(yè)微生物菌種保藏中心。

1.3 培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基(用于醋酸菌的分離純化及保藏)：酵母膏10 g，葡萄糖10 g，水1 000 mL，自然pH，使用前加入無水乙醇3 mL/100 mL；其固體培養(yǎng)基添加CaCO32 g/100 mL，瓊脂粉2 g/100 mL，121 ℃滅菌20 min；

產(chǎn)酸培養(yǎng)基：同基礎(chǔ)培養(yǎng)基，但使用前改為加無水乙醇5 mL/100 mL，121 ℃滅菌20 min；

Hoyer-Frateur培養(yǎng)基：無水乙醇3 mL/100 mL，(NH4)SO40.1 g/100 mL， K2HPO40.1 g/100 mL，KH2PO40.01 g/100 mL， MgSO4·7H2O 0.025 g/100 mL，F(xiàn)eCl30.000 5 g/100 mL，121 ℃滅菌15 min；

生酮試驗(yàn)培養(yǎng)基：甘油3 mL/100 mL，酵母膏3 g/100 mL，瓊脂粉2 g/100 mL，121 ℃滅菌15 min；

產(chǎn)5-酮基葡萄糖酸鹽培養(yǎng)基：葡萄糖3 g/100 mL，碳酸鈣2 g/100 mL，酵母膏1 g/100 mL，瓊脂粉2 g/100 mL，121 ℃ 滅菌15 min；

硝酸鹽培養(yǎng)基：KNO30.02 g/100 mL，蛋白胨0.5 g/100 mL，pH 7.4，121 ℃滅菌15 min。

1.4 主要試劑

無水乙醇、FeCl3·6H2O、NaOH、酚酞：分析純，成都市科龍化工試劑廠；

鄰苯二甲酸氫鉀：分析純，成都金山化學(xué)試劑有限公司；

過氧化氫、鹽酸二甲基對苯二胺、甲萘胺：分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠；

對氨基苯磺酸、乙酸、α-萘酚：分析純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；

乙酸、乳酸、草酸、檸檬酸、酒石酸、丙酮酸、蘋果酸、琥珀酸：色譜純，Sigma-Aldrich(上海)貿(mào)易有限公司；

2×Premix TaqTM、DNA Marker DL2000、瓊脂糖：寶生物工程(大連)有限公司；

TIANamp Bacteria DNA Kit試劑盒：天根生化科技(北京)有限公司；

GoldviewTMDNA染料：上海賽百盛基因技術(shù)有限公司。

1.5 儀器

液相色譜儀：LC-2010C HT型，配可變波長紫外檢測器(UV)，LC-Solution工作站，日本Shimazu公司；

PCR儀：T100TMThermal Cycler型，美國Bio-Rad公司；

凝膠成像系統(tǒng)：Gel Doc XR型，美國Bio-Rad公司；

酸度計：PHS-4C+型，成都世紀(jì)方舟科技有限公司；

高速臺式冷凍離心機(jī)：TGL-16G型，上海菲恰爾分析儀器有限公司；

超純水系統(tǒng)：Milli-Q Gradient型，美國Millipore公司。

1.6 試驗(yàn)方法

1.6.1 高產(chǎn)酸醋酸菌的分離

(1) 醋酸菌的分離純化：分別取表1中不同種類的樣品10 g于液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，分裝100 mL/500 mL錐形瓶，振蕩培養(yǎng)48 h富集；梯度稀釋后涂布，30 ℃培養(yǎng)72 h；選出溶鈣圈明顯且菌落形態(tài)不同的優(yōu)勢菌落，多次劃線以純化；再以植物乳桿菌P158和醋酸菌CICC7015分別作為陽性和陰性對照菌株，進(jìn)行革蘭氏染色反應(yīng)并鏡檢，選出符合醋酸菌菌落特征的革蘭氏陰性菌株，-20 ℃甘油保藏。除特別說明，試驗(yàn)中振蕩培養(yǎng)的條件均為30 ℃、140 r/min。

(2) 菌種活化及種子液的制備：取上述保藏菌株劃線于基礎(chǔ)培養(yǎng)基斜面，30 ℃培養(yǎng)48 h；用5 mL無菌生理鹽水將斜面上的菌苔洗下，調(diào)整細(xì)胞濃度至108CFU/mL，作為種子液。

(3) 產(chǎn)酸定性試驗(yàn)：將種子液按10 mL/100 mL接種于產(chǎn)酸培養(yǎng)基，分裝30 mL/250 mL錐形瓶，振蕩培養(yǎng)72 h；取5 mL培養(yǎng)液離心(8 000 r/min，5 min)，以1.0 mol/L NaOH 溶液調(diào)pH至7.0，滴加5～6滴5 g/100 mL FeC13溶液并搖勻，觀察溶液是否變成黃褐色；再置于酒精燈火焰上加熱至沸騰，若形成紅褐色沉淀，即判定為產(chǎn)酸菌。

(4) 產(chǎn)酸定量試驗(yàn)：同上述1.6.1(3)步驟接種(無水乙醇調(diào)整為5%)并分裝，振蕩培養(yǎng)72 h后測定產(chǎn)酸量，確定產(chǎn)酸量高的菌株。向50 mL蒸餾水中加入2 mL發(fā)酵液，以3～5滴酚酞為指示劑，用標(biāo)定的0.1 mol/L NaOH溶液滴定溶液至呈淺粉色并記錄數(shù)據(jù)。按式(1)計算產(chǎn)酸量P(即凈增酸，以醋酸計)：

(1)

式中：

P——產(chǎn)酸量，g/L；

V——發(fā)酵液樣品滴定消耗的 NaOH 量，mL；

V0——以空白培養(yǎng)基為對照滴定消耗的 NaOH 量，mL；

CNaOH——NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，mol/L；

60——乙酸的相對分子質(zhì)量，g/mol；

V樣——樣品的取樣量，mL。

1.6.2 菌株鑒定

(1) 形態(tài)學(xué)指標(biāo)：將供試菌株于醋酸菌平板上劃線，于30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，觀察并記錄其菌落特征；挑取平板上的單菌落(30 ℃，48 h)進(jìn)行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察并記錄顏色、形狀、大小、排列等特征。

(2) 生理生化指標(biāo)：以菌株CICC7015作為對照，對菌株LMY-1進(jìn)行鑒定[17]。

(3) 16S rDNA的擴(kuò)增和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建：細(xì)菌基因組DNA的提?。禾羧」┰嚲陠尉溆?0 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)20 h，離心(10 000 r/min，1 min)收集菌體；按TIANamp Bacteria DNA Kit 試劑盒進(jìn)行提取。16S rDNA基因的PCR擴(kuò)增：以菌株基因組DNA為模板，選擇細(xì)菌通用引物(27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；1492R：5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3')擴(kuò)增16S rDNA基因。25 μL PCR反應(yīng)體系：模板DNA 1.0 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，2×Premix TaqTM(TaKaRa TaqTMVersion 2.0) 12.5 μL，超純水9.5 μL。同時進(jìn)行有模板DNA不加引物和有引物不加模板DNA的處理作為對照。設(shè)置PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，然后經(jīng)30個循環(huán)(94 ℃ 變性45 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s)，最后72 ℃ 延伸10 min，4 ℃保存。瓊脂糖凝膠電泳：PCR產(chǎn)物經(jīng)1% (1×TAE)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，觀察并成像。擴(kuò)增產(chǎn)物測序及分析：將PCR產(chǎn)物送成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測序，在Genbank上提交結(jié)果，BLAST進(jìn)行同源性比對，運(yùn)用MEGA5.2構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6.3 菌株的產(chǎn)酸特性

(1) 果蔬培養(yǎng)基的制備：取蘋果、梨、黃瓜3種材料洗凈去雜，榨取汁液，稱重后分別取等質(zhì)量汁液混合，加水稀釋至葡萄糖含量約為1 g/100 mL，經(jīng)115 ℃高壓滅菌20 min，作為發(fā)酵培養(yǎng)基，使用前添加3 mL /100 mL 無水乙醇。

(2) 接種、分裝：將目標(biāo)菌株種子液按10 mL /100 mL 的接種量接入果蔬培養(yǎng)基，除特別說明，按100 mL/300 mL分裝于錐形瓶。

(3) 菌株的適應(yīng)性：主要對溫度、乙醇濃度和底酸濃度3個因素對菌株在果蔬培養(yǎng)基中產(chǎn)酸量的影響進(jìn)行試驗(yàn)。① 菌株對不同溫度的適應(yīng)性：接種，分裝，分別于28，30，35，37，40 ℃，置于振蕩培養(yǎng)箱，140 r/min培養(yǎng)72 h，按1.6.1(4)測定產(chǎn)酸量。② 菌株對不同濃度乙醇的適應(yīng)性：接種，分裝，無水乙醇含量分別調(diào)整為1，2，3，4，5 mL /100 mL，置于振蕩培養(yǎng)箱，振蕩培養(yǎng)72 h，按1.6.1(4)測定產(chǎn)酸量。③ 菌株對不同濃度底酸的適應(yīng)性：接種，分裝，底酸(乙酸∶乳酸質(zhì)量比1∶1)總量分別為1，2，3，4，5 mL /100 mL，振蕩培養(yǎng)72 h，按1.6.1(4)測定產(chǎn)酸量。

菌株生長曲線的測定：接種，分裝，振蕩培養(yǎng)72 h，于600 nm 波長下測定OD值，前24 h每2 h測定一次，之后每4 h測定一次。

(4) 菌株的產(chǎn)酸特性：產(chǎn)酸曲線：接種，分裝，振蕩培養(yǎng)7 d，間隔24 h測定產(chǎn)酸量，以發(fā)酵時間、產(chǎn)酸量分別作為橫、縱坐標(biāo)繪制產(chǎn)酸曲線。產(chǎn)有機(jī)酸特性：接種，分裝，振蕩培養(yǎng)7 d后將發(fā)酵液離心(12 000 r/min，10 min)，取上清液通過0.45 μm水相濾膜，棄去初濾液，取續(xù)濾液供高效液相色譜(HPLC)檢測用[18-19]。按1 mL溶液中分別含2.5 mg草酸、25 mg乳酸、15 mg檸檬酸、30 mg乙酸、15 mg蘋果酸、15 mg 琥珀酸和25 mg酒石酸，配制有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液，分別取標(biāo)準(zhǔn)混合液10，20，50，75，100 μL，定容至1 mL，配制成不同濃度的混合標(biāo)液，HPLC分析獲得各有機(jī)酸的線性方程。色譜條件：色譜柱為Sepax HP-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相為體積比為5∶95的乙腈—0.05 mol/L KH2PO4溶液(磷酸調(diào)節(jié)pH至2.5)；流速0.6 mL/min；檢測波長210 nm；柱溫25 ℃；進(jìn)樣體積10 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)酸醋酸菌的分離

2.1.1 醋酸菌的分離純化 從10種不同原料的酵素樣品中稀釋分離與純化后獲得了10株優(yōu)勢菌，其中有革蘭氏陰性菌9株。

2.1.2 產(chǎn)醋酸定性試驗(yàn) 經(jīng)產(chǎn)酸定性試驗(yàn)，確定9株革蘭氏陰性菌中有5株菌可以產(chǎn)生明顯的紅褐色沉淀，判定為產(chǎn)醋酸菌株。

2.1.3 產(chǎn)酸定量試驗(yàn) 從不同原料自然發(fā)酵的酵素中分離純化得到5株產(chǎn)酸菌株，其產(chǎn)酸量分別為：(0.700±0.155)，(1.400±0.062)，(1.030±0.093)，(16.590±0.124)，(0.190±0.000) g/L。其中源于梨+秋葵酵素中的菌株編號為LMY-1，產(chǎn)酸量為(16.590±0.124) g/L，具有較高產(chǎn)酸能力，因此選擇該菌株作為后續(xù)試驗(yàn)的研究對象。

2.2 菌株鑒定

2.2.1 菌株LMY-1的形態(tài)學(xué)特征 菌株LMY-1在醋酸菌碳酸鈣平板上的菌落形態(tài)及鏡檢的個體形態(tài)(×1 000)見圖1。菌落呈米白色，較小，圓形、光滑、中間隆起、邊緣整齊；經(jīng)革蘭氏染色鏡檢觀察，其個體形態(tài)呈短桿狀、鏈狀排列，呈革蘭氏陰性。

2.2.2 菌株的生理生化特性 以菌株CICC7015作為對照，對菌株LMY-1進(jìn)行了生理生化指標(biāo)測定，由表2可知，菌株LMY-1和CICC7015均不能在Hoyer-Frateur培養(yǎng)基上生長，接觸酶陽性，氧化酶陰性。能利用正丙醇、正丁醇、D-葡萄糖產(chǎn)酸。均不能產(chǎn)5-酮基葡萄糖酸鹽和纖維素，但可以產(chǎn)醋酸和2-酮基葡萄糖酸鹽。

Table 2 Physiological and biochemical characteristics of two strains of acetic acid bacteria

指標(biāo)菌株LMY-1菌株CICC7015Hoyer-Frateur培養(yǎng)基上生長--接觸酶試驗(yàn)++甘油生酮+v產(chǎn)5-酮基葡萄糖酸鹽--產(chǎn)2-酮基葡萄糖酸鹽+v產(chǎn)2,5-二酮基葡萄糖酸鹽-+氧化酶試驗(yàn)--利用正丙醇產(chǎn)酸++產(chǎn)醋酸定性試驗(yàn)++硝酸鹽還原--在以麥芽糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長-v產(chǎn)纖維素--30%酵母抽提物上生長+v利用D-葡萄糖產(chǎn)酸++利用正丁醇產(chǎn)酸++

? “+”為陽性；“-”為陰性，“v”為多變的。

M. Marker 1. 有模板，無引物 2、3. 單側(cè)引物，無模板 4. LMY-1的PCR產(chǎn)物

圖2 菌株LMY-1的16S rDNA的PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖

Figure 2 Agarose gel electrophoresis of 16S rDNA gene PCR products of strain LMY-1

2.2.3 16S rDNA鑒定 由圖2可知，LMY-1菌株16S rDNA 的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測得的片段大小在1 500 bp左右，其在GenBank上的登錄號為KX214607。采用BLAST軟件在Genbank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行序列比對，并對菌株LMY-1構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(見圖3)，分析表明，菌株LMY-1的16S rDNA基因序列與登錄號為AB052710.1的Acetobactercibinongensis4H-1高度同源，相似度達(dá)99%，與其他芝庇儂醋酸桿菌亦具有相似的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系[20]。根據(jù)形態(tài)學(xué)、生理生化指標(biāo)及16S rDNA序列分析可判定菌株LMY-1為芝庇儂醋酸桿菌(Acetobactercibinongensis)。

圖3 菌株LMY-1的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 菌株LMY-1的產(chǎn)酸特性

2.3.1 菌株的適應(yīng)性

(1) 菌株對不同溫度的適應(yīng)性：由圖4可知，在28～40 ℃ 時，菌株CICC7015、LMY-1的產(chǎn)酸量均呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，并在30 ℃達(dá)到最高值，與Chen Yang等[21]對醋酸菌可耐受溫度的研究結(jié)果基本一致，菌株LMY-1的產(chǎn)酸量高于菌株CICC7015的產(chǎn)酸量，同時兩菌株的產(chǎn)酸量在28～40 ℃時波動較大，對溫度的適應(yīng)范圍窄。

(2) 菌株對不同乙醇濃度的適應(yīng)性：由圖5可知，隨著乙醇濃度的升高，菌株的產(chǎn)酸量均呈先增后減的趨勢。其中，菌株LMY-1對乙醇的耐受性較好，在乙醇含量4%時，產(chǎn)酸量最高(22.72 g/L)，其比對照菌株CICC7015(4%，19.05 g/L)產(chǎn)酸量大，且略優(yōu)于菌株CICC7015(3%，21.85 g/L)，可能與菌株本身氧化乙醇的性能有關(guān)；產(chǎn)酸量隨乙醇含量的進(jìn)一步增大逐漸降低，說明菌株的產(chǎn)酸性能受較高含量乙醇的抑制[22]。 (3) 菌株對不同濃度底酸的適應(yīng)性：為排除在同一總底酸濃度因素下，乙酸和乳酸質(zhì)量不同產(chǎn)生影響，因此試驗(yàn)保證二者質(zhì)量比為1∶1，底酸除選用乙酸外還選用了乳酸，原因是：① 酵素中存在乳酸發(fā)酵；② 底酸的促進(jìn)作用來源于醋酸根，而不是pH的降低，一定量的乙酸對醋酸菌的氧化產(chǎn)酸能力有促進(jìn)作用，而乳酸則抑制醋酸菌產(chǎn)酸[23]。如圖6所示，2株菌均能耐受5 mL/100 mL底酸；在底酸濃度為1 mL/100 mL時，產(chǎn)酸量最高，且菌株LMY-1的產(chǎn)酸量略高于菌株CICC7015。因此可解釋：底酸濃度為1～2 mL/100 mL時，菌株LMY-1的產(chǎn)酸量大幅度減少，可能是乙酸對醋酸菌氧化產(chǎn)酸能力的促進(jìn)作用小于乳酸對醋酸菌的抑制作用；底酸濃度為3～4 mL/100 mL時，產(chǎn)酸量略升高，可能是此時乙酸的促進(jìn)作用大于乳酸的抑制作用；在底酸濃度大于4 mL/100 mL時，因底酸濃度過高反饋抑制醋酸菌的產(chǎn)酸量[24]。兩菌株的產(chǎn)酸趨勢接近，說明兩種菌對底酸濃度的適應(yīng)性規(guī)律相似，此結(jié)果表明，在果蔬酵素生產(chǎn)時，可排除底酸濃度對選擇不同菌種的限制。

圖4 兩株醋酸菌對不同溫度的適應(yīng)性

圖5 兩株醋酸菌對不同乙醇濃度的適應(yīng)性

圖6 兩株醋酸菌對不同濃度底酸的適應(yīng)性

(4) 菌株的生長曲線：由圖7可知，菌株LMY-1的OD值在0～2 h基本不變，2～48 h快速上升，48～72 h基本不變，其對數(shù)生長期為2～48 h。菌株LMY-1比菌株CICC7015的生長速率和生長量均大，說明菌株LMY-1更適宜于該條件。

2.3.2 產(chǎn)酸特性

(1) 菌株的產(chǎn)酸曲線：由圖8可知，菌株LMY-1的產(chǎn)酸量在0～6 d迅速增加，6～10 d緩慢增加，10～13 d緩慢減少趨勢，13～14 d緩慢增加。對照菌株CICC7015在0～7 d迅速增加，7～12 d呈緩慢減少趨勢，12～14 d迅速減少。在0～7 d內(nèi)，菌株CICC7015產(chǎn)酸速率略優(yōu)于菌株LMY-1，但此后，菌株LMY-1產(chǎn)酸速率處于穩(wěn)中有升趨勢，而菌株CICC7015產(chǎn)酸速率開始不斷下降，表明菌株LMY-1的產(chǎn)酸速率及對環(huán)境的適應(yīng)性優(yōu)于菌株CICC7015。

圖7 兩株醋酸菌的生長曲線

圖8 兩株醋酸菌的產(chǎn)酸曲線

(2) 菌株產(chǎn)有機(jī)酸特性：由表3可知，7種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品能夠達(dá)到較好的分離效果，且其標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)均在0.999 0±0.003 0范圍內(nèi)，表明7種有機(jī)酸的峰面積和濃度有較好的線性相關(guān)性，此條件下可以確保菌株發(fā)酵液中有機(jī)酸檢測的可靠性。

菌株LMY-1被檢出產(chǎn)2種有機(jī)酸，即乙酸和草酸，其中產(chǎn)乙酸量最高。與空白相比，發(fā)酵液中的酒石酸、蘋果酸、檸檬酸含量均降低，可能是醋酸菌在醋酸發(fā)酵過程中利用消耗酒石酸、蘋果酸、檸檬酸較多，而產(chǎn)生和積累草酸[25]。與朱其瀚等[26]從鎮(zhèn)江恒順醋廠的醋醅中分離出1株巴氏醋桿菌能產(chǎn)生乳酸、乙酸、酒石酸3種有機(jī)酸不同，可能與培養(yǎng)基成分、醋酸菌種、發(fā)酵方法、生產(chǎn)工藝等因素有關(guān)[27]。

3 結(jié)論

本研究從多種酵素中分離出一株較高產(chǎn)醋酸菌株LMY-1，確定為芝庇儂醋酸桿菌(Acetobactercibinongensis)。B Haghshenas等[28]對從豆腐中分離出的芝庇儂醋酸桿菌進(jìn)行了益生菌評估，證實(shí)了其可以作為益生菌用于食品工業(yè)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，相同條件下，菌株LMY-1在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中產(chǎn)酸量(23.21 g/L)小于菌株CICC7015在其中的產(chǎn)酸量(25.96 g/L)，但是，在果蔬培養(yǎng)基中，菌株LMY-1的產(chǎn)酸量要高于菌株CICC7015的產(chǎn)酸量，因此，在同等條件下菌株LMY-1更適合于果蔬酵素的釀造。

表3 7種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線線性相關(guān)性及菌株發(fā)酵液中產(chǎn)有機(jī)酸的含量?

? “-*”表示發(fā)酵液減去空白值后對應(yīng)有機(jī)酸為負(fù)值；“-”表示未檢出。

目前，國內(nèi)外關(guān)于芝庇儂醋酸桿菌的專門報道甚少，僅見針對分離出的醋酸菌進(jìn)行多相分類學(xué)研究[29]的同時，提到了芝庇儂醋酸桿菌的生化特性[30-31]。菌株LMY-1在模擬酵素中的產(chǎn)酸特性研究，為其實(shí)際應(yīng)用提供了數(shù)據(jù)參考。

本試驗(yàn)僅對溫度、乙醇濃度和底酸濃度3個因素進(jìn)行了研究，具有一定局限性，進(jìn)一步可對醋酸菌的接種量、模擬酵素基質(zhì)成分等其他因素進(jìn)行試驗(yàn)。

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Identification of a strain of high yieldacetic acid bacteria from ferment and its acid-producing characteristics

LU Meng-yao1LIUShu-liang1,2HUKai-di2ZHANGAi-qing3

(1.CollegeofFoodScience,SichuanAgriculturalUniversity,Ya’an,Sichuan625014,China; 2.ResearchInstituteofFoodProcessingandSecurity,SichuanAgriculturalUniversity,Ya’an,Sichuan625014,China; 3.DepartmentofFoodandDrugScienceandTechnology,ShandongVocationalAnimalScienceandVeterinaryCollege,Weifang,Shandong261061,China)

A strain of high yield acetic acid bacteria LMY-1 was isolated from 10 kinds of ferment samples by isolation and purification, the acid qualitative and quantitative screen for producing. The strain was identified asAcetobactercibinongensisby analysis of morphology, physiological and biochemical indicators and identification of 16S rDNA. The growth and acid-producing characteristics of strain LMY-1 was studied by fruit and vegetable culture medium with apple, pear and cucumber. Results, the optimum acid temperature for strain LMY-1 was 30 ℃； In 4 mL/100 mL ethanol content, strain LMY-1 produced the highest acid amount (22.72 g/L), higher than strain CICC7015(Acetobacterpasteurianussubsp.pasteurianus)(19.05 g/L); When the bottom acid concentration of 1～5 mL/100 mL, the acid-producing amount of strain LMY-1 and strain CICC7015 decreased first, then increased and decreased again with the change of fermentation time; In the same condition, the acid-producing rate of strain LMY-1 was better than that of strain CICC7015; Both strains produce 2 kinds of organic acid, which included acetic acid and oxalic acid, and acetic acid content was much higher than oxalic acid. Strain LMY-1 is suitable for fruit and vegetable ferment production.

ferment; acetic acid bacteria; identification; acid production

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.12.014

四川省農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項目(編號：14NZ0012)

盧夢瑤，女，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)在讀本科生。

劉書亮(1968-)，男，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)教授，博士。 E-mail: lsliang999@163.com

2016—09—26