束婧婷，章　明，宋　遲，單艷菊，徐文娟，宋衛(wèi)濤，李慧芳

(江蘇省家禽科學(xué)研究所，揚(yáng)州 225125)

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基于表達(dá)譜芯片挖掘清遠(yuǎn)麻雞和科寶肉雞比目魚肌差異表達(dá)基因

束婧婷#，章明#，宋遲，單艷菊，徐文娟，宋衛(wèi)濤，李慧芳*

(江蘇省家禽科學(xué)研究所，揚(yáng)州 225125)

摘要：對(duì)生長速度長期的高壓選擇導(dǎo)致了快大型肉雞與優(yōu)質(zhì)型地方雞顯著的表型差異，本研究旨在研究這種表型差異的分子遺傳機(jī)理。采用Agilent雞全基因組表達(dá)譜芯片對(duì)達(dá)到性成熟的優(yōu)質(zhì)型清遠(yuǎn)麻雞(112 d)和快大型科寶肉雞(42 d)比目魚肌中與肌纖維發(fā)育和類型組成相關(guān)的候選基因及信號(hào)通路進(jìn)行系統(tǒng)篩查。結(jié)果，芯片分析共篩選到差異倍數(shù)在2倍及以上的基因1 318個(gè)，以科寶肉雞作為參照，清遠(yuǎn)麻雞中上調(diào)基因501個(gè)，下調(diào)基因817個(gè)，主要涉及到肌肉發(fā)育、能量代謝、脂質(zhì)代謝等生物學(xué)過程?；贙EGG Pathway分析發(fā)現(xiàn)，差異基因除了參與肌纖維發(fā)育和分化相關(guān)信號(hào)通路(如Hedgehog信號(hào)通路和Ca2+信號(hào)通路)外，Wnt信號(hào)通路，mTOR信號(hào)通路，MAPK信號(hào)通路，ErbB信號(hào)通路、JAK-STAT信號(hào)通路等一些跟能量代謝相關(guān)的信號(hào)通路也被富集為顯著的信號(hào)通路。與能量代謝相關(guān)的信號(hào)通路和與肌肉發(fā)育相關(guān)的信號(hào)通路相互作用形成一個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)從而影響肌纖維的發(fā)育，篩選出了20個(gè)在肌纖維生長發(fā)育及分化過程中可能具有重要影響的候選基因，但這些差異表達(dá)基因在肌纖維的發(fā)育和分化過程中的作用尚待深入研究。

關(guān)鍵詞：肌纖維性狀；表達(dá)譜芯片；差異表達(dá)基因；清遠(yuǎn)麻雞；科寶肉雞

隨著人們生活水平的不斷提高和消費(fèi)觀念的轉(zhuǎn)變，肉品質(zhì)愈來愈受到人們的重視。我國是一個(gè)禽類品種資源十分豐富的國家，各地方雞種多以肉質(zhì)鮮美而著稱，尤其是廣東的清遠(yuǎn)麻雞，素以皮色金黃、肉質(zhì)嫩滑、皮脆爽、骨軟、風(fēng)味獨(dú)特而馳名于粵港澳市場(chǎng)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，相較于快大型雞而言，清遠(yuǎn)麻雞肌肉具有較高的紅肌纖維比例和肌纖維密度以及較細(xì)的肌纖維直徑[1]；而科寶肉雞是全球著名的快大型肉雞品種之一，具有生長速度快、飼料轉(zhuǎn)化率高、屠宰率高等優(yōu)點(diǎn)，但肉質(zhì)風(fēng)味則較差。因此，這兩個(gè)品種是研究雞肌肉生長發(fā)育及肉品質(zhì)遺傳機(jī)理的理想動(dòng)物模型。

肌肉是雞胴體中最主要的組成部分，而肌纖維則是構(gòu)成肌肉組織的基本單位，根據(jù)外觀、收縮特性和代謝特征可將肌纖維分成慢肌纖維(Ⅰ型和Ⅱa型，色紅，進(jìn)行有氧代謝)和快肌纖維(Ⅱb型，色白，進(jìn)行酵解代謝)[2]。不同部位的肌肉，其肌纖維組成和比例往往不同。如雞的比目魚肌主要由慢肌纖維組成，而趾長伸肌則主要由快肌纖維組成。研究表明，肌纖維類型是直接影響肌肉生長發(fā)育和肉品質(zhì)的重要因素[3-4]。慢肌纖維多的肌肉品質(zhì)相對(duì)較好，色紅、纖維細(xì)、風(fēng)味好，而快肌纖維多的肌肉肉色蒼白、肉質(zhì)較粗糙[5-6]。肌纖維的生長發(fā)育及類型的形成是受多基因影響和調(diào)控的復(fù)雜過程，在雞中，對(duì)于影響和調(diào)控這一復(fù)雜過程的分子機(jī)制還缺乏系統(tǒng)的研究。

基因芯片技術(shù)能夠同時(shí)檢測(cè)出某個(gè)特定組織中的大量差異表達(dá)基因，目前已被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究等領(lǐng)域[7-8]。T.Wu等利用芯片技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，金華豬背最長肌中脂肪酸合成和抑制肌肉生成相關(guān)基因的上調(diào)表達(dá)可能是解釋該品種肌肉中IMF含量較高的原因[8]。Y.Li等研究發(fā)現(xiàn)，梅山豬背最長肌中的差異表達(dá)基因主要集中在TGF-α，MAPK，Wnt，mTOR和insulin等信號(hào)通路[9]。然而，目前在全基因組水平上比較不同品種雞肌肉中基因表達(dá)譜差異的報(bào)道較少，僅Q.Zheng等采用Affymetrix芯片對(duì)蛋雞和肉雞不同發(fā)育時(shí)期胸肌進(jìn)行差異表達(dá)基因的篩選，發(fā)現(xiàn)了調(diào)控肌肉生長速度的一些關(guān)鍵基因[10]。本試驗(yàn)采用Agilent雞全基因組表達(dá)譜芯片(4×44K，Design ID：026441)對(duì)肉質(zhì)優(yōu)良的地方雞種-清遠(yuǎn)麻雞(Qingyuan partridge chickens，QP)和快大型的科寶肉雞(Cobb，CB)比目魚肌中的差異表達(dá)基因和信號(hào)通路進(jìn)行研究，探討兩品種間肌肉組織表達(dá)譜的差異及其可能的分子生物學(xué)內(nèi)在聯(lián)系與規(guī)律，以期為進(jìn)一步研究調(diào)控肌纖維生長發(fā)育及肌纖維類型的分子機(jī)制提供理論依據(jù)，為優(yōu)質(zhì)雞肉質(zhì)性狀的標(biāo)記輔助選擇和育種奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物

清遠(yuǎn)麻雞和科寶肉雞種蛋分別來自于廣東天農(nóng)食品有限公司清遠(yuǎn)麻雞原種場(chǎng)和廣東佛山新廣農(nóng)牧有限公司科寶肉雞保種群。種蛋孵化后，在同樣的環(huán)境和飼養(yǎng)條件下進(jìn)行飼養(yǎng)，全程自由采食和飲水。飼養(yǎng)至每品種性成熟日齡(清遠(yuǎn)麻雞，112 d，平均體重1 330 g；科寶肉雞，42 d，平均體重2 825 g)時(shí)分別選取體重相近的10只母雞進(jìn)行采樣，每只雞采集兩側(cè)比目魚肌，其中右側(cè)比目魚肌中間1 cm×1 cm部分用于肌纖維性狀的測(cè)定，左側(cè)相同部位樣品用于RNA抽提，所有樣品均置于液氮速凍，然后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，隨機(jī)選擇3個(gè)個(gè)體用于芯片分析。

1.2肌纖維性狀測(cè)定

在恒溫冷凍切片機(jī)內(nèi)進(jìn)行冰凍切片的制作，每個(gè)樣品在腓腸肌外側(cè)頭中間處垂直于肌纖維延展方向做10張連續(xù)橫切切片，切片厚度12 μm。采用ATPase堿孵育法進(jìn)行肌纖維類型、肌纖維密度、肌纖維直徑和面積的判定，在經(jīng)典的Guth-Samaha法[11]基礎(chǔ)上改良后進(jìn)行染色，全部試劑均新鮮配制。

1.3RNA提取、質(zhì)量檢測(cè)及純化

采用mirVanaTMRNA提取試劑盒 (Applied Biosystem p/n AM1556)提取總RNA，用Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent)對(duì)總RNA進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，合格后使用QIAGEN RNeasy?Mini Kit(QIAGEN)和RNsae-Free DNase Set (QIAGEN)純化總RNA。

1.4基因芯片雜交

基因表達(dá)譜芯片采用Agilent公司的雞全基因組4×44K芯片(Design ID：026441)，探針數(shù)量為43 803。芯片雜交及數(shù)據(jù)處理由上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司完成。采用Low Input Quick Amp Labeling Kit，One-Color試劑盒(Agilent)對(duì)總RNA進(jìn)行放大和標(biāo)記；總RNA經(jīng)第一鏈和第二鏈合成得到cRNA，Cyanine-3-CTP(Cy3)標(biāo)記cRNA鏈后，用QIAGEN RNeasy Mini kit(QIAGEN)純化標(biāo)記后的cRNA；芯片雜交采用Agilent表達(dá)譜芯片配套試劑盒；采用Agilent Microarray Scanner進(jìn)行掃描，分辨率為5 μm，掃描儀自動(dòng)以100%和10% PMT各掃描1次，以Agilent自動(dòng)合并2次結(jié)果作為最終結(jié)果；用Feature Extraction Software (version10.7.1.1，Agilent Technologies)讀取數(shù)據(jù)；用Genespring Software (version 12.5；Agilent Technologies)進(jìn)行歸一化處理，算法為Quantile。所有操作均按試劑盒說明和Agilent表達(dá)譜芯片試驗(yàn)操作和分析手冊(cè)進(jìn)行。

1.5芯片數(shù)據(jù)生物信息分析

1.5.1差異表達(dá)基因的篩選利用Genespring Software 12.5對(duì)清遠(yuǎn)麻雞和科寶肉雞比目魚肌標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選，保留所有標(biāo)志都為P(Present探針點(diǎn)有信號(hào)，且信號(hào)值可信)的探針，去除含有M(Marginal探針信號(hào)飽和或信號(hào)值可疑)和A(Absent探針點(diǎn)無信號(hào))的探針；去除內(nèi)部質(zhì)控探針。差異基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)為：以科寶肉雞為對(duì)照，差異倍數(shù)在2倍及以上且P<0.05的基因。

1.5.2差異基因Gene Ontology功能注釋基于Gene Ontology數(shù)據(jù)庫(http：// www.geneontology.org/)，采用Molecule Annotation System (MAS 3.0，http：//bioinfo.capitalbio.com/mas3/)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO分類分析，得到基因參與的所有GO，利用Fisher精確檢驗(yàn)和卡方檢驗(yàn)計(jì)算每個(gè)GO的顯著性水平，從而篩選出差異基因所體現(xiàn)的顯著性GO，顯著性篩選的標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05。

1.5.3差異基因Pathway分析基于KEGG數(shù)據(jù)庫(http：//www.genome.jp/kegg/)，利用Fisher精確檢驗(yàn)和卡方檢驗(yàn)對(duì)差異基因參與的Pathway進(jìn)行顯著性分析，按照P<0.05進(jìn)行篩選，得到顯著的Pathway。

1.6熒光定量PCR

為驗(yàn)證芯片的結(jié)果，本研究選擇了11個(gè)差異表達(dá)基因，根據(jù)GenBank中的基因序列設(shè)計(jì)引物(引物序列見表1)。以清遠(yuǎn)麻雞和科寶肉雞比目魚肌總RNA為模板，采用SYBR Green I法進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，以β-actin基因作為內(nèi)參基因進(jìn)行數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化處理，反應(yīng)體系：2×SYBR Green Realtime PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各0.4 μL (10 μmol·L-1)，cDNA 模板1 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，加ddH2O 7.8 μL補(bǔ)足20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 60 s，共40 個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增后經(jīng)熔解曲線檢測(cè)特異性。每次反應(yīng)均設(shè)空白樣品為陰性對(duì)照，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。相對(duì)定量的結(jié)果采用2-△△Ct法進(jìn)行計(jì)算。采用Pearson’s相關(guān)檢驗(yàn)對(duì)基因芯片和qRT-PCR 兩種方法的結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析。

2結(jié)果

2.1清遠(yuǎn)麻雞和科寶肉雞比目魚肌肌纖維性狀比較

采用ATPase染色方法對(duì)兩個(gè)品種雞比目魚肌的肌纖維橫截面積、直徑、密度、紅肌纖維比例和白肌纖維比例等指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如表2和圖1所示。兩品種雞比目魚肌在肌纖維橫截面積、直徑和密度上均表現(xiàn)出顯著差異，科寶肉雞的肌纖維橫截面積和直徑顯著高于清遠(yuǎn)麻雞(P<0.05)，而肌纖維密度則顯著低于清遠(yuǎn)麻雞(P<0.05)。清遠(yuǎn)麻雞的紅肌纖維比例同樣要高于科寶肉雞，但差異不顯著(P>0.05)。研究結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了兩個(gè)品種在肉品質(zhì)上存在差異。

表1熒光定量PCR引物

Table 1Primer sequences used for Q-PCR

表2兩個(gè)品種雞比目魚肌肌纖維性狀比較

Table 2Myofiber characteristics of the SOL muscles in the 2 chicken breeds

NS.P>0.05；*.P<0.05

2.2兩個(gè)品種比目魚肌中的差異表達(dá)基因

采用Agilent雞全基因組表達(dá)譜芯片比較優(yōu)質(zhì)型的清遠(yuǎn)麻雞和快大型的科寶肉雞比目魚肌基因表達(dá)譜差異，共發(fā)現(xiàn)差異倍數(shù)在2倍及以上的基因1 318個(gè)(P<0.05，F(xiàn)C≥2)，以科寶肉雞作為參照，清遠(yuǎn)麻雞中上調(diào)基因501個(gè)，下調(diào)基因817個(gè)。

較細(xì)的纖維直徑和較高的紅肌纖維比例可能是導(dǎo)致清遠(yuǎn)麻雞肉質(zhì)優(yōu)良的關(guān)鍵因素，因此為了闡明基因表達(dá)模式差異與不同表型之間的關(guān)系，基于NCBI的OMIM數(shù)據(jù)庫以及已發(fā)表的文獻(xiàn)報(bào)道，找到了一些與肌纖維發(fā)育及類型組成相關(guān)的重要基因，詳見表3。與科寶肉雞相比，清遠(yuǎn)麻雞比目魚肌中PPARGC1B、PPARD、PRKAG1、HSPB1、MAPK6、GDF3、STAT5B以及PRKAG3基因的表達(dá)是上調(diào)的，而MYH1E、MYH1B、WNT11、IGF1、MYOG、MYO1A、PRKAR2B、FGF7、WNT2B、SCD5、FASN及WNT5A等基因的表達(dá)是下調(diào)的。

2.3差異表達(dá)基因的GO功能分類分析

采用MAS3.0軟件對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO(GO ontology)功能分類，如圖2所示。在生物學(xué)過程方面，共發(fā)現(xiàn)167個(gè)顯著性GO，主要涉及到細(xì)胞過程、生理過程、生物學(xué)調(diào)控、生物學(xué)過程的調(diào)節(jié)、多細(xì)胞生物過程、發(fā)育學(xué)過程、應(yīng)激反應(yīng)、免疫系統(tǒng)加工過程、生物學(xué)過程的正調(diào)控和負(fù)調(diào)控等。

2.4差異表達(dá)基因的信號(hào)通路分析

對(duì)差異表達(dá)基因通過KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行信號(hào)通路分析，富集檢測(cè)的P<0.05的與肌纖維發(fā)育及類型組成相關(guān)的信號(hào)通路總共有18條，包括MAPK信號(hào)通路，涉及的基因有EGFR、HSPB1和FGF7；鈣離子信號(hào)通路(Calcium signaling pathway)，涉及的基因有PDGFRA、PDGFRB、PLCB1、NOS1和SLC8A3；Wnt信號(hào)通路，涉及的基因有SFRP2、WNT9A、WNT2B、FZD2、WNT8B、PPARD、LEF1、WNT11、WNT5A和VANGL2；Hedgehog信號(hào)通路，涉及的基因有BMP4、BMP5和PTCH1；TGF-beta信號(hào)通路，涉及的基因有BMP4、BMP5、SMAD1、FST和THBS4；ErbB信號(hào)通路，涉及的基因有PIK3R1、PIK3R3和STAT5B；Jak-STAT信號(hào)通路，涉及的基因有PIK3R1、PIK3R3和SPRED1；mTOR信號(hào)通路，涉及的基因有IGF1、PIK3R1、PIK3R3和PRKAA2；不飽和脂肪酸合成信號(hào)通路，涉及的基因有SCD5、FADS1和TECR；脂肪酸合成通路，涉及的基因?yàn)镕ASN；以及Notch信號(hào)通路，涉及基因?yàn)镹OTCH2等。每個(gè)信號(hào)通路均只包含幾個(gè)發(fā)生表達(dá)變化的基因，而每個(gè)表達(dá)變化的基因通常不局限于一個(gè)通路。

2.5差異表達(dá)基因的熒光定量PCR驗(yàn)證

為了驗(yàn)證基因芯片所篩選的差異表達(dá)基因，隨機(jī)選取了11個(gè)基因，其中上調(diào)基因3個(gè)(PRKAG3、STAT5B和BMP4)，下調(diào)基因8個(gè)(MYH1E、EGFR、ADIPOQ、PIK3R3、FASN、NOTCH2、SCD5和WNT5A)，以β-actin為參照基因，采用熒光定量PCR的方法進(jìn)行了驗(yàn)證。盡管芯片和熒光定量PCR兩種方法所得到的差異倍數(shù)有所不同，但所選基因的表達(dá)趨勢(shì)是一致的，通過相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，兩種方法所得的結(jié)果具有正相關(guān)關(guān)系，Pearson相關(guān)系數(shù)為0.33～0.93(圖3)，結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了芯片結(jié)果的可靠性。

表3清遠(yuǎn)麻雞與科寶肉雞中篩選到的一些與肌纖維發(fā)育及類型組成相關(guān)的基因

Table 3List of representative genes related to myofiber characteristics in soleus muscle in Qingyuan Partridge chickens and Cobb broilers

3討論

骨骼肌是由異源特異性的肌纖維組成，不同類型的肌纖維在形態(tài)、數(shù)目、收縮和代謝特性等方面差異較大，因而由不同類型的肌纖維組成的肌肉之間也存在較大差異，而肌纖維的類型組成與肌肉品質(zhì)(肉色、嫩度、風(fēng)味、多汁性)密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，清遠(yuǎn)麻雞比目魚肌的肌纖維密度顯著高于科寶肉雞，而肌纖維橫截面積和直徑卻顯著低于科寶肉雞，這一結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了E.Dransfield等的結(jié)果[12]，即禽類在出生后生長發(fā)育過程中，肌纖維數(shù)目多則生長緩慢，反之，肌纖維數(shù)目少則生長快速，同時(shí)也與肌纖維大小與肉品質(zhì)呈負(fù)相關(guān)的觀點(diǎn)相符[13]。清遠(yuǎn)麻雞比目魚肌中的紅肌纖維比例要高于科寶肉雞同樣證實(shí)了G.Renand等[14]的觀點(diǎn)，即紅肌纖維比例高的肌肉品質(zhì)較好。為了進(jìn)一步揭示優(yōu)質(zhì)型的清遠(yuǎn)麻雞和快大型的科寶肉雞在肌纖維性狀上差異的機(jī)理，本研究采用Agilent雞全基因組表達(dá)譜芯片首次探討了兩個(gè)品種雞比目魚肌在轉(zhuǎn)錄組水平上的差異，以期尋找與肌纖維發(fā)育及類型組成相關(guān)的基因。盡管熒光定量PCR與芯片兩種方法得出的基因差異倍數(shù)并不完全相同，但兩種方法下的基因表達(dá)趨勢(shì)是高度一致的，表明本研究芯片分析得出的結(jié)果是可信的。

成年動(dòng)物肌纖維組成及其收縮蛋白結(jié)構(gòu)和功能的多樣性在很大程度上由神經(jīng)活動(dòng)支配，因此，與肌肉發(fā)育、脂肪代謝、能量代謝和神經(jīng)活動(dòng)相關(guān)的基因均可能會(huì)影響肌纖維的發(fā)育和分化。本研究GO功能分類結(jié)果表明，參與到細(xì)胞過程、生理過程、生物學(xué)調(diào)控以及能量代謝等過程的基因在兩品種中的表達(dá)具有顯著差異，說明不同肌纖維類型具有不同的能量代謝調(diào)控特征，與A.Vidal-Puig等[15]報(bào)道結(jié)果一致。能量利用率對(duì)成熟肌纖維的形成以及肌纖維的增殖分化是至關(guān)重要的，M.Louis等[16]發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)的肌衛(wèi)星細(xì)胞中能值水平直接影響肌纖維的肥大，M.Cagnazzo等[17]也發(fā)現(xiàn)成肌細(xì)胞分化和能量代謝密切相關(guān)。

肌纖維發(fā)育和類型組成受到多條信號(hào)通路和諸多因子的調(diào)節(jié)，本研究共發(fā)現(xiàn)18條與之相關(guān)的代謝通路，其中包括一些已知的在肌纖維發(fā)育與分化中具有重要作用的信號(hào)通路，如Hedgehog信號(hào)通路和Ca2+信號(hào)通路[18]。根據(jù)基因功能及其所在的信號(hào)通路，我們確定了20個(gè)影響肌纖維生長發(fā)育及分化的候選基因，其中包括7個(gè)已知的與肌纖維發(fā)育與類型組成相關(guān)的基因(PPARGC1B、PPARD、MYH1E、MYH1B、MYOG和MYO1A)。PPARD(Peroxisome proliferator-activated receptor delta)在多種組織如脂肪組織、骨骼肌和心中對(duì)脂質(zhì)、脂蛋白和葡萄糖代謝調(diào)控起著關(guān)鍵作用[19]；PPARGC1B(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma，coactivator 1 beta)是一種轉(zhuǎn)錄協(xié)同激活因子，也是細(xì)胞能量代謝和能量平衡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，可促進(jìn)骨骼肌中線粒體的產(chǎn)生，并誘導(dǎo)氧化型肌纖維的形成[20]；上述兩個(gè)基因在本研究清遠(yuǎn)麻雞的比目魚肌中均高表達(dá)，也進(jìn)一步驗(yàn)證了Z.Arany等[20]的研究結(jié)果，即在促進(jìn)氧化型肌纖維形成中發(fā)揮作用。MyoG基因主要在肌纖維分化末期表達(dá)，在肌細(xì)胞的早期分化過程中處于中心位置，本研究發(fā)現(xiàn)，該基因在科寶肉雞中的表達(dá)量要高于清遠(yuǎn)麻雞，可能也與品種特性有關(guān)。MYH1E、MYH1B和MYO1A與肌球蛋白的生物合成有關(guān)，不同類型的肌纖維特異性地表達(dá)各自特殊類型的肌球蛋白重鏈(MYH)，而MYH1即為快肌纖維特異性表達(dá)基因，故本研究MYH1E和MYH1B基因均在白肌纖維比例較高的科寶肉雞中高表達(dá)。

本研究中，Wnt信號(hào)通路、mTOR信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、ErbB信號(hào)通路、JAK-STAT信號(hào)通路以及一些跟能量代謝相關(guān)的信號(hào)通路也被富集為顯著的信號(hào)通路，表明與能量代謝相關(guān)的信號(hào)通路和與肌肉發(fā)育相關(guān)的信號(hào)通路互作形成一個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)從而影響肌纖維的發(fā)育。在20個(gè)關(guān)鍵基因中有3個(gè)(PRKAG1、PRKAG3和PRKAR2B)是與能量代謝密切相關(guān)的。PRKAG1和PRKAG3分別是編碼一磷酸腺苷激活蛋白激酶(A heterotrimeric serine/threonine protein kinase，AMPK) γ1和γ3亞基的基因，PRKAG1在各種組織中廣泛表達(dá)，而PRKAG3則只在骨骼肌中特異性地表達(dá)。本研究中，PRKAG1和PRKAG3均在清遠(yuǎn)麻雞比目魚肌中高表達(dá)，可能是因?yàn)榧せ畹腁MPK復(fù)合物通過磷酸化作用抑制了糖原合成酶活性，降低了糖原的合成速率從而導(dǎo)致肌肉中糖原含量的下降。但PRKAG3在比目魚肌中的高表達(dá)與M.Mahlapuu等[21]在人、大鼠和小鼠中的研究結(jié)果相悖，他們發(fā)現(xiàn)，PRKAG3主要在快速酵解型的白肌中表達(dá)，而在慢速氧化型的紅肌中表達(dá)量較低。PRKAR2B是編碼AMPKβ2亞基的基因，其在清遠(yuǎn)麻雞比目魚肌中的表達(dá)量要低于科寶肉雞，結(jié)果與AMPKβ亞基中存在一個(gè)糖原結(jié)合位點(diǎn)從而抑制了AMPK的激活[22]這一事實(shí)相符。因此，值得擴(kuò)大群體規(guī)模進(jìn)一步研究這些基因表達(dá)與肌纖維類型之間的關(guān)系。

硬脂酰輔酶A去飽和酶5(Stearoyl-CoA desaturase5，SCD5)和脂肪酸合成酶(Fatty acid synthase，F(xiàn)ASN)兩個(gè)基因是脂肪酸合成關(guān)鍵酶基因，在科寶肉雞比目魚肌中具有較高的表達(dá)水平。SCD是催化包括棕櫚酰CoA、硬脂酰CoA在內(nèi)的飽和脂肪酸產(chǎn)生單不飽和脂肪酸合成的關(guān)鍵酶，對(duì)肌肉間脂肪沉積有著重要影響。本研究發(fā)現(xiàn)，一些能夠抑制成肌細(xì)胞分化的生長因子如FGF7和GDF3，以及能夠促進(jìn)成肌細(xì)胞分化和肥大的誘導(dǎo)因子如IGF-I在兩品種雞的比目魚肌中同樣表現(xiàn)出較大的表達(dá)差異。Wnt信號(hào)通路是一條保守的信號(hào)通路，廣泛存在于各種動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)。Wnt家族是一個(gè)非常龐大的多基因家族，主要參與細(xì)胞的增殖與分化過程。本研究發(fā)現(xiàn)Wnt家族的Wnt11，Wnt5a，Wnt9a，Wnt2b和Wnt8b均表現(xiàn)為差異表達(dá)基因，不同的Wnt配體因其活性的差異可以激活不同的信號(hào)通路從而調(diào)控骨骼肌細(xì)胞增殖、分化、凋亡和遷移。K.Anakwe等[18]研究發(fā)現(xiàn)，不同的Wnt基因都可以不同程度的改變肌纖維總量和快慢肌纖維的組成，Wnt11能促使快肌纖維增多，這也與本研究該基因在科寶肉雞中的表達(dá)水平較高的結(jié)果一致。因此，將這些基因作為影響不同肌纖維類型的代謝特征和收縮特性轉(zhuǎn)錄調(diào)控的新候選基因進(jìn)行深入的研究具有一定的意義。

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(編輯郭云雁)

Identification of Differentially Expressed Genes for Myofiber Characteristics in Soleus Muscles between Qingyuan Partridge Chickens and Cobb Broilers

SHU Jing-ting#，ZHANG Ming#，SONG Chi，SHAN Yan-ju，XU Wen-juan，SONG Wei-tao，LI Hui-fang*

(JiangsuInstituteofPoultryScience，Yangzhou225125，China)

Key words:myofiber characteristics；microarray；differentially expressed gene；Qingyuan Partridge chicken；Cobb broiler

Abstract:In the modern chicken industry，fast-growing broilers have undergone strong artificial selection for muscle growth，which has led to remarkable phenotypic variations compared with slow-growing chickens.The present study was designed to explore the molecular mechanism underlying these phenotypes differences.Agilent cDNA microarray analyses were conducted to determine gene expression profiles of soleus muscle sampled at sexual maturity age of Qingyuan Partridge chickens (QY，112 d，a slow-growing Chinese breed with high meat quality) and Cobb broilers (CB，42 d，a commercial fast-growing broiler line).A systematic identification of candidate genes and new pathways related to myofiber development and composition in soleus muscles between the 2 breeds were analyzed.1 318 genes with at least 2-fold differences were identified in soleus muscles of QY and CB chickens.When slow-growing QY chickens were compared with fast-growing CB chickens，the expression of 501 genes were up-regulated，and 817 genes were down-regulated.These genes mainly were related to muscle development，energy metabolism or lipid metabolism processes.In addition，based on KEGG pathway analysis，it was found that in addition to pathways affecting myofiber development and differentiation (pathways for Hedgehog & Calcium signaling)，energy metabolism signaling pathways (Wnt signaling pathway，mTOR signaling pathway，MAPK signaling pathway，ErbB signaling pathway and JAK-STAT signaling pathway) were also enriched.Our data indicates that energy and muscle metabolism pathways might form a network，which influence the development of myofibers，20 genes were potentially related to myofiber development and composition.However，large scale analyses are still required to validate the role of the genes identified and ultimately to find molecular markers that can be used for selection or to optimize rearing practices.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.01.004

收稿日期：2015-01-22

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(31301967)；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金(CARS-42-G03)；江蘇省自然科學(xué)基金(BK2012268)；江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項(xiàng)目(cx(15)1009)

作者簡(jiǎn)介：束婧婷(1980-)，女，江蘇宿遷人，博士，副研究員，主要從事家禽遺傳育種研究，Tel：0514-85599018，E-mail：shujingting@163.com；章明(1978-)，男，江蘇姜堰人，碩士，副研究員，主要從事家禽遺傳育種研究，E-mail：6259513@qq.com。二人共為第一作者 *通信作者：李慧芳，研究員，E-mail：lhfxf_002@aliyun.com

中圖分類號(hào)：S813.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào):0366-6964(2016)01-0025-09