董　振，王權(quán)威，劉　振，孫紅梅，李春義

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，特種動(dòng)物分子生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春 130112)

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梅花鹿致敏與休眠鹿茸干細(xì)胞差異蛋白表達(dá)的2D-DIGE分析

董振，王權(quán)威，劉振，孫紅梅，李春義*

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，特種動(dòng)物分子生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春 130112)

摘要：旨在對(duì)梅花鹿(Cervusnippon)致敏鹿茸干細(xì)胞與休眠鹿茸干細(xì)胞表達(dá)蛋白進(jìn)行差異篩選、鑒定及生物信息分析，為深入探討鹿茸獨(dú)特的再生分子調(diào)節(jié)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。本研究采用雙向熒光差異凝膠電泳(Two-dimensional fluorescence difference in gel electrophoresis，2D-DIGE)分離蛋白樣品；利用DeCyder 7.2 分析軟件對(duì)2D-DIGE圖像進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析尋找差異表達(dá)蛋白；利用MALDI-TOF-MS (Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight tandem mass spectrometry)鑒定差異蛋白，通過(guò)Mascot 軟件搜索NCBInr 數(shù)據(jù)庫(kù)尋找匹配的蛋白；采用PANTHER (Protein Analysis Through Evolutionary Relationships) 軟件對(duì)差異蛋白進(jìn)行聚類分析，REACTOME數(shù)據(jù)庫(kù)分析差異蛋白所參與的信號(hào)通路。結(jié)果得到了致敏鹿茸干細(xì)胞與休眠鹿茸干細(xì)胞2D-DIGE圖譜，致敏鹿茸干細(xì)胞與休眠鹿茸干細(xì)胞蛋白豐度相比較，比值≥1.1倍以及比值≤-1.1倍(P<0.05)的差異蛋白點(diǎn)有159個(gè)，其中110個(gè)上調(diào)表達(dá)，49個(gè)下調(diào)表達(dá)，EDA(Extended data analysis)分析得到了多個(gè)Marker蛋白，質(zhì)譜鑒定了84 個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，48個(gè)為陽(yáng)性結(jié)果，共來(lái)自27 種蛋白質(zhì)。并對(duì)已鑒定蛋白進(jìn)行了GO分析以及信號(hào)通路富集分析。致敏鹿茸干細(xì)胞與休眠鹿茸干細(xì)胞蛋白差異明顯，質(zhì)譜鑒定獲得了來(lái)自多種可能與鹿茸再生相關(guān)的差異蛋白。由此可知，鹿茸再生是鹿茸干細(xì)胞從休眠到致敏的轉(zhuǎn)化過(guò)程，需要多種蛋白分子以及信號(hào)通路的綜合調(diào)控。

關(guān)鍵詞：鹿茸干細(xì)胞；再生；蛋白質(zhì)組學(xué)；2D-DIGE

近年來(lái)，再生生物學(xué)尤其是割處再生 (Epimorphic regeneration) 是生命科學(xué)研究的重點(diǎn)領(lǐng)域，鹿茸是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的唯一一個(gè)可以割處完全再生的哺乳動(dòng)物附屬器官。以鹿茸為模型深入研究其獨(dú)特再生分子調(diào)節(jié)機(jī)制對(duì)于揭開(kāi)哺乳動(dòng)物器官再生之謎具有重要意義[1]。鹿茸是以年為周期而再生的[2-3]，春天鹿角從角柄脫落隨即引發(fā)新一輪鹿茸再生；夏天，由茸皮覆蓋的新生鹿茸迅速生長(zhǎng)；進(jìn)入秋天，成熟的鹿茸便會(huì)快速骨化并伴隨茸皮脫落；到了冬天，骨化的鹿角會(huì)與角柄緊密相連從而等待新一輪鹿茸再生過(guò)程。在再生周期中，鹿茸可在短短幾個(gè)月內(nèi)完成生長(zhǎng)發(fā)育[4]，這一過(guò)程需要強(qiáng)大的血管營(yíng)養(yǎng)供給系統(tǒng)才能輔助完成[5-6]。鹿茸具有遠(yuǎn)超癌細(xì)胞分裂速度的生長(zhǎng)速度，但并不發(fā)生癌變[7-8]。鹿茸再生組織學(xué)研究表明，其周期性再生是來(lái)源于角柄骨膜中的細(xì)胞，這些細(xì)胞具有胚胎干細(xì)胞的特性，因此被稱為鹿茸干細(xì)胞[2]。角柄高度具有種的特異性，如梅花鹿在5 cm左右[9]。C.Li等[10]發(fā)現(xiàn)，角柄骨膜根據(jù)與皮膚接觸的緊密程度有一個(gè)比較明顯的分界，即遠(yuǎn)心端大約1/3部分骨膜與所包裹的皮膚是緊密接觸的；而近心端大約2/3部分骨膜與包裹皮膚連接疏松。C.Li等[11]進(jìn)一步利用插膜試驗(yàn)表明，僅遠(yuǎn)心端角柄骨膜組織在與包裹皮膚相隔后仍具有再生鹿茸能力，而近心端插膜后則失去此能力。由此C.Li等將近心端骨膜與皮膚非緊密接觸部分培養(yǎng)得到的細(xì)胞稱為休眠鹿茸干細(xì)胞，相應(yīng)的遠(yuǎn)心端骨膜與皮膚緊密接觸部分培養(yǎng)所得到的細(xì)胞稱為致敏鹿茸干細(xì)胞[2]。

在鹿茸蛋白質(zhì)組學(xué)方面，H.J.Park等[12]通過(guò)雙向電泳對(duì)赤鹿茸尖與血漿組織進(jìn)行差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)兩者相近度高達(dá)43%，結(jié)果顯示，鹿茸組織中含有一個(gè)發(fā)達(dá)的血管系統(tǒng)供給鹿茸快速生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)需求[13]，并且鹿茸中含有多種代謝酶及基因表達(dá)調(diào)控蛋白等。但這僅是針對(duì)鹿茸的蛋白質(zhì)組學(xué)研究，而C.Li等[14]利用雙向電泳分別對(duì)鹿生茸區(qū)骨膜、角柄骨膜以及面部骨膜3種骨膜細(xì)胞蛋白質(zhì)組進(jìn)行比較，結(jié)果表明，生茸區(qū)骨膜細(xì)胞與角柄骨膜細(xì)胞中都鑒定到了大量差異蛋白，同時(shí)發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt，ERK/MAPK，p38 MAPK等細(xì)胞信號(hào)通路在致敏鹿茸干細(xì)胞增殖時(shí)起關(guān)鍵作用，并在鹿茸干細(xì)胞中找到了胚胎干細(xì)胞的特異性標(biāo)記物SOX2，NANOG和MYC等，從而推測(cè)鹿茸干細(xì)胞可能是一種介于成體干細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞間的兼性干細(xì)胞。

目前對(duì)于與鹿茸再生關(guān)系密切的致敏鹿茸干細(xì)胞與休眠鹿茸干細(xì)胞的蛋白質(zhì)組差異研究無(wú)人涉及。本試驗(yàn)采用雙向熒光差異凝膠電泳(Two-dimensional fluorescene difference in gel electrophoresis，2D-DIGE)與MALDI-TOF-MS(Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry)對(duì)致敏鹿茸干細(xì)胞與休眠鹿茸干細(xì)胞進(jìn)行差異蛋白質(zhì)組研究，以期獲得一些與鹿茸再生相關(guān)的差異表達(dá)蛋白，為最終發(fā)現(xiàn)刺激鹿茸再生的分子奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1供試材料

試驗(yàn)于2014年4月在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所實(shí)驗(yàn)鹿場(chǎng)進(jìn)行，對(duì)1頭屠宰后的梅花鹿(Cervusnippon)采集了角柄骨膜。利用冰盒將骨膜帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，鹿茸干細(xì)胞取材與培養(yǎng)方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[14]，將培養(yǎng)后收獲的細(xì)胞于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2蛋白質(zhì)樣品的準(zhǔn)備

細(xì)胞培養(yǎng)瓶中將培養(yǎng)好的致敏鹿茸干細(xì)胞與休眠鹿茸干細(xì)胞棄去培養(yǎng)液，用山梨醇(Sigma-Aldrich公司)細(xì)胞清洗液清洗2次后收集細(xì)胞。再用山梨醇細(xì)胞清洗液懸浮洗滌細(xì)胞3次，每次懸浮后1 000 r·min-1離心5 min，并再次加入山梨醇細(xì)胞清洗液，最后1次加入500 μL自制裂解液(7 mol·L-1尿素，2 mol·L-1硫脲，4% CHAPS和1% 蛋白酶抑制劑)。之后將得到的兩種細(xì)胞混合液中分別加入等量直徑為0.5 mm的不銹鋼珠并利用Bullet Blender 細(xì)胞組織破碎儀對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破碎，之后，將其放在冰盒中震蕩4 h左右，隨后12 000 r·min-1離心5 min，上清便為提取得到的蛋白。用Bradford法對(duì)蛋白樣品進(jìn)行濃度測(cè)定，并將含有蛋白的上清液100 μL·管-1分裝后于-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.32D-DIGE

2D-DIGE具體操作參照丁新倫等的方法[15]，與其操作不同的地方：利用Bio-Rad公司的2D Cleanup試劑盒按照說(shuō)明書(shū)將蛋白樣品進(jìn)行純化處理。采用GE 公司的CyDyeTMDIGE Fluor，minimal labeling kit對(duì)致敏鹿茸干細(xì)胞與休眠鹿茸干細(xì)胞蛋白樣品進(jìn)行熒光標(biāo)記，Cy3 和Cy5 分別用于標(biāo)記致敏鹿茸干細(xì)胞與休眠鹿茸干細(xì)胞蛋白，Cy2 標(biāo)記兩種細(xì)胞等量混合后的蛋白作為內(nèi)標(biāo)。第一向等電聚焦程序：S1 stp 250 V 1 h；S2 stp 500 V 1.5 h；S3 grd 1 000 V 1 h；S4 grd 4 000 V 7 000 Vh；S5 grd 8 000 V 6 750 Vh；S6 stp 8 000 V 35 000 Vh，整個(gè)聚焦過(guò)程總電壓為56 kVh。第二向SDS-PAGE：將平衡好的膠條與12.5% SDS-PAGE 凝膠緊密結(jié)合并用封膠液進(jìn)行封膠，將膠板置于GE ETTAN DALTsix 電泳系統(tǒng)，第二向電泳的程序：S1 2 W·gel-130 min；S2 17 W·gel-1，直至溴酚藍(lán)跑到底，約4.5 h。

1.4掃描與圖像分析

利用Typhoon FLA 9500(GE公司)獲得2D-DIGE 的蛋白表達(dá)圖像，分析軟件為DeCyder 2D 7.2(GE)。整個(gè)分析使用DeCyder DIA(Difference in-gel analysis)、DeCyder BVA (Biological variation analysis)和DeCyder EDA(Extended data analysis)軟件模塊完成。每一匹配點(diǎn)的統(tǒng)計(jì)分析均采用Student’st檢驗(yàn)比較致敏鹿茸干細(xì)胞與休眠鹿茸干細(xì)胞蛋白豐度的均值和標(biāo)準(zhǔn)差。并通過(guò)EDA模塊進(jìn)行Marker Selection分析，即使用偏最小二乘搜索(Partial Least Squares Search)與最鄰近分類法(K-Nearest Neighbors)來(lái)鑒定兩組樣品中重要的差異蛋白。并取每組蛋白樣品500 μg，混合后按與2D-DIGE試驗(yàn)相同的電泳參數(shù)進(jìn)行雙向電泳，之后進(jìn)行SYPRO RUBY染色，并切取在2D-DIGE膠中豐度具有顯著性改變(比值≥1.1倍以及≤-1.1倍，P<0.05)以及EDA模塊分析得到的重要蛋白質(zhì)點(diǎn)用于質(zhì)譜分析。

1.5差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的酶解和MALDI-TOF-MS質(zhì)譜鑒定

委托北京蛋白質(zhì)組研究中心進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。參照曹曉艷等的方法[16]，質(zhì)譜檢測(cè)儀器為ABI 4800 Proteomics Analyzer MALDI-TOF/TOF。MALDI-TOF 質(zhì)譜分析獲得肽指紋圖譜(Peptide mass fingerprint)數(shù)據(jù)以及MS-MS 數(shù)據(jù)，用MASCOT 軟件搜索 NCBInr 數(shù)據(jù)庫(kù)。檢索條件：胰酶解，允許最大的未被酶切位點(diǎn)數(shù)為1，物種來(lái)源分別為人、野牛與牛，沒(méi)有固定修飾，可變修飾 Oxidation (M)，maximum peptide rank設(shè)為10，片段離子質(zhì)量容差為0.3D。MASCOT檢索蛋白質(zhì)得分(P<0.05)：野牛>57分；牛>61分；人>61分。

1.6差異蛋白的生物信息分析

采用PANTHER[17](http：//www.pantherdb.org/，SRI International，Menlo Park，California，USA)對(duì)差異蛋白進(jìn)行聚類分析，其主要根據(jù)蛋白分子功能、生物過(guò)程以及蛋白類別進(jìn)行分類。由DAVID[18-19](http：//david.abcc.ncifcrf.gov/home.hsp)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)已鑒定蛋白所參與的信號(hào)通路進(jìn)行富集分析。

2結(jié)果

2.1致敏鹿茸干細(xì)胞與休眠鹿茸干細(xì)胞蛋白表達(dá)差異分析

對(duì)Typhoon掃描的致敏鹿茸干細(xì)胞與休眠鹿茸干細(xì)胞蛋白標(biāo)記的2D-DIGE圖譜進(jìn)行多通道疊加(圖1)。DeCyder 7.2 軟件分析每張膠平均得到約2 858 個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)(膠1：2 832個(gè)；膠2：2 805個(gè)；膠3：2 937個(gè))，各組間凝膠上蛋白點(diǎn)分布模式較為一致。共選出有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(比值≥1.1以及≤-1.1倍，P<0.05)的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)159 個(gè)(圖 2)，其中，致敏鹿茸干細(xì)胞/休眠鹿茸干細(xì)胞蛋白表達(dá)豐度升高的點(diǎn)有110 個(gè)，表達(dá)豐度下降的點(diǎn)有49 個(gè)。圖3顯示了部分蛋白質(zhì)點(diǎn)上調(diào)和下調(diào)蛋白的曲線圖和三維圖。通過(guò)EDA模塊Marker Selection分析得到所研究的兩種細(xì)胞中重要的Marker蛋白，這些是后續(xù)質(zhì)譜分析與功能驗(yàn)證的重點(diǎn)蛋白。

2.2差異表達(dá)蛋白MALDI-TOF-MS 鑒定

綜合DeCyder軟件BVA與EDA分析結(jié)果，從后續(xù)制備SYPRO RUBY蛋白膠中挖取84 個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索成功鑒定出48 個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，分屬27 種蛋白，有多個(gè)點(diǎn)經(jīng)鑒定為同種蛋白，其中，12 個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)表達(dá)上調(diào)，15 個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)表達(dá)下調(diào)。表1概括了質(zhì)譜鑒定差異蛋白點(diǎn)的相關(guān)信息。

2.3差異蛋白的生物信息學(xué)分析

從生物學(xué)過(guò)程、分子功能及蛋白分類3 方面進(jìn)行PANTHER 功能分析(圖4)。圖中顯示，已鑒定的差異蛋白涉及多個(gè)生物學(xué)過(guò)程，包含生物起源、細(xì)胞代謝、定位、生殖、生物調(diào)節(jié)、刺激反應(yīng)、發(fā)育過(guò)程、生物附著和免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)等；在分子功能上分屬7 類，包括核苷酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、連接酶活性、受體活性、酶調(diào)節(jié)活性、結(jié)構(gòu)分子活性、催化活性和載體活性；在蛋白分類上，差異蛋白來(lái)自多種類別，主要有轉(zhuǎn)移/載體蛋白、細(xì)胞骨架蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白、受體蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、核酸結(jié)合蛋白、轉(zhuǎn)錄因子以及水解酶類等。DAVID中REACTOME 通路分析結(jié)果如圖5所示。

表1通過(guò)2D-DIGE得到的經(jīng)質(zhì)譜鑒定的差異表達(dá)蛋白

Table 1Differentially expressed proteins identified by mass spectrometry(MS) after 2D-DIGE analysis

3討論

梅花鹿致敏鹿茸干細(xì)胞與休眠鹿茸干細(xì)胞差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)采用改進(jìn)于傳統(tǒng)雙向電泳的熒光差異凝膠電泳技術(shù)對(duì)鹿茸干細(xì)胞進(jìn)行研究。2D-DIGE技術(shù)因其靈敏度高，重復(fù)性好以及統(tǒng)計(jì)學(xué)可信度高等特點(diǎn)已成為與iTraq(Isobaric tag for relative and absolute quantitation)和SILAC(Stable isotope labeling with amino acids in cell culture) 同被使用的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)。

3.1質(zhì)譜鑒定中部分多點(diǎn)重復(fù)蛋白與鹿茸再生的關(guān)系

POTE可編碼包含3個(gè)結(jié)構(gòu)域的腫瘤睪丸抗原，并因主要在前列腺、卵巢、睪丸及胎盤(pán)中表達(dá)而得名。T.K.Bera研究發(fā)現(xiàn)[20]，POTE蛋白在人胚胎干細(xì)胞系中表達(dá)，尤其是POTE-2會(huì)顯著表達(dá)[21]。而本試驗(yàn)中POTE (spot1430、spot641和spot398) 在休眠鹿茸干細(xì)胞中高表達(dá)，可能預(yù)示著休眠鹿茸干細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞相似，這與C.Li等[2]研究結(jié)果一致。而研究報(bào)道[20-21]該蛋白是靈長(zhǎng)類動(dòng)物特異表達(dá)蛋白，本試驗(yàn)在梅花鹿中找到了該蛋白，這表明其并不是靈長(zhǎng)類特異表達(dá)的蛋白。

質(zhì)譜數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，致敏鹿茸干細(xì)胞中有多個(gè)SAE1 (SUMO-activating enzyme subunit 1)(spot2433和spot1891等)蛋白高度表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)，Myc驅(qū)使的腫瘤生成依賴于SAE蛋白與SUMOylation修飾[22-23]，從而維持腫瘤發(fā)生的特征[24]。C.Li等[14]證明，在角柄骨膜細(xì)胞中存在Myc，其具有調(diào)控細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖、腫瘤生成、細(xì)胞分化以及細(xì)胞凋亡等多重作用[22，25]，但Myc的具體生物學(xué)功能是由相應(yīng)細(xì)胞微環(huán)境中參與的細(xì)胞因子所涉及的調(diào)控機(jī)制決定的[25]。由此可知，SAE1可能作為Myc的一類調(diào)控因子從而使Myc具有促使細(xì)胞快速增殖的作用，具體過(guò)程表現(xiàn)為當(dāng)Myc因突變等而超極化后便會(huì)使細(xì)胞進(jìn)行不可控的增殖甚至是腫瘤生成[24]。而SAE1不存在時(shí)，Myc驅(qū)使的細(xì)胞便會(huì)死亡。在Myc含量較高，SAE1較少時(shí)，Myc表達(dá)的細(xì)胞有更長(zhǎng)的無(wú)轉(zhuǎn)移存活率；但是SAE1較多時(shí)，Myc表達(dá)的細(xì)胞會(huì)癌變。結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果，休眠鹿茸干細(xì)胞中SAE1相對(duì)含量較低，則表現(xiàn)為該細(xì)胞相對(duì)更穩(wěn)定；而致敏鹿茸干細(xì)胞中SAE1較多，則Myc被激活，使得該細(xì)胞具有高度分化的特性與快速分裂增殖能力。生命體是一個(gè)平衡體，當(dāng)抑癌作用高于致癌作用時(shí)，細(xì)胞便不會(huì)癌變，反之生命體便會(huì)失調(diào)致癌[24]；而鹿茸干細(xì)胞可能同樣如此，即存在抑癌調(diào)控體系，又存在致癌快速增殖體系如SAE-Myc，也許正是這些過(guò)程間的相互作用與相互制約從而使鹿茸組織既能快速生長(zhǎng)又不癌化，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

3.2生物信息學(xué)分析已鑒定的差異蛋白與鹿茸再生的關(guān)系

DAVID 信號(hào)通路富集分析表明差異蛋白主要參與止血通路與糖尿病通路。在鹿茸鋸茸過(guò)程中，其截?cái)嗝鏁?huì)因過(guò)大壓力而噴出血柱，如果不能快速止血，鹿將會(huì)因失血過(guò)多衰竭而死，但實(shí)際情況表明止血過(guò)程很快，所以鑒定到的蛋白可能在角柄骨膜中高度表達(dá)從而促使快速止血。而V.Stéger 研究發(fā)現(xiàn)，鹿茸骨組織中的糖含量要高于正常骨組織的5倍以上[26]，在正常組織中應(yīng)表現(xiàn)為糖尿病癥狀，但對(duì)于鹿茸而言其需要大量的能量消耗來(lái)滿足自身的快速生長(zhǎng)，所以應(yīng)該有一套完善的機(jī)制對(duì)高血糖進(jìn)行消耗與利用從而促進(jìn)鹿茸再生。

糖尿病通路所富集的蛋白中，ALDOB(Aldolase B)參與糖代謝，并涉及糖酵解與糖異生過(guò)程[27]。ALDOB蛋白還是一種胞內(nèi)胰島素結(jié)合蛋白[28]，其與胰島素結(jié)合的復(fù)合體涉及細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控，細(xì)胞分化以及蛋白質(zhì)代謝等功能。所以在致敏鹿茸干細(xì)胞中ALDOB(spot295) 高表達(dá)可協(xié)助胰島素利用細(xì)胞內(nèi)的糖類為細(xì)胞大量增殖與分化供能。另外，ALDOB也參與Wnt通路[29]的正調(diào)控。在動(dòng)物發(fā)育最早期，Wnt通路會(huì)對(duì)某些組織的損傷進(jìn)行修復(fù)并修正促進(jìn)再生的相關(guān)位置信息[30]。Wnt通路也涉及鹿茸再生過(guò)程，主要針對(duì)骨再生過(guò)程中的成骨細(xì)胞[31]。所以ALDOB可能既通過(guò)直接或間接作用參與致敏鹿茸干細(xì)胞內(nèi)的糖代謝作用，也可調(diào)控其Wnt通路，從而促進(jìn)鹿茸再生。

GRP78 (Glucose-regulated peptide 78) 是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中高度表達(dá)的分子伴侶，其能夠促使蛋白正確折疊并降解錯(cuò)誤折疊蛋白從而提高細(xì)胞存活率[32-33]。UPR (Unfolded protein response) 是一個(gè)當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)聚集的未折疊蛋白超過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)折疊能力后(即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激)所激活的高度保守的信號(hào)通路反應(yīng)。GRP78是UPR信號(hào)出現(xiàn)后抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的主要調(diào)控者。GRP78主要由insulin/IGF-1通路調(diào)控來(lái)影響細(xì)胞增殖與存活，是其下游調(diào)控靶點(diǎn)[34]。最近研究表明，PI3K/AKT通路與GRP78蛋白互作以利于GRP78調(diào)控腫瘤生長(zhǎng)以及阻止細(xì)胞凋亡，在腫瘤環(huán)境下，GRP78既可作為PI3K/AKT通路的下游靶點(diǎn)，又可作為其上游調(diào)控者。所以致敏鹿茸干細(xì)胞中GRP78(spot524) 含量較高，可能是鹿茸再生過(guò)程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白合成活動(dòng)比較激烈，細(xì)胞分泌比較旺盛且細(xì)胞增殖速率較快從而需要大量GPR78進(jìn)行調(diào)控導(dǎo)致的。

ITPR1 (Inositol 1，4，5-trisphosphate receptor type 1) 是一個(gè)在受三磷酸肌醇(IP3)刺激后從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中調(diào)控鈣離子釋放的細(xì)胞內(nèi)通道，通過(guò)激活鈣調(diào)蛋白，細(xì)胞內(nèi)鈣離子便會(huì)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中釋放從而引發(fā)細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致下游細(xì)胞凋亡通路的活化[35]。由此可知，ITPR1 (spot323) 在休眠鹿茸干細(xì)胞中高表達(dá)可能起監(jiān)控作用，即確保細(xì)胞正確合成調(diào)節(jié)型分泌途徑的蛋白并誘導(dǎo)癌變細(xì)胞凋亡。ITPR1參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的調(diào)控可能與GRP78的作用有一定的聯(lián)系，其在鹿茸干細(xì)胞中的具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

3.32D-DIGE圖譜EDA判定的Marker與鹿茸再生的關(guān)系

DeCyder軟件EDA模塊可對(duì)2D-DIGE圖譜進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析從而做Marker判定，其結(jié)果相對(duì)可信。本試驗(yàn)鑒定到的陽(yáng)性蛋白中有4個(gè)重要蛋白排行在EDA所判定的Marker前30位，按照Marker判定排序具體如下。

3.3.1三角形四肽重復(fù)蛋白36(Tetratricopeptide repeat protein 36，HBP21)本試驗(yàn)鑒定得到的HBP21(spot1243)是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的包含肽重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域(Tetratricopeptide repeat TPR)的蛋白，并能夠與Hsp70羧基端互作。HBP21幾乎在所有的惡性組織中表達(dá)，并在有腫瘤轉(zhuǎn)移的組織中高表達(dá)。HBP21可通過(guò)抑制Hsp70參與對(duì)腫瘤細(xì)胞惡化與轉(zhuǎn)移的抑制。與HBP21類似，HspBP1在細(xì)胞中大量廣泛表達(dá)，并與Hsp70親合力高且能抑制Hsp70的活性[36]。HeLa細(xì)胞中抗癌藥物(長(zhǎng)春新堿、紫杉醇以及依托泊苷)在不影響Hsp70表達(dá)的同時(shí)誘導(dǎo)HspBP1在腫瘤細(xì)胞上調(diào)2.0～2.5倍，之后HspBP1特異性結(jié)合并拮抗Hsp70，因此HspBP1使腫瘤細(xì)胞更容易在組織蛋白酶調(diào)控下凋亡。

致敏鹿茸干細(xì)胞中HBP21高表達(dá)，推測(cè)其可由角柄中活性分子的激活，而拮抗Hsp70活性從而抑制細(xì)胞癌化，并促使癌化細(xì)胞凋亡。

3.3.2組蛋白 H4 (Histone H4)組蛋白折疊微區(qū)有多種翻譯后修飾，如乙?；痆37]與磷酸化[38]等。不同修飾態(tài)組蛋白能為不同染色體調(diào)控因子提供結(jié)合位點(diǎn)[39]。蠑螈晶狀體是通過(guò)色素上皮細(xì)胞(Pigmented epithelial cells，PECs)轉(zhuǎn)分化再生的，而去分化的PECs有類胚胎干細(xì)胞特性[40]。其中乙?；疕istone H4的增加是蠑螈PECs去分化過(guò)程中染色質(zhì)調(diào)控的重要特征。

在胚胎發(fā)育中細(xì)胞內(nèi)端粒會(huì)在快速增殖過(guò)程內(nèi)持續(xù)縮短直到極短而激活DNA損傷通路，并最終限制細(xì)胞增殖能力。而端粒長(zhǎng)度在斑馬魚(yú)鰭重復(fù)截?cái)嘣偕^(guò)程[41-42]中維持不變甚至延長(zhǎng)，這可解釋相關(guān)細(xì)胞所具有的高增殖分化能力。所以端粒長(zhǎng)度維持及組織再生能力間存在直接關(guān)系。Histone H4等組蛋白表達(dá)量降低可引發(fā)由DNA損傷[43]導(dǎo)致的端粒功能異常。而乙?；疕istone H4的顯著減少也會(huì)限制端粒功能。說(shuō)明組蛋白尤其是Histone H4表達(dá)量與修飾狀態(tài)可調(diào)控端粒功能。

本試驗(yàn)中，與致敏鹿茸干細(xì)胞相比休眠鹿茸干細(xì)胞中Histone H4(spot1360)的含量更高，說(shuō)明該細(xì)胞可能與胚胎干細(xì)胞相近并可能存在較大再生潛力。而致敏鹿茸干細(xì)胞中Histone H4下調(diào)，細(xì)胞大量增殖分化導(dǎo)致端?？s短。

3.3.3ATP合成酶beta亞基 (ATP synthase subunit beta，ATP5B)ATP合成酶在線粒體中涉及氧化能量代謝并對(duì)細(xì)胞功能的發(fā)揮起重要作用[44]。ATP5B是催化真核細(xì)胞ATP合成過(guò)程的限速步驟[45]。

由本試驗(yàn)結(jié)果可知，ATP5B(spot1331)在致敏鹿茸干細(xì)胞中高表達(dá)，即致敏鹿茸干細(xì)胞需進(jìn)行更多的氧化能量代謝以支撐其快速增殖與分化等；但休眠鹿茸干細(xì)胞相對(duì)穩(wěn)定，不需過(guò)多能量消耗。

3.3.4波形蛋白(Vimentin)本試驗(yàn)中得到的波形蛋白 (spot1133) 是主要存在于間充質(zhì)細(xì)胞中的第3類中間纖維[46]，是細(xì)胞骨架以及核被膜的主要成分。在成體組織中波形蛋白[47]是唯一能夠在不同細(xì)胞類型中表達(dá)的中間纖維。在組織培養(yǎng)中，波形蛋白缺乏的成纖維細(xì)胞有異常的actin細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)。另外，波形蛋白缺乏的成纖維細(xì)胞機(jī)械穩(wěn)定性、運(yùn)動(dòng)性以及定向遷移能力會(huì)減弱[48]。在(去)分化、胚胎發(fā)育及腫瘤形成過(guò)程中，波形蛋白均起到重要作用。其在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT，epithelial-mesenchymal transition)過(guò)程中被快速誘導(dǎo)表達(dá)。EMT在胚胎發(fā)育和傷口愈合等生理過(guò)程以及癌癥侵襲、轉(zhuǎn)移等病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用，而波形蛋白在EMT中起關(guān)鍵作用[49-50]。

與體外培養(yǎng)的牙髓總細(xì)胞相比，在CD105陽(yáng)性牙髓干細(xì)胞中波形蛋白的mRNA與蛋白均高表達(dá)。因此盡管波形蛋白不是牙髓特異性表達(dá)的，但它可作為牙髓再生的質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。體外培養(yǎng)的CD105陽(yáng)性牙髓干細(xì)胞中敲除波形蛋白基因后細(xì)胞遷移活動(dòng)會(huì)明顯降低，表明波形蛋白在再生牙髓組織中表達(dá)可促使牙髓干細(xì)胞的遷移從而促進(jìn)再生[51]。

由上可知，在鹿茸再生過(guò)程中，致敏鹿茸干細(xì)胞中波形蛋白高表達(dá)表明其具有更好的遷移性從而能較快的進(jìn)行增殖與分化；而休眠鹿茸干細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性較差，穩(wěn)定性較高。且波形蛋白可能對(duì)兩種細(xì)胞actin的差異表達(dá)有一定影響。

3.4本研究蛋白鑒定結(jié)果的不足

本試驗(yàn)中，部分差異點(diǎn)由于凝膠點(diǎn)較淡，蛋白表達(dá)量過(guò)少或?qū)嶋H蛋白質(zhì)與理論推斷的蛋白質(zhì)分子量和等電點(diǎn)不符等因素導(dǎo)致未被質(zhì)譜鑒定出來(lái)。與此同時(shí)，由于目前沒(méi)有梅花鹿的全基因組，導(dǎo)致缺乏特異數(shù)據(jù)庫(kù)，從而只能選擇物種相近數(shù)據(jù)庫(kù)，這便使得數(shù)據(jù)庫(kù)針對(duì)性較差，不能獲得更準(zhǔn)確的結(jié)果并出現(xiàn)假陰性，最終質(zhì)譜陽(yáng)性鑒定率下降。而所得數(shù)據(jù)中，actin、POTEE以及keratin等蛋白出現(xiàn)了多點(diǎn)重復(fù)鑒定，在蛋白圖譜中這些蛋白點(diǎn)分離清晰、相距不遠(yuǎn)、具有不同的等電點(diǎn)，可能是其發(fā)生了磷酸化、甲基化或乙?；刃揎棥?/p>

綜上表明，鹿茸再生是一個(gè)鹿茸干細(xì)胞從休眠到致敏的轉(zhuǎn)化過(guò)程，這個(gè)過(guò)程需要多種蛋白分子參與以及信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)的綜合調(diào)控。

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(編輯郭云雁)

Analysis of Differentially Expressed Proteins in the Potentiated and Dormant Antler Stem Cells through 2D-DIGE

DONG Zhen，WANG Quan-wei，LIU Zhen，SUN Hong-mei，LI Chun-yi*

(StateKeyLaboratoryforMolecularBiologyofSpecialAnimals，InstituteofSpecialAnimalandPlantSciences，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Changchun130112，China)

Key words:antler stem cell；regeneration；proteomics；2D-DIGE

Abstract:The objective of this study was to screen，identify and analyze the differentially expressed proteins in the potentiated and dormant antler stem cells in sika deer (Cervusnippon)，and then to shed lights on the molecular mechanisms underlying antler regeneration.The two-dimensional fluorescence of gel electrophoresis (2D-DIGE) was used to separate the protein spots；Differentially expressed protein spots were selected by DeCyder 2D (version 7.2)；Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight tandem mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) was carried out to obtain peptide mass fingerprinting，Mascot software was used to search the matched proteins in the NCBInr database；PANTHER (Protein Analysis Through Evolutionary Relationships) and REACTOME analysis were performed to further explore the involved signal pathways about these identified proteins.The proteomic profile of the potentiated antler stem cells compared with the dormant antler stem cells was explored by 2D-DIGE.One hundred fifty-nine protein spots with more than 1.1-fold changes and less than -1.1-fold changes andPvalues less than 0.05 differentially expressed by the potentiated over the dormant antler stem cells，including 110 up-regulated and 49 down-regulated protein spots.Multiple markers were obtained by extended data analysis(EDA) module.MALDI-TOF-MS identified 84 differentially expressed protein spots and 48 of them which came from 27 kinds of proteins were positive.There is a significant difference at proteomic level between the potentiated and the dormant antler stem cells，and some identified proteins which are involved in multiple functional categories might be related to antler regeneration.Therefore，antler regeneration is a process from the dormant to the potentiated states in antler stem cells，which is regulated by multiple proteins and a complicated signal network.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.01.013

收稿日期：2015-02-04

基金項(xiàng)目：國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863)項(xiàng)目(2011AA100603)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31170950)；吉林省重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目(20150204071NY)；吉林省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(20140101139JC)

作者簡(jiǎn)介：董振(1989-)，男，吉林白城人，碩士生，主要從事鹿茸蛋白質(zhì)組學(xué)研究，E-mail：xi.andz@163.com *通信作者：李春義，博士，研究員，主要從事鹿茸生物學(xué)研究，E-mail：lichunyi1959@163.com

中圖分類號(hào)：S825；S813.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào):0366-6964(2016)01-0092-13