沈友林，汪銘書 *，程安春，賈仁勇，朱德康，陳　舜，劉馬峰，劉　菲，楊　喬，孫昆峰，陳孝躍

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院禽病防治研究中心，成都 611130；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)研究所，成都 611130；3.動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，成都 611130)

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1型鴨甲肝病毒VP3蛋白的抗血清中和活性分析及B細(xì)胞表位鑒定

沈友林1，2，3，汪銘書1，2，3 *，程安春1，2，3，賈仁勇1，2，3，朱德康1，3，陳舜1，2，3，劉馬峰1，2，3，劉菲3，楊喬1，2，3，孫昆峰1，2，3，陳孝躍1，3

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院禽病防治研究中心，成都 611130；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)研究所，成都 611130；3.動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，成都 611130)

摘要：旨在探究1型鴨甲肝病毒(DHAV-1)VP3蛋白抗血清的中和活性并鑒定VP3的線性B細(xì)胞表位。利用pGEX-4T-1表達(dá)載體，在BL21(DE3)宿主菌中原核表達(dá)DHAV-1VP3基因，以切膠純化出的蛋白質(zhì)為抗原免疫兔制備多克隆抗體，通過雞胚中和試驗對多抗的中和效價進(jìn)行檢測；采用Karplus&Schulz、Emini、Jameson-Wolf和Parker方法分別對柔韌性、表面可及性、抗原性及親水性進(jìn)行分析，得到了4條候選線性B細(xì)胞表位，以制備的兔抗VP3多克隆抗體為一抗，通過間接ELISA方法對人工合成的B細(xì)胞表位進(jìn)行鑒定，并進(jìn)一步用臨床鴨血清樣品對鑒定的B細(xì)胞表位的抗體檢測能力進(jìn)行評估。結(jié)果顯示，VP3在BL21(DE3)中以包涵體形式表達(dá)，大小約54 ku，Western blot分析表明重組蛋白質(zhì)具有較好的反應(yīng)原性。制備的兔抗VP3多克隆抗體的瓊擴(kuò)效價達(dá)到1∶16，并能中和DHAV-1，中和效價為1∶39；利用間接ELISA鑒定出GKRKPCRRPIHKPKNPPQEP(1—20 aa)、FNTGRYQMSWYPIADGEQSL(131—150 aa)和VNSSAPSNID(200—209 aa)為VP3的B細(xì)胞表位，抗體檢測能力試驗結(jié)果顯示表位肽可檢測臨床DHAV-1鴨血清。本研究表明DHAV-1 VP3的抗血清具備一定的中和活性，1—20 aa、131—150 aa和200 —209 aa為VP3的B細(xì)胞表位且具有臨床應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：1型鴨甲肝病毒；VP3蛋白；多克隆抗體；中和活性；B細(xì)胞表位

鴨病毒性肝炎(duck viral hepatitis，DVH)是一種發(fā)病快、傳播迅速、高度接觸性和高死亡率的重要傳染病，它主要感染4周齡以下雛鴨，以肝腫大、出血為主要病變特征，嚴(yán)重制約著養(yǎng)鴨業(yè)的健康發(fā)展。引起DVH的病毒至少有3種，其中鴨甲肝病毒1型(duck hepatitis A virus type 1，DHAV-1)和新型鴨肝炎病毒(DHAV-2和DHAV-3)分別為鴨甲型肝炎病毒(DHAV)的三種基因型[1]，均為小RNA病毒科禽肝炎病毒屬成員[2]，而鴨肝炎病毒2型(duck hepatitis virus 2，DHV-2)和3型(DHV-3)已經(jīng)歸為星狀病毒科[3]。DHAV-1所致的鴨肝炎是分布最廣，危害最大的，1周齡內(nèi)死亡率可超過50%，甚至達(dá)到95%[4]。

DHAV-1為單股正鏈小RNA病毒，由RNA和衣殼組成，沒有囊膜?；蚪M只有一個開放閱讀框(open reading frame，ORF)，上下游分別連接5′非編碼區(qū)(5′ UTR)和3′非編碼區(qū)(3′ UTR)。基因組編碼的2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D七種非結(jié)構(gòu)蛋白在病毒的復(fù)制和增殖中發(fā)揮作用；編碼的VP0(VP4和VP2共價相連)、VP3和VP1三種結(jié)構(gòu)蛋白組裝形成衣殼，其中VP1和VP3位于衣殼表面，彼此空間結(jié)構(gòu)非常相似。序列比對發(fā)現(xiàn)，VP1有很多高度變異的區(qū)段[5]，這些區(qū)域大多暴露在外，使VP1成為主要的抗原蛋白[6]，而VP3的N端也有一段暴露的高變氨基酸序列[7]，提示VP3也有可能是決定抗原性的主要蛋白質(zhì)之一，有研究證明VP3具有抗原性[8-9]。然而，VP3的抗血清是否具有中和活性以及VP3蛋白的B細(xì)胞表位鑒定還未見報道。

作者用原核表達(dá)的VP3蛋白制備多克隆抗體，并對其抗體效價及中和活性進(jìn)行分析，同時利用生物信息學(xué)工具，綜合分析獲得VP3可能存在的線性B細(xì)胞表位，以制備的多克隆抗體通過間接ELISA鑒定VP3蛋白的B細(xì)胞表位，這對了解VP3的抗原結(jié)構(gòu)和免疫學(xué)活性，開發(fā)DHAV-1新型診斷試劑和疫苗都具有重要意義。

1材料與方法

1.1實驗材料及動物

DHAV-1 H株病毒、DHAV-1雞胚化弱毒株(CH60株)、DH5α、BL21(DE3)和pGEX-4T-1載體均由筆者所在實驗室保存和提供；T克隆載體pMD19-T(Simple) 購自寶生物工程(大連)有限公司。RNAiso Plus、2×PrimeStar Max Premix、DNA Maker、DNA Ligase Mix、限制性內(nèi)切酶(BamHⅠ、XhoⅠ)均購自寶生物工程(大連)有限公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體購自北京中杉金橋；HRP標(biāo)記的兔抗鴨IgG抗體購自北京康碧泉，兔抗DHAV-1 IgG由本實驗室制備保存。臨床鴨血清樣(可能含DHAV-1陽性或陰性血清)采自各地養(yǎng)殖場；2～3 kg健康雄兔、9日齡雞胚購自本地養(yǎng)殖場。

1.2引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank公布的DHAV-1 H株(JQ301467)基因序列，利用Primer Premier 5和Oligo 7軟件設(shè)計一對可以擴(kuò)增覆蓋VP3基因全長的特異性引物，上游引物 VP3F：5′-GGATCCGCAATGGACAATCAGGGAAAGAGA-3′(下劃線所示為BamHⅠ位點)，下游引物 VP3R：5′-CTCGAGAACTGGCTAATCATCCCCTA-3′(下劃線所示為XhoⅠ位點)，預(yù)期目的片段長度774 bp。引物由Invitrogen(上海)公司合成。

1.3VP3的表達(dá)、純化及反應(yīng)原性分析

按RNAiso Plus試劑的說明書提取病毒RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，膠回收目的片段并T-A克隆至pMD19(Simple)載體，PCR和酶切鑒定正確后命名為pMD-VP3。BamHⅠ和XhoⅠ分別酶切pMD-VP3和pGEX-4T-1載體，膠回收目的片段并連接，轉(zhuǎn)化DH5α，鑒定的陽性菌送Invitrogen(上海)公司測序，陽性質(zhì)粒命名為pGEX-VP3。將pGEX-VP3轉(zhuǎn)化BL21(DE3)并表達(dá)，冰浴超聲破碎菌體后離心，分別收集上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE檢測。對IPTG濃度、誘導(dǎo)溫度和時間進(jìn)行摸索并以最優(yōu)表達(dá)條件大量誘導(dǎo)表達(dá)。對純化方式進(jìn)行摸索，選擇切膠方式并參考文獻(xiàn)純化目的蛋白質(zhì)[10]。重組蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，以兔抗DHAV-1 IgG(1∶100) 作為一抗，陰性兔血清作為對照，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶3 000)作為二抗，按常規(guī)方法進(jìn)行Western blot檢測。

1.4兔抗VP3多克隆抗體的制備

將切膠純化的目的蛋白與等量弗氏佐劑混合并乳化，按常規(guī)程序免疫兔(除二免、三免分別免疫1 mg·只-1和0.7 mg·只-1外，其余0.5 mg·只-1)；分離血清，瓊擴(kuò)試驗檢測多抗效價。以重組蛋白質(zhì)作為抗原，制備的多抗(1∶100)作為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶3 000) 作為二抗，Western blot檢測VP3多抗的反應(yīng)性。

1.5VP3抗血清的中和活性分析

首先以CH60株(10-4～10-8稀釋)接種9日齡雞胚尿囊腔，常規(guī)方法測定ELD50，然后采用“固定病毒-稀釋血清”法檢測中和效價，具體如下：將多抗在56 ℃處理30 min后進(jìn)行1∶2～1∶256稀釋，然后將200 ELD50的CH60株病毒液與各稀釋度的多抗血清等體積混合，37 ℃作用1 h進(jìn)行中和。將中和液接種9日齡雞胚尿囊腔，每個稀釋度5枚，0.2 mL·枚-1，37 ℃繼續(xù)孵育，同時設(shè)空白對照(用滅菌生理鹽水替代中和液，如上步驟操作，雞胚須全部健活)和病毒對照(接種100 EID50·0.2 mL-1的CH60株，雞胚須全部死亡)。連續(xù)觀察5 d，記錄死亡情況，Reed-Muench法計算結(jié)果。

1.6VP3的B細(xì)胞表位鑒定

1.6.1B細(xì)胞表位的預(yù)測與合成登錄免疫信息學(xué)網(wǎng)站(http：//tools.immuneepitope.org)，采用Karplus&Schulz、Emini及Parker方法分別對VP3蛋白序列的柔韌性、表面可及性和親水性進(jìn)行分析。進(jìn)一步結(jié)合DNAStar 7.1的Protean程序，利用Jameson-Wolf法預(yù)測抗原性，綜合各因素預(yù)測得到VP3蛋白的線性B細(xì)胞表位。將上述多肽序列送吉爾生化(上海)公司合成，純度>95%。

1.6.2VP3蛋白B細(xì)胞表位的鑒定首先用純化的VP3重組蛋白質(zhì)(1∶20～1∶2 560稀釋)作抗原包被酶標(biāo)板，100 μL·孔-1，4 ℃過夜；次日洗板4次，每次5 min，拍干反應(yīng)板(洗板過程下同)；每孔加入200 μL 1%明膠溶液，37 ℃封閉90 min；棄封閉液，洗板，拍干后100 μL·孔-1加入VP3多克隆血清和陰性血清(分別作1∶80～1∶5 120稀釋)，37 ℃孵育90 min；洗板，拍干，加入1∶3 000稀釋的HRP-羊抗兔IgG，100 μL·孔-1，37 ℃孵育45 min；洗板，拍干，100 μL·孔-1加入TMB工作液，室溫避光作用10 min后，50 μL·孔-1加入2 mol·L-1H2SO4終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀以450 nm和630 nm雙波長測定OD值。選擇陽性孔的OD值1.0左右、陰性對照的OD值0.1左右的稀釋度作為最佳抗原工作濃度。

以最佳抗原濃度稀釋各表位肽，兔抗VP3多克隆抗體作為一抗(1∶20～1∶2 560稀釋)并平行設(shè)置陰性血清對照，HRP-羊抗兔IgG(1∶3 000)作為二抗，按上述條件進(jìn)行間接ELISA，做3個重復(fù)，450 nm和630 nm雙波長讀數(shù)。

1.7B細(xì)胞表位在檢測應(yīng)用中的初步評估

分別以VP3a單肽、VP3a+VP3b+VP3c混合肽和純化的VP3蛋白作抗原，200 ng·孔-1包被酶標(biāo)板；取10份臨床鴨血清樣作1∶40稀釋，設(shè)立陰性鴨血清對照；以HRP標(biāo)記的兔抗鴨IgG(1∶1 000)作為二抗，參照“1.6.2”的步驟進(jìn)行檢測。

2結(jié)果

2.1VP3目的基因的克隆與鑒定

對提取的病毒RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，結(jié)果在約750 bp處得到了預(yù)期大小的條帶(圖1A)，先后克隆至pMD19-T(Simple)載體和pGEX-4T-1表達(dá)載體，經(jīng)菌液PCR和酶切鑒定得到預(yù)期大小的條帶(圖1B)。送Invitrogen(上海)測序，對測序結(jié)果進(jìn)行核苷酸序列比對，結(jié)果顯示載體中插入的基因片段大小為774 bp，并與原始片段相似性為100%，表明重組表達(dá)載體構(gòu)建成功，命名為pGEX-VP3。

2.2重組VP3蛋白的表達(dá)、純化及反應(yīng)原性分析

SDS-PAGE結(jié)果表明，重組VP3蛋白在陽性重組表達(dá)菌中得到表達(dá)(圖2A)，大小約54 ku，符合預(yù)期。表達(dá)條件優(yōu)化結(jié)果顯示，以0.2 mmol·L-1IPTG、37 ℃誘導(dǎo)8 h時表達(dá)量最大，且以包涵體形式存在。切膠純化得到的目的蛋白質(zhì)純度較高(圖2B)。重組VP3蛋白能與兔抗DHAV-1 IgG特異性結(jié)合，具有良好的反應(yīng)原性(圖2C)。

2.3多克隆抗體的制備

經(jīng)過五免后的兔血清瓊擴(kuò)效價均達(dá)到1∶16，對分離的血清進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果顯示制備的兔抗VP3多克隆抗能與重組VP3蛋白發(fā)生結(jié)合，產(chǎn)生特異性印記，與兔陰性血清則不能結(jié)合(圖3)。

2.4VP3抗血清的中和活性分析

通過Reed-Muench法計算該批CH60病毒液的ELD50為10-7.3·0.2 mL-1。用測過ELD50的病毒液，以“固定病毒-稀釋血清”法進(jìn)行雞胚中和試驗，Reed-Muench法計算其中和效價為1∶39，即1∶39的血清可保護(hù)50%雞胚不發(fā)生死亡。

2.5VP3蛋白B細(xì)胞表位的鑒定

2.5.1B細(xì)胞表位預(yù)測綜合生物信息學(xué)軟件分析VP3蛋白序列的柔韌性(圖4A)、表面可及性(圖4B)、親水性(圖4C)和抗原性(圖4D)，確定了VP3蛋白可能的4條B細(xì)胞表位序列：VP3a(1GK-RKPCRRPIHKPKNPPQEP20)、VP3b(131FNTGR-YQMSWYPIADGEQSL150)、VP3c(177TTWRKST-RDPYG188)和VP3d(200VNSSAPSNID209)。由吉爾生化(上海)人工合成表位肽段。

2.5.2B細(xì)胞表位鑒定按照方陣法，確定了最佳抗原工作質(zhì)量濃度為 0.174 ng·μL-1(1∶1 280稀釋)。以該質(zhì)量濃度包被各表位肽，以陰性血清組作為對照，進(jìn)行間接ELISA檢測，結(jié)果表明VP3a(1GKRKPCRRPIHKPKNPPQEP20)、VP3b(131FNTGRYQMSWYPIADGEQSL150)和 VP3d(200VNSSAPSNID209)能與VP3多抗特異性結(jié)合，為VP3蛋白的B細(xì)胞表位(圖5)。

2.6B細(xì)胞表位檢測應(yīng)用潛力的初步評估

通過檢測10份臨床鴨血清，結(jié)果發(fā)現(xiàn)VP3a單肽及VP3a+VP3b+VP3d混合肽與VP3蛋白一樣，可以區(qū)分不同DHAV-1抗體水平的鴨血清，而且對于檢測結(jié)果反映的抗體水平高低的規(guī)律，三者是一致的。但VP3a單肽和VP3a+VP3b+VP3d混合肽分別作抗原的間接ELISA檢測值(以下分別簡稱VP3a的值和混合肽的值)顯著低于VP3全蛋白作抗原的間接ELISA檢測值，VP3a的值與混合肽的值之間沒有顯著差異(圖6)。

3討論

目前對DHAV的研究主要集中于VP1蛋白[11-15]，它是公認(rèn)的小RNA病毒最主要的抗原蛋白，對開發(fā)亞單位疫苗有重要意義。然而，VP3也是重要的衣殼蛋白，和VP1一樣位于病毒衣殼表面，其他小RNA病毒的研究表明VP3上存在大量B細(xì)胞和T細(xì)胞表位[16-17]，對抗原性有重要影響，但DHAV VP3的相關(guān)研究未見報道。

本研究表達(dá)的重組VP3蛋白能與兔抗DHAV-1抗體特異性結(jié)合，證明了其良好的反應(yīng)原性。雖然VP3蛋白的反應(yīng)原性已經(jīng)被大量研究證實[8-9，18]，但其是否具有免疫原性以及其抗血清是否具有中和活性還不清楚，而中和活性是評價免疫保護(hù)力，進(jìn)而評價疫苗潛力的重要指標(biāo)，對其研究具有重要意義。對于小RNA病毒的VP3蛋白，目前只有禽腦脊髓炎病毒(avian encephalomyelitis virus)的VP3被證明是有免疫原性的[19]。本研究通過雞胚中和試驗初步證明由DHAV-1 VP3激發(fā)機體所產(chǎn)生的抗體能夠中和DHAV-1，表明VP3具備開發(fā)亞單位疫苗的潛力。

B細(xì)胞表位是位于抗原蛋白上能夠被機體B淋巴細(xì)胞特異性識別的氨基酸序列，有線性和構(gòu)象型之分，是體液免疫的直接誘因，對B細(xì)胞表位的鑒定有利于揭示體液免疫的本質(zhì)，開發(fā)新型診斷試劑和安全、高效的表位疫苗。目前對線性B細(xì)胞表位的研究主要有單克隆抗體技術(shù)、噬菌體展示技術(shù)、裂解法、交互重疊多肽法、肽芯片高通量掃瞄法等[20]，隨著生物信息學(xué)的發(fā)展，通過計算機軟件預(yù)測線性B細(xì)胞表位成為簡便、可靠的方法。本研究利用生物信息學(xué)軟件綜合分析，并通過間接ELISA方法檢測表明，1—20 aa、131—150 aa和200—209 aa能與兔抗VP3多抗產(chǎn)生免疫結(jié)合反應(yīng)。1—20 aa和177—188 aa是之前預(yù)測的DHAV-1 VP3的B細(xì)胞表位[8-9]，與DHAV-1親緣關(guān)系最近的人類雙?？虏《?human parechoviruses)VP3的N端有一段暴露的堿性氨基酸富含區(qū)域，被證明是B細(xì)胞表位[21]，而DHAV-1的VP3在N端也有同樣的結(jié)構(gòu)特征[5]，暗示其也可能是B細(xì)胞表位，本研究對1—20 aa的鑒定證明了上述推測；然而177—188 aa在本研究中未得到驗證，有可能預(yù)測的表位并非真實的B細(xì)胞表位，也可能它是隱蔽性表位。為了評估VP3蛋白B細(xì)胞表位在檢測應(yīng)用中的潛力，以鑒定出的B細(xì)胞表位肽和VP3蛋白分別作抗原，用間接ELISA檢測了10份臨床鴨血清樣本，結(jié)果發(fā)現(xiàn)表位肽與VP3重組蛋白質(zhì)一樣可區(qū)分不同DHAV-1抗體水平的鴨血清，而VP3能用以檢測DHAV-1抗體[22]，這表明表位肽同樣具有檢測DHAV-1抗體的潛力。本研究中，盡管表位肽也能識別DHAV-1血清，但反應(yīng)原性不及VP3重組蛋白質(zhì)強，可能是因為本研究中采用的是經(jīng)優(yōu)化后的VP3重組蛋白質(zhì)的間接ELISA檢測條件，沒有另對表位肽檢測DHAV-1抗體的條件進(jìn)行優(yōu)化；也有可能是表位肽相對分子質(zhì)量太小，包被時未能很好地吸附到ELISA板上；還有可能VP3上包含了比本研究中更多的B細(xì)胞表位，這需要進(jìn)一步研究確認(rèn)。這也提示我們對DHAV表位診斷試劑及疫苗的研究需考慮多表位重疊或偶聯(lián)載體等技術(shù)手段。由于目前尚無對DHAV VP3蛋白B細(xì)胞表位鑒定的報道，也沒有商品化的DHAV單克隆抗體，因此本試驗以自制的兔抗VP3多克隆抗體為材料，采用間接ELISA方法鑒定B細(xì)胞表位，結(jié)果顯示該方法是切實可行的。本研究為深入研究DHAV-1 VP3的抗原結(jié)構(gòu)和免疫學(xué)功能提供了重要材料，并為今后DHAV-1新型診斷試劑和新型疫苗的研制帶來啟發(fā)。

4結(jié)論

制備的兔抗VP3多克隆抗體具有一定的中和活性，1—20 aa、131—150 aa和200—209 aa為VP3蛋白的線性B細(xì)胞表位，初步證明VP3蛋白的B細(xì)胞表位具有檢測DHAV-1抗體的潛力。

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(編輯白永平)

Neutralizing Activity Analysis of VP3 Antiserums and B-cell Epitopes Identification of VP3 Protein form Duck Hepatitis A Virus Type 1

SHEN You-lin1，2，3，WANG Ming-shu1，2，3*，CHENG An-chun1，2，3，JIA Ren-yong1，2，3，ZHU De-kang1，3，CHEN Shun1，2，3，LIU Ma-feng1，2，3，LIU Fei3，YANG Qiao1，2，3，SUN Kun-feng1，2，3，CHEN Xiao-yue1，3

(1.AvianDiseaseResearchCenter，CollegeofVeterinaryMedicine，SichuanAgriculturalUniversity，Chengdu611130，China；2.PreventiveVeterinaryInstitute，SichuanAgriculturalUniversity，Chengdu611130，China；3.KeyLaboratoryofAnimalDiseaseandHumanHealthofSichuanProvince，Chengdu611130，China)

Key words:duck hepatitis A virus type 1；VP3 protein；polyclonal antibodies；neutralizing activity；B-cell epitopes

Abstract:This study aimed at researching neutralizing activity of VP3 antiserums and determining B-cell epitopes of VP3 protein from duck hepatitis A virus type 1(DHAV-1).The pGEX-4T-1 expression plasmid was used to expressVP3 gene of DHAV-1 inE.coliBL21(DE3).The expressed recombinant VP3 protein was purified by gel extraction and was used as immunogen to rabbit to prepare polyclonal antibodies.Chicken embryo neutralization test was conducted to detect the neutralizing titer of polyclonal antibodies.Moreover，Karplus&Schulz，Emini，Jameson-Wolf and Parker method were used to analyze the flexibility，surface accessibility，antigenicity and hydrophilicity of the VP3 protein，respectively.This contributed to obtain four probable B-cell epitopes for VP3 protein.The rabbit anti-VP3 polyclonal antibody was used as the first antibody of indirect ELISA to identity the synthetic peptides.Furthermore，a panel of clinical duck serum samples was used to evaluate capacity of the identified B-cell epitopes for antibodies detection.The results showed that the recombinant VP3 protein was expressed as inclusion body inE.coliBL21(DE3) with a molecular weight about 54 kD，and proved to be with good reactogenicity by Western blot analysis.The prepared polyclonal antibodies reached an titer of 1∶16 by AGP test，it could neutralize DHAV-1 and reached a titer of 1∶39.Furthermore，the B-cell epitopes identified by indirect ELISA were GKRKPCRRPIHKPKNPPQEP(1-20 aa)，F(xiàn)NTGRYQMSWYPIADGEQSL(131-150 aa) and VNSSAPSNID(200-209 aa).The test for antibody detection ability revealed the epitopes were capable of detecting clinical duck antiserums of DHAV-1.This study proved antiserums to VP3 protein of DHAV-1 with neutralizing activity and identified VP3’s three promising B-cell epitopes，1-20 aa，131-150 aa and 200-209 aa，for clinical use.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.01.019

收稿日期：2015-04-24

基金項目：國家“十二五”科技支撐計劃(2015BAD12B05)；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(水禽)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(CARS-43-8)；四川省創(chuàng)新團(tuán)隊項目(12TD005/2013TD0015)

作者簡介：沈友林(1989-)，男，湖北當(dāng)陽人，碩士，主要從事禽病學(xué)研究，E-mail：youlin_5151luck@sina.com *通信作者：汪銘書，E-mail：mshwang@163.com

中圖分類號：S858.325.3；S852.659.6

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)01-0141-08