馮真英 葉少玲 陳文興 姚小軍

肺炎支原體對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥性及耐藥機(jī)制研究

馮真英 葉少玲 陳文興 姚小軍

目的探析肺炎支原體對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的耐藥性及其耐藥機(jī)制。方法130例社區(qū)獲得性肺炎患者,取其急性期咽拭子標(biāo)本,行肺炎支原體分離培養(yǎng),采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)進(jìn)行分離株分子鑒定；采用微量稀釋法檢測(cè)肺炎支原體對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的最低抑菌濃度(MIC),行23SrRNA基因測(cè)序,并與標(biāo)準(zhǔn)菌株MPFH(ATCC 15531)基因序列進(jìn)行對(duì)比分析。結(jié)果130例社區(qū)獲得性肺炎患者咽拭子標(biāo)本中,分離出20株(15.4%)肺炎支原體；對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素藥物均存在耐藥性,其耐藥機(jī)制為23SrRNA基因位點(diǎn)突變。結(jié)論肺炎支原體對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物具有嚴(yán)重的耐藥性,其耐藥機(jī)制主要是23SrRNA基因位點(diǎn)突變。

肺炎支原體；大環(huán)內(nèi)酯類抗生素；最低抑菌濃度；耐藥

肺炎支原體(MP)是臨床小兒呼吸道感染的常見(jiàn)病原體,其引發(fā)的肺炎和肺外并發(fā)癥嚴(yán)重危害患者的健康和生命。因此,探尋最佳的治療方案具有重要的臨床意義。臨床治療肺炎支原體感染多以大環(huán)內(nèi)酯類抗生素較為常見(jiàn)［1］,但近些年,大環(huán)內(nèi)酯類抗生素長(zhǎng)期廣泛的臨床應(yīng)用,已有報(bào)道表明肺炎支原體耐藥株的產(chǎn)生,同時(shí)藥物自身的不良反應(yīng),使臨床治療效果欠佳［2］。本次研究探討肺炎支原體對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的耐藥性及其耐藥機(jī)制,現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本院2013年6月～2015年8月收治的社區(qū)獲得性肺炎患者130例,其中男68例、女62例,年齡15～78歲,平均年齡(47.2±11.5)歲。入選標(biāo)準(zhǔn)：符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)會(huì)制定的成年人《社區(qū)獲得性肺炎診斷和治療指南》關(guān)于肺炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)［2］：患者年齡≥14周歲,X線或CT檢查顯示肺部出現(xiàn)新浸潤(rùn)影,且符合①新出現(xiàn)的咳嗽癥狀加重；②體溫＞37.8℃或＜35.6℃；③外周白細(xì)胞總數(shù)＞10×109/L或＜4× 109/L的三者之一。排除標(biāo)準(zhǔn)：①免疫抑制性疾病或已接受免疫抑制劑治療者；②發(fā)病時(shí)間＞1周；③孕婦或哺乳期；④90 d內(nèi)有住院史且住院時(shí)間＞2 d；患者均簽署知情同意書。

1.2 采集標(biāo)本 患者入院后當(dāng)日,采集其急性期咽拭子,置于肺炎支原體保存液的無(wú)菌保存管中,凍存于-80℃送檢。

1.3 肺炎支原體培養(yǎng) 采用變色培養(yǎng)基液體培養(yǎng)法,以基礎(chǔ)肉湯培養(yǎng)基、培養(yǎng)添加劑自配的變色培養(yǎng)基,取200 μl置入咽拭子標(biāo)本液中,加入2ml變色培養(yǎng)基中,于37℃溫度下培養(yǎng)2～6周,顏色由澄清紅變?yōu)槌吻妩S判定為陽(yáng)性［3］,反之為陰性；對(duì)獲得培養(yǎng)陽(yáng)性菌株行MP-PCR鑒定。

1.4 藥敏試驗(yàn) 采用SP4液體培養(yǎng)基,以微量稀釋法檢測(cè)肺炎支原體對(duì)紅霉素、阿奇霉素、克拉霉素、米諾環(huán)素、四環(huán)素、加替沙星、莫西沙星、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星的MIC。采用PCR法擴(kuò)增檢測(cè)肺炎支原體23SrRNA全序列,并與標(biāo)準(zhǔn)菌株MPFH (ATCC 15531)基因序列對(duì)比。

2 結(jié)果

2.1 肺炎支原體分離率 130例咽拭子標(biāo)本中,共分離出20株(15.4%)肺炎支原體,均行PCR法鑒定。

2.2 肺炎支原體對(duì)抗菌藥物的敏感性 20株肺炎支原體對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素均存在耐藥性,耐藥率為100%,其耐藥機(jī)制為23SrRNA基因位點(diǎn)突變；四環(huán)素、氟喹諾酮類未見(jiàn)耐藥株；喹諾酮類中加替沙星、莫西沙星存在著良好的體外抗肺炎支原體活性,其MIC值顯著低于環(huán)丙沙星、左氧氟沙星。肺炎支原體藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1,表2。

表1 20株肺炎支原體體外藥物敏感試驗(yàn)的MIC值(μg/ml)

表2 20株肺炎支原體體外藥物敏感試驗(yàn)的MIC值(μg/ml)

3 討論

MP是臨床呼吸道感染的常見(jiàn)病原體,對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素較為敏感。近些年,肺炎支原體的耐藥現(xiàn)象逐漸增多,且有研究報(bào)道顯示,已分離出對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的耐藥菌株,而其耐藥的主要機(jī)制為23SrRNA基因突變。大環(huán)內(nèi)酯類抗生素是臨床放線菌屬細(xì)菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物［4］,結(jié)構(gòu)特征以14～16元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯為母核,糖苷鍵和1～3分子糖相連接,其中紅霉素是14元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯的代表性藥物,另還有克拉霉素、竹桃霉素等；阿奇霉素是15元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類代表藥物；大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的抗菌機(jī)制為蛋白合成抑制劑,對(duì)核糖體有共同的結(jié)合位點(diǎn),可抑制核糖體上的蛋白質(zhì)合成。

大量臨床研究顯示,病原體細(xì)胞中核糖體的23SrRNA含有肽酰轉(zhuǎn)移酶,能催化肽鍵的合成,進(jìn)而合成蛋白質(zhì)；大環(huán)內(nèi)酯類抗生素則能與酶的催化中心Ⅴ區(qū)的核苷酸相作用,抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成。多聚肽鏈合成的肽轉(zhuǎn)移酶中心A2058位是紅霉素作用的關(guān)鍵位點(diǎn),其作用基團(tuán)與各基因相結(jié)合,并分別形成氫鍵。另有研究表明［5］,大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物還可抑制病原體50S核糖體的組裝,進(jìn)而抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成。由于肺炎支原體分離培養(yǎng)的難度較大,對(duì)其耐藥機(jī)制的研究主要由抗生素體外誘導(dǎo)的耐藥株、臨床分離株中獲得。目前,研究認(rèn)為大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的滅活機(jī)制為：①靶位的改變,如基因突變或甲基化；②主動(dòng)外排；③藥物的滅活。而結(jié)合位點(diǎn)的基因突變是引起肺炎支原體耐藥的主要機(jī)制之一。

人工體外誘導(dǎo)獲得的耐藥株的耐藥機(jī)制主要是23SrRNA基因突變。早前有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),紅霉素誘導(dǎo)獲得的兩株耐藥菌株中有2063位由A到G點(diǎn)突變,有2064位A到G點(diǎn)突變；其中2063位點(diǎn)突變的菌株耐藥表型為14元環(huán)的大環(huán)內(nèi)酯類耐藥,2064位點(diǎn)突變的菌株耐藥表型為16元環(huán)的大環(huán)內(nèi)酯類耐藥［6］。另有學(xué)者報(bào)道顯示：體外紅霉素誘導(dǎo)的耐藥菌株存在2063位A到G和2064位A到G的點(diǎn)突變,誘導(dǎo)藥物的濃度與突變模式無(wú)關(guān),其耐藥表型主要取決于點(diǎn)突變的部位［3］。上述突變都在23SrRNA的Ⅴ區(qū),而其他大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的作用位點(diǎn)未發(fā)現(xiàn)有點(diǎn)突變,23SrRNA的Ⅱ區(qū)也未發(fā)現(xiàn)點(diǎn)突變。本次研究結(jié)果顯示：130例社區(qū)獲得性肺炎患者咽拭子標(biāo)本中,分離出20株(15.4%)肺炎支原體；對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素藥物均存在耐藥性,耐藥率高達(dá)100%,而其耐藥機(jī)制為23SrRNA基因位點(diǎn)突變。

綜上所述,肺炎支原體對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物具有嚴(yán)重的耐藥性,其耐藥機(jī)制主要是23SrRNA基因位點(diǎn)突變。而近些年,隨著檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步發(fā)展,新型耐藥機(jī)制有待進(jìn)一探討研究。

［1］韓旭,辛德莉,馬少杰,等.耐藥肺炎支原體肺炎患兒的臨床特點(diǎn).實(shí)用兒科臨床雜志,2010,25(16):48-49.

［2］朱翠明,劉艷,劉丹.突變敏感性分子開(kāi)關(guān)檢測(cè)肺炎支原體對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的耐藥性研究.中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2015,31(5):73-74.

［3］胡荊江,陳玲,覃軍.兒童肺炎支原體突變體對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥的研究.國(guó)際呼吸雜志,2015,35(19):17-18.

［4］史大偉,辛德莉.肺炎支原體體外誘導(dǎo)抗生素耐藥及其機(jī)制.國(guó)際兒科學(xué)雜志,2010,37(1):86-87.

［5］吳勇兵,王瑞瓊,張暢斌,等.96例小兒肺炎支原體感染情況及耐藥性分析.國(guó)際醫(yī)藥衛(wèi)生導(dǎo)報(bào),2012,18(13):74-75.

［6］黃榕,陽(yáng)愛(ài)梅,宋建輝,等.1026例兒童肺炎支原體感染及耐藥情況分析.中國(guó)當(dāng)代兒科雜志,2013,15(7):26-27.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2016.13.096

2016-04-06］

524003 湛江市第二人民醫(yī)院(馮真英 葉少玲陳文興)；第二軍醫(yī)大學(xué)研究生四隊(duì)(姚小軍)