牟國翠， 聶 堯*， 穆曉清， 徐 巖，2， 肖 榮

（1.江南大學(xué) 工業(yè)技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122；3.羅格斯大學(xué)高級生物技術(shù)與醫(yī)學(xué)中心，新澤西州08854，美國）

定點突變提高克雷伯氏菌普魯蘭酶的耐酸性

牟國翠1， 聶 堯*1， 穆曉清1， 徐 巖1，2， 肖 榮3

（1.江南大學(xué) 工業(yè)技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122；3.羅格斯大學(xué)高級生物技術(shù)與醫(yī)學(xué)中心，新澤西州08854，美國）

通過分析Klebsiella variicola SHN-1普魯蘭酶的活性中心，并將K.variicola SHN-1普魯蘭酶與來自K.pneumoniae，Bacillus acidopullulyticus，B.naganoensis的普魯蘭酶氨基酸序列進(jìn)行同源性比較，確定了H626D、R756E、H852D、R908E、I619N、F723Y、S850T、K851S八個突變位點，采用定點突變的方法獲得了8個突變酶，經(jīng)過酶學(xué)性質(zhì)分析，發(fā)現(xiàn)H852D的最適反應(yīng)pH由原來的pH 5.0降低為pH 4.7，且在pH 4.5下的穩(wěn)定性得到提高。通過同源建模及結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，852位點突變?yōu)樘於彼岷笈c周圍的氨基酸多形成了2個氫鍵，因此提高了結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，且由于活性中心pKa值的改變，造成了普魯蘭酶最適pH發(fā)生了遷移。

普魯蘭酶；定點突變；耐酸性；最適pH值

普魯蘭酶（EC 3.2.1.41）能夠?qū)Ｒ恍郧虚_支鏈淀粉分支點中的α-1，6糖苷鍵的葡萄糖苷水解酶，可特異性地將支鏈淀粉水解形成直鏈淀粉[1]。淀粉制糖工業(yè)包括液化和糖化兩步，糖化過程中，葡萄糖淀粉酶和β-淀粉酶將液化產(chǎn)生的低聚糖進(jìn)一步分解產(chǎn)生葡萄糖或麥芽糖，但由于葡萄糖淀粉酶對α-1，6糖苷鍵的作用效率低，β-淀粉酶遇到α-1，6分支點則停止作用，因此生產(chǎn)淀粉糖的最高轉(zhuǎn)化率（DE值）只能達(dá)到96%[2]。若在糖化過程中添加普魯蘭酶，可使DE值達(dá)到97%~98%，從而提高了原料利用率和葡萄糖的收率。

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多生產(chǎn)普魯蘭酶的微生物，如 Bacillus acidopullulyticus[3]、B.subtilis TU[4]、Thermus aquaticus YT-1[5]、Desulfurococcus mucosus[6]等。但是能真正運用到工業(yè)生產(chǎn)中的普魯蘭酶卻很少，這是因為糖化通常是在55~65℃、pH 4.5~5.5的條件下進(jìn)行，大多數(shù)普魯蘭酶的最適作用溫度、pH并不符合生產(chǎn)需要。因此，有必要對現(xiàn)有普魯蘭酶進(jìn)行蛋白質(zhì)工程分子改造，以使其適應(yīng)工業(yè)生產(chǎn)需要。

基于理性設(shè)計的定點突變常用來改造酶蛋白的性質(zhì)，具有快速、直接、準(zhǔn)確率高的特點[7]，常用的理性設(shè)計原理包括：同源比對[8]、表面電荷優(yōu)化[9]以及設(shè)計改造分子間相互作用力[10]。影響酶蛋白耐酸性的因素主要有：活性中心的pKa值[11-12]、底物結(jié)合位點的pKa值[13]、蛋白質(zhì)表面電荷[14]、蛋白質(zhì)內(nèi)部的分子作用力如氫鍵、鹽橋、范德華力等。作者基于Klebsiella variicola SHN-1普魯蘭酶的活性中心關(guān)鍵氨基酸位點的組成分析，并進(jìn)一步通過不同來源普魯蘭酶的同源序列比對，選定了8個堿性氨基酸位點，分別將其替換為酸性氨基酸以改變pKa值，最終獲得了催化最適pH值和耐酸性均提高的突變酶。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒與培養(yǎng)基

1.1.1 菌株 克隆宿主Escherichiacoli JM109：作者所在實驗室保藏；表達(dá)宿主E.coli BL21（DE3）：作者所在實驗室保藏。

1.1.2 質(zhì)粒 突變模板pET-28a-KvPUL來自實驗室保藏。

1.1.3 LB液體培養(yǎng)基 蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化鈉10 g/L。LB固體培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加入15 g/L的瓊脂粉。LB液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基在使用時加入卡那霉素至終質(zhì)量濃度為80 mg/L。

1.2 試劑與儀器

PrimeSTAR○RHS PCR酶、Dpn I限制性內(nèi)切酶、高相對分子質(zhì)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)、DNA marker、loading buffer、Competent Cell Preparation kit：購自TAKARA公司；Plasmid Mini Kit，Gel extraction kit：購 自 OMEGABIO-TEK公 司 ；BioSpinPCR Purification Kit：購自Bioer Technology公司；卡那霉素、IPTG：購自上海生工生物有限公司；酵母粉、蛋白胨：購自O(shè)xoid公司；Protein Assay Kit：購自碧云天生物技術(shù)研究所；普魯蘭多糖：購自日本Tokyo Kasei Kogyo公司。

DNA電泳儀、蛋白質(zhì)電泳儀：購自Bio-Rad公司；凝膠成像儀、PCR儀：購自Eppendorf公司；超凈工作臺：購自蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；核酸蛋白測定儀、酶標(biāo)儀：購自Thermo公司；高壓濕熱自動滅菌鍋5S-325：購自Tomy公司。

1.3 定點突變

參照Plasmid Mini Kit說明書，從作者所在實驗室保藏的E.coli BL21（DE3）/pET-28a-pul中提取質(zhì)粒作為飽和定點突變的模板。

定點突變采用大引物全質(zhì)粒PCR方法[15]，引物設(shè)計由上海生工生物有限公司合成，引物序列見表1。PCR反應(yīng)條件為：98℃預(yù)變性30 s，98℃10 s、68℃15 s、68℃9 min 30 s，共30個循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后，取4 μL反應(yīng)產(chǎn)物用1 g/dL瓊脂糖凝膠檢測。

表1 PCR擴(kuò)增引物Table 1 Primers for PCR amplification

DpnI內(nèi)切酶線性化處理：按照DpnI酶說明書配制反應(yīng)體系，于37℃下反應(yīng)5 min。消化后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E.coli JM109，測序由上海生工生物工程有限公司完成，測序驗證正確的重組質(zhì)粒再轉(zhuǎn)入E.coli BL21（DE3）。

1.4 重組菌的搖瓶發(fā)酵

挑取單菌落于100 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min下培養(yǎng)至 OD600達(dá)到 0.6~0.8，加入IPTG使終濃度達(dá)到0.4 mmol/L，轉(zhuǎn)入25℃、200 r/min下誘導(dǎo)培養(yǎng)20 h后停止培養(yǎng)，于4℃、10 000 r/min下離心10 min，收集上清液。

1.5 酶活力測定

酶活的測定參照Nair等[16]人報道的DNS法，并稍作修改。操作如下：用100 mmol/L、pH 5.0的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液對普魯蘭酶粗酶樣品稀釋到合適濃度，取100 μL普魯蘭酶稀釋液與等體積的底物（1%的普魯蘭多糖，pH 5.0）混合，混勻后置于50℃的水浴中精確計時反應(yīng)30 min。反應(yīng)結(jié)束立即向反應(yīng)混合物中加入300 μL的DNS試劑終止反應(yīng)，沸水浴處理10 min后，定容至2 mL，混合均勻后于540 nm處測定其吸光值。

酶活單位（U）的定義：一個酶活單位為每分鐘分解普魯蘭多糖生成相當(dāng)于1 μmol葡萄糖的還原糖所需的酶量。

酶活計算公式：

其中，n為稀釋倍數(shù)；109.89為葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；OD540反應(yīng)為實驗組在540 nm處的吸光值，OD540對照為對照組在540 nm處的吸光度，180為葡萄糖的相對分子質(zhì)量；30為反應(yīng)時間；0.1為稀釋后酶液的體積。

1.6 蛋白質(zhì)濃度的測定

參照ProteinAssayKit的說明書操作。以牛血清白蛋白作標(biāo)樣制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，取20 μL稀釋后的酶液與200 μL考馬斯亮藍(lán)G-250溶液，充分混勻，在595 nm下的吸光度值OD595，將吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算蛋白質(zhì)濃度。

1.7 野生型酶和突變酶的酶學(xué)特性比較

分別配制pH 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液，用不同pH值的緩沖液稀釋酶液和溶解底物，測定酶活，以最高酶活為100%，計算出不同pH下的相對酶活，從而得到最適反應(yīng)pH。

用pH 4.5的醋酸-醋酸鈉緩沖液稀釋酶液并于常溫下保存，每隔30分鐘取樣測定酶活，以未經(jīng)保存的酶液酶活為100%，計算剩余酶活。

配制不同質(zhì)量濃度的底物普魯蘭多糖（1、2、5、10、15 g/L），分別在不同底物濃度下測定反應(yīng)初速度，利用GraphPad Prism軟件進(jìn)行非線性擬合得到Km、kcat和Vmax值。

取稀釋到合適濃度的普魯蘭酶純酶液，分別在50、53、56、59、62、65℃下測定酶活。以最高酶活為100%，計算每個溫度下的相對酶活，從而得到最適反應(yīng)溫度。

1.8 普魯蘭酶的同源建模、結(jié)構(gòu)分析、同源序列比對

來自K.pneumoniae的普魯蘭酶的氨基酸序列與K.variicola SHN-1普魯蘭酶序列比對分析在http：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/進(jìn)行。比對結(jié)果在http：//espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi/進(jìn)行修飾。以來自K.pneumoniae的普魯蘭酶結(jié)構(gòu)為模板在SWISS-MODEL上模擬了K.variicola SHN-1普魯蘭酶的三維結(jié)構(gòu)。用分子三維結(jié)果顯示軟件PyMOL來顯示蛋白質(zhì)的模擬結(jié)構(gòu)并進(jìn)行相關(guān)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 基于位點構(gòu)效關(guān)系的突變酶設(shè)計

據(jù)文獻(xiàn)報道，改變酶活性中心及底物結(jié)合位點的pKa值，會使酶的最適pH發(fā)生遷移[11-13]。通過對普魯蘭酶活性中心的分析，確定了突變位點H626D、R756E、H852D、R908E四個突變點[17]。在普魯蘭酶的一級結(jié)構(gòu)中，幾乎所有的普魯蘭酶的編碼基因均包含有4個高度保守的區(qū)域（區(qū)域I-IV），見圖1。這些保守區(qū)域分別構(gòu)成了普魯蘭酶的活性中心、底物結(jié)合域和金屬離子結(jié)合域等。將來自K.variicola，K.pneumoniae，B.acidopullulyticus，B.naganoensis 的普魯蘭酶氨基酸序列進(jìn)行同源性比較，發(fā)現(xiàn)在保守區(qū)域，K.variicola和K.pneumoniae序列完全一致，而與另外兩種普魯蘭酶相比，K.variicola普魯蘭酶中619、723、850、851位點分別為 Ile、Phe、Ser、Lys，而B.acidopullulyticus和B.naganoensis的普魯蘭酶為Asn、Tyr、Thr、Ser，且B.acidopullulyticus是一種嗜酸菌，而B.naganoensis的普魯蘭酶的最適pH為4.5，要優(yōu)于K.variicola普魯蘭酶。所以對相應(yīng)位點進(jìn)行突變，構(gòu)建I619N、F723Y、S850T、K851S四個突變株。綜合以上分析，確定了 H626D、R756E、H852D、R908E、I619N、F723Y、S850T、K851S共8個突變位點。

圖1 不同微生物來源的普魯蘭酶序列比對Fig.1 Alignment of the amino acid sequence of pullulanase from different microorganisms

2.2 定點突變對普魯蘭酶催化最適pH值的影響

IPTG誘導(dǎo)20 h后，離心收集發(fā)酵上清液即為粗酶液。分別在pH 4.4、4.7、5.0、5.3、5.6的條件下測定野生型普魯蘭酶和突變酶的酶活，發(fā)現(xiàn)突變酶H852D的最適pH由5.0降低至4.7，而其他突變酶均沒有發(fā)生變化，突變酶R756E，R908E酶活喪失，見圖2。酶的最適反應(yīng)pH主要是由活性中心的pKa值決定的，并受底物與酶構(gòu)成的微環(huán)境里的各種作用力的影響。852位由堿性的組氨酸突變?yōu)樗嵝缘奶於彼岷?，降低了活性中心的pKa值，從而降低了普魯蘭酶的最適反應(yīng)pH。

圖2 野生型酶和突變酶的最適pHFig.2 Optimum pH of the wild-type enzyme and the mutants

2.3 定點突變對普魯蘭酶耐酸穩(wěn)定性的影響

糖化通常在pH 4.5~5.5的微酸性條件下進(jìn)行，因此要求普魯蘭酶在低pH條件下要有較高的穩(wěn)定性。作者在認(rèn)識突變位點對普魯蘭酶催化最適pH值影響的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步考察了定點突變對該酶耐酸穩(wěn)定性的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 野生型普魯蘭酶和突變酶在pH 4.5的穩(wěn)定性Fig.3 Stability of the wild-type enzyme and the mutants stored under pH 4.5

研究發(fā)現(xiàn)，突變酶K851S和H852D在低pH條件下的穩(wěn)定性均優(yōu)于野生型酶，其中突變酶H852D的相對活性隨保存時間變化較為平緩。野生型酶和突變酶動力學(xué)研究的結(jié)果表明，突變酶H852D與野生型酶的底物親和性及酶活力相差不大，其中H852D的Km值為7.14 mg/mL，野生型酶的Km值為7.44 mg/mL，說明將該酶852位組氨酸突變?yōu)樘於彼岷?，雖然改變了酶的催化最適pH值和耐酸性，但基本未影響其對底物的親和性和催化能力；而突變酶K851S的催化效率比野生型酶有所降低，其kcat/Km值由21.25 mg/（mL·s）變?yōu)?1.27 mg/（mL·s）。這些結(jié)果表明，由于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性以及從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)方面改造酶蛋白的局限性，單點突變對酶的催化效率可能會產(chǎn)生一定的影響。

2.4 定點突變對普魯蘭酶催化最適溫度的影響

蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系復(fù)雜，結(jié)構(gòu)上的改變除了會改變普魯蘭酶的耐酸性，可能也對普魯蘭酶的其它性質(zhì)產(chǎn)生影響，而普魯蘭酶在糖化中的應(yīng)用要求其應(yīng)具有較高的最適作用溫度。因此需要對突變酶的最適作用溫度進(jìn)行考察。在50、53、56、59、62、65℃下測定野生型普魯蘭酶和突變酶的酶活以考察其最適作用溫度，見圖4。所有突變酶和野生型酶具有相同的最適作用溫度，均為53℃，僅有突變酶F723Y的適宜作用溫度范圍變窄。其中，耐酸性提高的突變酶H852D的催化最適溫度與野生型酶相比，也沒有發(fā)生明顯變化，即耐酸穩(wěn)定性的改變并未引起催化最適溫度等其他性質(zhì)的改變，其較高的最適溫度和較低的最適pH使其更適合糖化工藝生產(chǎn)的需要。

圖4 野生型酶和突變酶的最適溫度Fig.4 Optimum temperature of the wild-type enzyme and the mutants

2.5 定點突變提高普魯蘭酶耐酸性的分析

經(jīng)過序列比對，K.variicola普魯蘭酶和K.pneumonia普魯蘭酶序列同源性高達(dá)98.57，因此以來自K.pneumoniae的普魯蘭酶結(jié)構(gòu)為模板在SWISS-MODEL上模擬了K.variicola SHN-1普魯蘭酶的三維結(jié)構(gòu)。與野生型酶相比，H852D與周圍的578Y和851K多形成了2個氫鍵，見圖5，從而增加了結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，獲得更高的耐酸性。但是由于活性中心的適當(dāng)柔性對催化作用有重要意義，活性中心的結(jié)構(gòu)剛性增強，影響了酶活性中心催化位點與底物分子及其他相應(yīng)位點的分子相互作用，因此突變酶的催化效率有所降低。

圖5 野生型酶與突變酶H852D的突變位點分子相互作用分析Fig.5 Molecular interaction analysis of the wild-type enzyme and the mutant H852D at theinvolved mutatedresidue

3 結(jié)語

普魯蘭酶能夠特異性水解普魯蘭、糖原、支鏈淀粉及其極限糊精中的α-1，6-糖苷鍵，在糖化過程中與糖化酶配合使用，能提高淀粉的利用率，節(jié)約生產(chǎn)成本，但是由于糖化過程具有高溫 （55~65℃）和弱酸（pH 4.5~5.5）的特點，所以大多數(shù)來源的普魯蘭酶并不適合工業(yè)應(yīng)用。為了提高K.variicola普魯蘭酶的耐酸性，使其適合糖化要求，可利用理性設(shè)計結(jié)合定點突變的方法對其進(jìn)行改造。

酶的最適pH主要是由活性中心的pKa值決定的，通過替換活性中心的氨基酸，降低pKa值，可以降低酶的最適pH值。而酶的穩(wěn)定性受酶蛋白分子內(nèi)部的各種作用力如氫鍵、二硫鍵、鹽橋、范德華力的影響，增加酶蛋白分子內(nèi)部的分子間作用力可以提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。通過將852位的組氨酸替換為天冬氨酸，該普魯蘭酶的最適pH值從5.0降低為4.7，且提高了普魯蘭酶在pH 4.5的穩(wěn)定性。突變酶H852D所引入的上述酶結(jié)構(gòu)與功能的改變，使該普魯蘭酶的酶學(xué)性質(zhì)與糖化酶的應(yīng)用工藝更加匹配，在糖化過程中添加普魯蘭酶能夠特異水解淀粉原料中的α-1，6-糖苷鍵，有利于使淀粉雙酶法生產(chǎn)葡萄糖的最高轉(zhuǎn)化率由單一使用糖化酶的95%左右提高到97%以上，從而實現(xiàn)提高生產(chǎn)效率、降低生產(chǎn)成本的目標(biāo)，該研究為進(jìn)一步提高普魯蘭酶的應(yīng)用性能、拓寬其應(yīng)用價值等方面奠定了基礎(chǔ)。

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Site-Directed Mutagenesis of Klebsiella variicola Pullulanase for the Improvement of Its Acid Resistance

MU Guocui1， NIE Yao*1， MU Xiaoqing1， XU Yan1，2， XIAO Rong3
（1.Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；3.The Center for Advanced Biotechnology and Medicine，Rutgers University，New Jersey 08854，USA）

By analyzing the active site of Klebsiella variicola SHN-1 pullulanase and alignment of the amino acid sequences of the pullulanases from K.pneumoniae，Bacillus acidopullulyticus and B.naganoensis，eight site-directed mutagenesis including H626D，R756E，H852D，R908E，I619N，F(xiàn)723Y，S850T，and K851S were subjected to improve the acid resistance of K.variicola pullulanase. After analysis of enzymatic properties，the optimum pH of H852D was shifted from 5.0 to 4.7，and its stability was obviously improved when stored at pH 4.5.By the analysis of homology modeling and structure of the pullulanase，the formation of two hydrogen bonds by single-site substitution was supposed to be responsible for the improvement of stability at low pH，and the change of pKa value in the active center of pullulanase caused the optimum pH migration.

pullulanase，site-directed mutagenesis，acid resistance，optimum pH value

Q 815

A

1673—1689（2016）12—1247—06

2015-02-03

國家自然科學(xué)基金項目（21376107、21336009）；國家863計劃項目（2011CB710800）；國家973計劃項目（2012AA022207）；高等學(xué)校學(xué)科創(chuàng)新引智計劃（111計劃）（111-2-06）；高端外國專家項目（GDW20133200113）；江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程項目。

*通信作者：聶 堯（1977—），男，河北石家莊人，工學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事酶工程方面的研究。E-mail：ynie@jiangnan.edu.cn