牛童　曾家豫　廖世奇　馬瑾　袁紅霞　馬梅蘭

·綜述·

免疫檢測技術及其研究進展

牛童曾家豫廖世奇馬瑾袁紅霞馬梅蘭

免疫檢測技術是一種以抗原抗體特異性識別和結合為原理對樣品中特定的目標物進行定性定量測定的分析方法，其在臨床醫(yī)學、現(xiàn)代生命科學、食品科學、生態(tài)學等領域發(fā)揮著重要作用。本文主要綜述近幾年應用比較廣泛的免疫學檢測方法及其研究近況。

免疫學檢測技術；酶標記；熒光素標記；放射免疫

1959年美國物理學家Berson和Yallow使用放射免疫檢測技術（Radioimmunoassay，RIA）檢測出血清中的微量胰島素，從而免疫檢測技術被引入分析化學界［1，2］。

免疫檢測技術的基本原理就是利用抗原與抗體之間的特異性和靈敏性反應，即以一種抗體或多種抗體作為反應的分析試劑［2，3］，進而對待測物進行定性及定量分析［2，4］。目前應用比較廣泛的免疫檢測方法有：免疫沉淀（immunoprecipitate，IP），分子印跡技術（molecular imprinting technique，MIT）［2］，酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA），免疫PCR［5］，免疫熒光技術（immunofluoreseence assay，IFA），免疫層析技術，免疫磁珠分離技術［6］，免疫傳感器（（immunosensor）［7］等。

1　免疫熒光技術

免疫熒光技術就是指用熒光色素對目標物標記后，再對其進行定性定量檢測的一種實驗技術［8］。其基本原理就是抗體和抗原發(fā)生特異性結合后，使用熒光顯微鏡對待測物進行觀察和鑒別。其基本操作步驟是先制備熒光標記物（熒光抗體或抗原），即在已知的抗體或者抗原上標記上相應的熒光素，再將這種熒光標記物（熒光抗體或抗原）注入到細胞內(nèi)部作為探針，當它們進入細胞后即可和細胞內(nèi)相應的抗原或抗體發(fā)生特異性結合，此時使用熒光顯微鏡來觀察標本是否能發(fā)出熒光，以此來對細胞內(nèi)相應的抗體或者抗原進行定位和檢測［6］。

在臨床應用中免疫熒光技術的作用方式主要有兩種，一種是放射免疫分析法，另一種是時間分辨免疫熒光分析法。競爭反應是放射免疫分析技術的主要利用原理，這種檢測方法曾被人認為是“最具發(fā)展?jié)摿Φ拿庖邫z測技術”［9］。時間分辨免疫熒光分析法能夠?qū)ν凰睾兔高M行標記。另外，其在試驗中所需試劑的存放時間較長，所需的實驗材料制作起來比較簡單，因此有人將它稱為“免疫檢測技術中的新成果”［10］。

隨著免疫熒光技術應用范圍的不斷擴大，其在免疫學、現(xiàn)代分子生物學、環(huán)境科學等領域都有所涉及［11］。另外，免疫熒光技術也在微生物學領域發(fā)揮著一定的作用，有人［12］已經(jīng)用免疫熒光技術快速檢測葡萄球菌、沙門氏菌、李斯特氏菌等細菌。

2　免疫層析技術（膠體金免疫層析技術）

免疫層析技術是免疫學上用于檢測分析的一種色譜分析方法。其利用的是抗原-抗體特異性吸附的原理，該技術操作簡單，能夠在較短的時間內(nèi)對待測物進行檢測。目前在免疫層析技術中，使用比較好的有膠體金免疫層析技術［13］。

膠體金免疫層析技術是一種將層析分析技術、膠體金標記技術、免疫檢測技術三者相結合的固相標記免疫檢測技術，其也是將抗原抗體反應和膠體金標記技術有機結合的一種應用形式，它是借助毛細作用使得以條帶狀固定在膜上的特異性抗原或抗體發(fā)生泳動，同時使得層析條帶上針對待測物的受體（如抗體或抗原）與樣品中的待測物發(fā)生高親和性、高特異性的免疫反應，層析反應過程中免疫復合物被截留或者富集在層析條的檢測帶區(qū)域，最后通過著色標記物或者利用酶促反應快速、直觀地檢測出待檢物質(zhì)。

膠體金免疫檢測技術廣泛應用于核酸、殺蟲劑、蛋白質(zhì)、激素、藥物和毒素等的檢測。如Boyle T［14］利用膠體金免疫檢測技術評價酸奶、巧克力、嬰兒配方奶粉、冰淇淋中的葡萄球菌中的腸毒素。

3　酶聯(lián)免疫吸附技術

酶聯(lián)免疫吸附技術（ELISA）是把酶的高效催化作用與抗原抗體的特異性反應有機結合起來的一種新型的免疫檢測技術，該方法既可以檢測抗體，也可以檢測抗原［15］。其基本原理就是先用酶標記抗體，再進行抗原抗體反應，最后酶通過分解底物而顯色，根據(jù)顏色的深淺來判斷待檢測的抗原和抗體的含量。ELISA主要有兩大類：傳統(tǒng)ELISA方法和新型ELISA方法［16］。傳統(tǒng)ELSIA法有：間接ELISA（I-ELISA）、固相競爭ELSIA（SC-ELISA）、間接夾心ELISA（IS-ELISA）等。新型ELISA法有：單克隆抗體ELISA（（McAb-ELISA）［17］、PT-PCR ELISA、Dot-ELISA［18］等。

ELISA法具有操作簡單、穩(wěn)定性好、特異性高、可大批量檢測樣品等優(yōu)點，因其檢測成本較低，故比較適合現(xiàn)場檢測，尤其適用于食品中微量過敏原的檢測。吳序櫟等人就曾利用雙抗體夾心法ELISA以其最低檢出限：40ng/ml檢測出了食品中蝦過敏原蛋白成分［19］。但是ELISA法也有其一定的局限性，如抗體制備難、無法進行多殘留檢測、對結構類的化合物存在一定的交叉反應［20］，另外實驗結果也會出現(xiàn)假陽性。

4　電化學免疫傳感器

電化學免疫傳感器［7］是免疫傳感器中種類最多、研究最早、也比較成熟的一種檢測技術。它是將電化學技術與免疫檢測技術相結合，用電化學信號來反應待檢測物質(zhì)的濃度，從而對待分析物進行分析測定的一種檢測方法，它由換能器（基本電極）和分子識別物質(zhì)（抗原、抗體）組成。因為其有不同的檢測方式，故將電化學免疫傳感器分為以下幾種類型：阻抗型、電容型、電位型、電流型。

4.1阻抗型免疫傳感器阻抗型免疫傳感器具有高度的特異性，它是通過阻抗譜對于傳感界面變化的靈敏度來檢測待測物的濃度的一種免疫檢測方法。Yang［21］等曾經(jīng)將葡萄糖氧化酶和HRP固定在納米材料上作為生物催化劑，催化過氧化氫氧化4-氯萘酚，建立了一種檢測甲胎蛋白的阻抗型免疫傳感器。

4.2電容型免疫傳感器電容型免疫傳感器的測量原理比較簡單，其建立依據(jù)主要有兩個方面：一個消耗離子所引起的溶液導電性變化，另一個是免疫生化反應的發(fā)生。表面電荷的改變和物質(zhì)的吸附對雙電層結構有顯著的影響。

4.3電位型免疫傳感器電位型免疫傳感器是通過測定抗原抗體特異性反應過程中電位的變化而進行免疫分析的一種檢測方式。因為檢測溶液的多離子性及其離子濃度之間的復雜性，該方法檢測的結果有較大的不確定性。

4.4電流型免疫傳感器電流型免疫傳感器是在電壓恒定的情況下測定抗原抗體特異性反應中電流變化的一種免疫檢測方式。主要有兩種類型：非酶標記性和酶標記型。

5　免疫磁珠分離技術

免疫磁珠是一種既能結合活性蛋白（如抗原、抗體）又能被磁力所吸引的磁性微球，其表面包被了各種化學基團，以使得可以和別的物質(zhì)發(fā)生結合。而免疫磁珠分離技術［6］的基本原理就是將包被有抗體的磁珠與致病微生物（如抗原）結合，形成抗原抗體復合物，而包被有抗原的磁性微球就會因磁力的吸引而發(fā)生聚集，從而使得致病微生物與抗體形成的復合物與其它物質(zhì)分開，以達到分離致病微生物的目的。國家檢驗標準《食品衛(wèi)生微生物學檢驗》已經(jīng)把免疫磁珠分離技術作為大腸桿菌O157:H7/MM的檢驗方法［22］。

6　分子印跡技術

分子印跡技術（MIT）是一種模擬抗原抗體反應合成特異性選擇識別位點的實驗技術［23］，其在固相萃取、有機合成、免疫傳感器等領域有著重要的應用前景［24］。

分子印跡技術也有一些缺陷，如在極性溶劑或水溶液中該技術依舊不能很好地應用。故該技術目前還是主要用于小分子化合物的檢測。

7　結語

免疫檢測技術在臨床醫(yī)學領域和生物學領域中發(fā)揮著極其重要的作用，這些方法雖然具有快速、靈敏度高等優(yōu)點，但也存在操作方法較繁瑣、信息量少、容易出現(xiàn)假陽（陰）性等缺點。如，電化學免疫傳感器因為其易于微型化、簡單、靈敏而曾被認為是AFP（甲胎蛋白）的有效檢測手段，但是迄今為止，它仍處于其發(fā)展的早期階段，未能得到廣泛使用。再如，膠體金免疫層析技術具有檢測結果直觀、快速、不需要特殊設備、無污染等優(yōu)點，適合于大面積普查和大批量檢測，非常適合于食品安全檢測，但是目前國內(nèi)市場上還沒有成型的膠體金免疫層析產(chǎn)品。

總的來說，大部分的免疫檢測技術仍處于其研究的初級階段，要使得這些技術能夠廣泛的使用，我們?nèi)孕枰诰_度和靈敏度的提高、操作的經(jīng)濟性和簡便性、穩(wěn)定性的保持等方面加強研究。我們相信，免疫檢測技術將不斷朝著簡單、靈敏、快速、標準的方向發(fā)展，為臨床醫(yī)學、生物學、食品科學、環(huán)境科學等領域做著極其重大的貢獻。

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