何莉莉，張興旺，王　平，張哲梅，居　軍

(1.甘肅衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院，甘肅蘭州 730000；2.甘肅省人民醫(yī)院檢驗(yàn)中心，甘肅蘭州 730000)

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·臨床研究·

甘肅地區(qū)乙型肝炎病毒基因型分布研究*

何莉莉1，張興旺2，王平2，張哲梅2，居軍2

(1.甘肅衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院，甘肅蘭州 730000；2.甘肅省人民醫(yī)院檢驗(yàn)中心，甘肅蘭州 730000)

摘要:目的分析甘肅地區(qū)乙型肝炎病毒(HBV)的基因型分布。方法采用型特異性引物-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(SSP-PCR)技術(shù)對(duì)300例HBV DNA陽性患者進(jìn)行HBV基因分型。結(jié)果在300份血清標(biāo)本中，279份標(biāo)本被成功分型，其中基因型B 59份，占19.7%；基因型C 169份，占56.3%；混合基因型B/C 47份，占15.7%；混合基因型C/D 4份，占1.3%；未確定型別21份，占7.0%。不同基因型HBV感染患者間性別、年齡分布及丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；B型HBV感染患者乙型肝炎e抗原(HBeAg)陽性率(40.7%)略高于C型患者(35.5%)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論甘肅地區(qū)HBV基因型包括B、C、B/C、C/D型，其中C型為優(yōu)勢(shì)基因型。

關(guān)鍵詞:乙型肝炎病毒；基因型；特異性引物；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

乙型肝炎病毒(HBV)基因型的分布具有明顯的種族和地域性差異，我國(guó)主要以B、C型感染為主，其中北方以C基因型為主，南方以B基因型為主。而甘肅省位于我國(guó)西北地區(qū)，屬于HBV感染高流行區(qū)，其HBV基因型分布值得關(guān)注。本研究旨在分析甘肅地區(qū)HBV基因型的構(gòu)成情況，為指導(dǎo)臨床病情分析及治療提供理論依據(jù)。

1資料與方法

1.1一般資料2008年6月至2011年7月甘肅省人民醫(yī)院肝病和消化科門診、住院患者及甘肅省腫瘤醫(yī)院患者共300例，HBV DNA定量檢測(cè)均為陽性，其中男220例、女80例，年齡15～70歲，40%來自甘肅省蘭州市，60%來自甘肅省除蘭州市以外的地區(qū)。納入的所有患者診斷均符合2000年第10次全國(guó)(西安)病毒性肝炎會(huì)議修訂的病毒性肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]，均排除其他病毒性肝炎及自身免疫性肝炎。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集與處理抽取受檢者靜脈血2 mL，室溫放置30 min自然凝固，3 000 r/min離心10 min，離心半徑為8 cm，吸取血清，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2HBV DNA的定量檢測(cè)HBV DNA定量檢測(cè)采用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，于LightCycler熒光定量PCR儀(德國(guó)羅氏公司)上檢測(cè)；定量結(jié)果大于1.00×103copies/mL則判為陽性。核酸擴(kuò)增和溫度循環(huán)條件設(shè)置嚴(yán)格按照廠商試劑說明書進(jìn)行。

1.2.3HBV血清學(xué)標(biāo)志物(HBV-M)的檢測(cè)HBV-M檢測(cè)采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)，乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎表面抗體(HBsAb)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)、乙型肝炎e抗體(HBeAb)、乙型肝炎核心抗體(HBcAb)檢測(cè)使用上?？迫A公司試劑在全自動(dòng)酶免分析儀(瑞士Tecan公司)上運(yùn)行測(cè)試，反應(yīng)程序設(shè)置嚴(yán)格按照廠商試劑說明書進(jìn)行，同時(shí)做室內(nèi)質(zhì)控。

1.2.4HBV基因分型采用特異性引物-PCR(SSP-PCR)技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，引物參考文獻(xiàn)[2]方法，根據(jù)前S1基因到S基因中的保守序列設(shè)計(jì)出10條引物，其中2條外引物，8條內(nèi)引物，包含6種基因型。每條內(nèi)引物具有型特異性，使得各種基因型PCR產(chǎn)物大小各不相同。所用引物序列見表1，由上海生工生物科技有限公司合成。

1.2.5HBV DNA的提取取待測(cè)HBV血清標(biāo)本各100 μL，加入100 μL核酸提取液A，振蕩混勻15 s，1 300 r/min離心10 min，棄上清。再加入50 μL核酸提取液B至沉淀中，振蕩混勻10 s，100 ℃保溫10 min，13 000 r/min離心2 min，取上清液作為PCR擴(kuò)增的模板。

1.2.6PCR擴(kuò)增反應(yīng)(1)以HBV DNA為模板，用外引物P1與P2進(jìn)行第1輪PCR。PCR反應(yīng)體系(25 μL)如下：Taq預(yù)混酶12 μL，50 pmol/μL上、下游引物各0.5 μL，模板DNA 2 μL，雙蒸水10 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，51 ℃退火30 s，68 ℃延伸1 min，循環(huán)30次；68 ℃延伸10 min，結(jié)束反應(yīng)。同時(shí)以蒸餾水為模板擴(kuò)增作為陰性對(duì)照。(2)以第1輪PCR產(chǎn)物為模板，分別以A組引物(B2、BA1R、BB1R、BC1R)和B組引物(B2R、BD1、BE1、BF1)為內(nèi)引物進(jìn)行第2輪PCR，檢測(cè)HBV DNA基因型A、B、C、D、E、F。PCR反應(yīng)體系(25 μL)如下：Taq預(yù)混酶12 μL，50 pmol/μL上、下游引物各0.5 μL，模板DNA 2 μL，雙蒸水10 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)30次；72 ℃延伸10 min，結(jié)束PCR反應(yīng)。同時(shí)以蒸餾水為模板擴(kuò)增作為陰性對(duì)照。

1.2.7基因型的判斷將第2輪PCR產(chǎn)物分別在1.5%瓊脂糖中進(jìn)行電泳后，在紫外凝膠成像系統(tǒng)拍照，根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小來判斷基因型。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行比較分析，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1HBV基因型的構(gòu)成在300份血清標(biāo)本中，279份標(biāo)本被成功分型，其中基因型B 59份，占19.7%；基因型C 169份，占56.3%；混合基因型B/C 47份，占15.7%；混合基因型C/D 4份，占1.3%；未確定型別21份，占7.0%?；駽型所占百分比高于其他3種基因型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。隨機(jī)選取基因B、C 型各5份樣品及混合基因型C/D 4份樣品，均送至大連寶生物工程有限公司進(jìn)行S序列測(cè)序，結(jié)果完全符合。

2.2分型成功的標(biāo)本來源患者特征不同基因型HBV感染患者間性別、年齡分布及丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；B基因型患者HBeAg陽性率(40.7%)略高于C基因型患者(35.5%)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3討 論

筆者采用SSP-PCR對(duì)甘肅地區(qū)HBV進(jìn)行基因型鑒定，在300份血清標(biāo)本中，279份標(biāo)本被成功分型，基因型B 59份，占19.7%；基因型C 169份，占56.3%；混合基因型B/C 47份，占15.7%；混合基因型C/D 4份，占1.3%；未確定型別21份，占7.0%；未發(fā)現(xiàn)基因型A、E、F存在。結(jié)果說明甘肅地區(qū)和全國(guó)HBV基因型分布相似，也是以B、C型為主，且兩者中C型所占百分比更高，基因C型為優(yōu)勢(shì)基因型，這與我國(guó)有關(guān)HBV基因型的報(bào)道一致[3-4]。本研究還發(fā)現(xiàn)了4例HBV混合基因型C/D感染患者，這可能與甘肅地區(qū)的地理位置及少數(shù)民族的存在有一定關(guān)系。混合基因型B/C和C/D的存在，可能原因是HBV感染者免疫功能低下而獲得了二次感染，這有待進(jìn)一步研究。此外，21例患者未確定基因型別，可能原因分析如下：(1)可能為G或H型；(2)近年來乙型肝炎治療中新型抗病毒藥物的應(yīng)用導(dǎo)致病毒發(fā)生基因突變，而本試驗(yàn)所用引物不適用于突變基因的檢測(cè)；(3)樣品在采集和保存過程中DNA降解。具體原因仍有待于進(jìn)一步研究。

在本研究中,不同基因型HBV感染患者間性別、年齡分布及ALT水平比較均無明顯差異。B、C基因型HBV感染患者HBeAg陽性率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),與國(guó)內(nèi)學(xué)者報(bào)道存在差異[5]。隨著研究的深入,越來越多的研究表明HBV基因型與乙型肝炎的發(fā)病機(jī)制、疾病轉(zhuǎn)歸、抗病毒療效有密切關(guān)系[6-10]。但是，目前關(guān)于HBV基因型與HBeAg陽性率、HBV DNA載量、發(fā)病年齡及肝功能指標(biāo)相關(guān)性的研究結(jié)論不完全一致，尚無定論。除HBV基因型，HBV感染后疾病進(jìn)程及轉(zhuǎn)歸還與抗病毒治療、機(jī)體免疫狀態(tài)及宿主遺傳因素等密切相關(guān)，而HBV基因型只是影響疾病進(jìn)程的重要因素之一。

綜上所述，甘肅地區(qū)慢性乙型肝炎基因型分布構(gòu)成包括B、C、B/C和C/D混合型，其中基因C型為優(yōu)勢(shì)基因型，符合我國(guó)北方城市HBV基因型的流行病學(xué)特征。下一步筆者將擴(kuò)大樣本量，進(jìn)行基因亞型和不同基因型的乙型肝炎患者轉(zhuǎn)歸相關(guān)性研究，為甘肅地區(qū)的乙型肝炎防治提供更多的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

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基金項(xiàng)目：甘肅省技術(shù)研究與開發(fā)專項(xiàng)計(jì)劃項(xiàng)目(0709TCYA025)。

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.05.028

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1673-4130(2016)05-0647-02

(收稿日期：2015-09-20)