尹逸叢 綜述,邱 玲 審校

(北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科 100730)

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·綜 述·

糖化清蛋白的診斷優(yōu)勢及其檢測現(xiàn)狀

尹逸叢 綜述,邱 玲△審校

(北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科 100730)

糖化清蛋白； 糖尿病； 標(biāo)準(zhǔn)化

糖尿病已經(jīng)成為全球威脅人類健康的三大慢性非傳染性疾病之一。目前，糖尿病患病率、發(fā)病率和糖尿病患者數(shù)量急劇上升，根據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟(IDF)統(tǒng)計，2012年全世界糖尿病患者人數(shù)已經(jīng)達到3.71億[1]。近30年來，隨著我國經(jīng)濟的高速發(fā)展、生活方式西方化和人口老齡化，肥胖率上升，糖尿病患病率也呈快速增長趨勢；2010年全國31省市18歲以上9萬余人口的糖尿病調(diào)查顯示成年人糖尿病患病率達9.65%[2]。2013年，中國研究人員在《美國醫(yī)學(xué)會雜志》(JAMA)發(fā)表報告[3]，其調(diào)查顯示中國已成為糖尿病人口大國，成人糖尿病患者數(shù)量估計超過1億，可能已達“警戒級別”。

糖尿病人群不斷增多，對中國社會與公共衛(wèi)生構(gòu)成挑戰(zhàn)，給社會經(jīng)濟帶來了沉重的負(fù)擔(dān)，是嚴(yán)重威脅人類健康的世界性公共衛(wèi)生問題。糖尿病引起的長期碳水化合物及脂肪、蛋白質(zhì)代謝紊亂可引起多系統(tǒng)損害，增加心臟病、中風(fēng)、腎病、失明乃至截肢的風(fēng)險[4]，降低患者生活質(zhì)量，病死率高。因此，對于糖尿病的早期發(fā)現(xiàn)、有效防治有利于提高國人的生活質(zhì)量，減輕患者及國家經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。近年來，糖化清蛋白(GA)逐漸受到研究者及臨床的重視，被用來輔助診斷貧血、妊娠、血紅蛋白(Hb)代謝異?；颊唧w內(nèi)真實血糖水平。

GA比血糖相對穩(wěn)定，不受短期生活方式影響；比糖化血紅蛋白反映周期短；與糖化血清蛋白相比不受血液中蛋白濃度、膽紅素、乳糜和低分子物質(zhì)等影響。在診斷糖尿病方面具有十分重要的價值和優(yōu)勢。因此，GA有望成為今后糖尿病監(jiān)測的重要指標(biāo)。本文主要闡述了GA的基本結(jié)構(gòu)、在診斷糖尿病方面的優(yōu)勢及其檢測現(xiàn)狀。

1 GA的結(jié)構(gòu)

GA是葡萄糖與血漿清蛋白發(fā)生非酶糖化反應(yīng)的產(chǎn)物，反映糖尿病患者過去2～3周的平均血糖水平。

非酶糖化反應(yīng)也被稱為Maillard反應(yīng)，是指蛋白質(zhì)中氨基酸的N末端氨基或側(cè)鏈氨基與葡萄糖及其衍生物的醛基縮合,產(chǎn)生可逆的Schiff堿中間體，經(jīng)Amadori反應(yīng)重排后形成相對穩(wěn)定的糖基化產(chǎn)物-果糖胺，即Amadori產(chǎn)物。Amadori產(chǎn)物降解產(chǎn)生的各種高度活性的羰基化合物,再與其他游離氨基基團反應(yīng),并經(jīng)過一系列的化學(xué)重排和脫水反應(yīng),生成不可逆的糖基化終產(chǎn)物(AGEs)[5]。

血清中清蛋白濃度比較高(3.0～5.0 g/dL)，大約占血清蛋白的60%，清蛋白在調(diào)節(jié)滲透壓和pH及抗氧化方面具有十分重要的作用；它還是一種轉(zhuǎn)運蛋白，可以結(jié)合多種激素、磷脂、藥物和鐵離子。清蛋白相對分子質(zhì)量為66 438，包括585個氨基酸殘基。大量的研究已經(jīng)證實了清蛋白發(fā)生非酶糖基化的主要位點，其賴氨酸、精氨酸和半胱氨酸由于其高度親核特性，很容易被糖基化。研究證實，Lys-525是人血清清蛋白在體內(nèi)發(fā)生非酶糖基化最主要的位點，在健康人體內(nèi)該位點發(fā)生非酶糖基化反應(yīng)的水平占總糖基化反應(yīng)的48%，在血糖水平不穩(wěn)定的患者體內(nèi)該位點發(fā)生非酶糖基化反應(yīng)的水平占總糖基化反應(yīng)的33%[6-8]。除此之外，賴氨酸的其他位點Lys-199、Lys-281、Lys-489也是賴氨酸發(fā)生糖基化的主要位點，但是其糖基化水平遠(yuǎn)低于Lys-525，如Lys-199僅占總糖基化水平的5%[8]。由于賴氨酸糖基化位點眾多，在總糖基化水平中所占比例高，所以日本臨床化學(xué)糖尿病委員會定義GA為血清/血漿清蛋白中糖基化的賴氨酸[9]。

2 GA與其他血糖監(jiān)測方法相比的優(yōu)勢

目前對糖尿病的檢測項目主要為血糖、糖化血紅蛋白和糖化血清蛋白[10]。即刻血糖的檢測容易受到藥物、飲食、情緒等因素的影響，其檢測結(jié)果只能代表采樣當(dāng)時的血糖情況，對診斷糖尿病尤其是治療過程中監(jiān)測患者的病情有很大的局限性。而且，空腹血糖要求個體空腹8 h，對于早餐后或下午就診的患者可操作性差。雖然口服葡萄糖耐量試驗(OGTT)也可以用來診斷糖尿病，但是OGTT實驗過程繁瑣，耗時，變異性大，故臨床使用率低。

糖化血紅蛋白A1c(HbA1c)是HbA的b鏈N-末端纈氨酸的氨基與葡萄糖的羧基發(fā)生非酶促反應(yīng)形成不穩(wěn)定的Schiff堿，進一步通過轉(zhuǎn)位、分子重排形成穩(wěn)定的酮胺，即HbA1c。因紅細(xì)胞的半衰期為120 d，故HbA1c可有效地反映患者過去2～3個月內(nèi)的平均血糖水平，且不受空腹及胰島素治療的影響，變異性小。Petersen等[11]發(fā)現(xiàn)，不同個體的空腹血糖日間變異率約12%～15%，而HbA1c僅約為1.9%。HbA1c測定更加便捷、可以在任意時間采血，其準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性、可重復(fù)性高。目前，HbA1c是國際上監(jiān)測長期血糖控制的金指標(biāo)。但是HbA1c的測定結(jié)果仍然受多種因素的影響：多種血紅蛋白病，如血紅蛋白S、血紅蛋白C、血紅蛋白D、血紅蛋白E等血紅蛋白的存在會干擾HbA1c的檢測[12]；妊娠也是影響HbA1c測定結(jié)果的因素之一，Rafat等[13]發(fā)現(xiàn)糖尿病患者在孕期由于鐵缺乏導(dǎo)致HbA1c水平升高，不能真實反映血糖控制狀態(tài)，而此時GA則可反映血糖控制情況。故GA可對初診糖尿病患者和妊娠糖尿病患者的短期治療效果做出較為準(zhǔn)確的估計，從而有助于調(diào)整臨床治療方案及判斷病情；此外，紅細(xì)胞病理性改變?nèi)缛苎载氀?、腎衰竭、大量失血或輸血將導(dǎo)致HbA1c結(jié)果不準(zhǔn)確[14]；飲食和藥物，如抗氧化劑(VC、VE等)能抑制血紅蛋白的糖基化，阿司匹林能使HbA1c輕微升高；尿毒癥、高膽紅素血癥、高三酰甘油血癥、阿片類藥物等都會干擾HbA1c的檢測[15]。而GA由于半衰期為19 d，可反映患者近2～3周內(nèi)的血糖水平，對血糖值的變化較HbA1c更為靈敏，在反映近期內(nèi)血糖的漂移變化及餐后血糖控制情況方面優(yōu)于HbA1c。而且GA的檢測不受血紅蛋白病、妊娠、紅細(xì)胞壽命改變等影響。因此，測定GA對準(zhǔn)確評價血紅蛋白代謝異常、妊娠貧血患者體內(nèi)真實血糖水平具有重要意義。

糖化血清蛋白是測量血清中各種蛋白質(zhì)、氨基酸的糖化值，其主要成分是GA，還包括糖化球蛋白、脂蛋白等，反映測定前2～3周血糖的平均水平；但其測定結(jié)果反映血清中總的糖化血清蛋白質(zhì)(包括清蛋白與其他蛋白分子)，易受血液中蛋白濃度、膽紅素、乳糜和低分子物質(zhì)等的影響[16]。而GA的測定是在糖化血清蛋白的基礎(chǔ)上，利用GA與血清清蛋白的百分比表示GA的水平，去除了血清清蛋白水平對檢測結(jié)果的影響，故較糖化血清蛋白更精確[17-18]。

3 GA的測量方法

GA的檢測方法包括比色法、色譜分析法、免疫分析法、酶法等。

3.1 比色法 硫代巴比妥酸法(TBA)是測量酮胺的經(jīng)典比色法，是基于清蛋白釋放的5-羥甲基糠醛(HMF)可以和硫代巴比妥酸發(fā)生顯色反應(yīng)。氮藍四唑(NBT)是另一種對酮胺進行定量檢測的比色法，NBT和酮胺釋放的甲瓚發(fā)生還原反應(yīng)，通過測定吸光度來對酮胺進行定量檢測。然而這兩種比色法都存在缺陷，且特異性不高。TBA法中形成的HMF具有熱不穩(wěn)定性，游離的葡萄糖也會干擾此反應(yīng)；NBT法容易受到巰基、尿酸、脂血的干擾[19]；苯胺加合物定量方法通過果糖胺和苯肼反應(yīng)來對GA定量，但是這種方法并未應(yīng)用于臨床實驗室。

3.2 色譜分析法 色譜分析法是對GA進行定量測定的一種方法，色譜分析法不受清蛋白濃度的影響。高效液相色譜法(HPLC)可以對GA中的糖基化的氨基酸進行定量檢測，該法通過陰離子交換色譜柱提取純度較高的清蛋白，再經(jīng)親和層析法分離糖化的清蛋白和非糖化的清蛋白[20]。清蛋白中的果糖胺產(chǎn)物經(jīng)過水解和脫水，生成糠氨酸，液相色譜法可以直接對糠氨酸進行定量檢測，和比色法相比該法的特異性更高。但是HPLC法的檢測速度為12例標(biāo)本/小時，無法滿足大量的臨床標(biāo)本檢測[21]。

3.3 免疫分析法 硼酸鹽酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)其原理是酶聯(lián)的硼酸鹽可以和GA-抗人血清清蛋白抗體的復(fù)合物發(fā)生反應(yīng)，但是GA的水平會受到抗體特異性的影響，應(yīng)用這種方法時需要考慮抗體的化學(xué)位阻效應(yīng)及硼酸鹽的特性[21]。

3.4 酶法 目前，臨床檢測廣泛應(yīng)用的是酶法，酶法試劑盒使用方便。該方法應(yīng)用清蛋白特異的剪切酶包括蛋白酶、酮胺氧化酶及溴甲酚紫試劑對GA進行定量檢測，是一種很敏感的方法。由于所受干擾少，酶法與比色法相比能更準(zhǔn)確地對GA進行定量。酶法的基本原理是：首先加入酮胺氧化酶(KAOD)消除內(nèi)源性糖化氨基酸，其次用清蛋白特異性的蛋白酶將GA轉(zhuǎn)變?yōu)樘腔被?，生成的糖化氨基酸在KAOD的作用下生成葡萄糖酮醛，氨基酸和過氧化氫，過氧化氫在過氧化物酶(POD)的作用下定量地變換成有色物質(zhì)，通過測定吸光度而定量從GA生成的糖化氨基酸。

但是各個廠家對血清的處理方法并不統(tǒng)一，經(jīng)前期調(diào)研發(fā)現(xiàn)，有些廠家并沒有消除內(nèi)源性糖化氨基酸這一步驟，還有一些廠家直接測定糖化血清蛋白的值，并以此來代替GA。而且各個廠家的酶法試劑盒在定值方面并不一致，部分廠家采用了測定清蛋白之后采用一定的公式將GA的結(jié)果轉(zhuǎn)換成GA%，而另一部分則是直接測定GA值。另外，各個廠家GA的單位也不一致，有些廠家采用g/dL、g/L，有的廠家則采用μmol/L。不同廠家酶法試劑盒間的巨大差異和參考范圍的不一致必然會導(dǎo)致結(jié)果間的巨大差異，導(dǎo)致錯誤的醫(yī)學(xué)決定，限制該項目在臨床發(fā)揮其重要作用，因此，亟須實現(xiàn)GA檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確、可比。

4 GA的標(biāo)準(zhǔn)化現(xiàn)狀

實現(xiàn)檢驗結(jié)果準(zhǔn)確的最有效手段是建立和保證檢驗結(jié)果的溯源性。對于臨床檢驗量值溯源的簡單理解就是應(yīng)用參考系統(tǒng)，即用參考測量程序或參考物質(zhì)建立或驗證常規(guī)檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。但是GA作為大相對分子質(zhì)量且成分復(fù)雜的蛋白質(zhì)，其參考系統(tǒng)的建立一直未有突破性進展。美國的4家商業(yè)性參考實驗室曾推薦硼酸鹽親和層析法作為參考方法，但是文獻[22]稱應(yīng)用親和層析法檢測GA的結(jié)果存在正常人和糖尿病患者交叉的現(xiàn)象，正常個體的GA值范圍為0.6%～8.6%，糖尿病患者的GA值范圍為1.4%～16.5%。并且可能受到其他的糖化分子的影響，導(dǎo)致檢測結(jié)果并不準(zhǔn)確。隨著質(zhì)譜(MS)技術(shù)的發(fā)展，2015年日本臨床化學(xué)學(xué)會(JSCC)將GA定義為清蛋白分子中所有的糖化賴氨酸，利用同位素稀釋質(zhì)譜法(ID-MS)建立了GA測定的候選參考方法并研制了GA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)JCCRM611-1[23]。JSCC將GA定義為清蛋白分子中所有的糖化賴氨酸，用所有糖化賴氨酸占清蛋白的摩爾比來表示GA的量。但是該方法操作步驟復(fù)雜，對設(shè)備要求較高，并且無商品化的同位素標(biāo)記GA。至今，西方國家及中國均未建立合適的參考方法及GA參考物質(zhì)。然而，GA在中國臨床應(yīng)用非常廣泛，但是由于標(biāo)準(zhǔn)的不統(tǒng)一、結(jié)果一致性差，應(yīng)用較為混亂。因此，GA參考系統(tǒng)的建立仍有很長的路要走。

基于上述分析，GA在貧血、妊娠、血紅蛋白代謝異常等糖尿病患者的監(jiān)測中發(fā)揮著重要作用。若將GA納入糖尿病的診斷標(biāo)準(zhǔn)，勢必會提高糖尿病患者的篩查、診斷、監(jiān)測和治療水平。如同糖化血紅蛋白和膽固醇這兩項監(jiān)測指標(biāo)，GA必須在實現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化之后才有可能被列入國際指南中[24-25]。因此，建立GA參考系統(tǒng)，促進GA測定方法的標(biāo)準(zhǔn)化和一致化的工作亟待提上日程。

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10.3969/j.issn.1673-4130.2016.24.027

A

1673-4130(2016)24-3456-03

2016-06-23

2016-09-29)

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