柯月嬌, 黃桂華, 張?zhí)K娜, 聶正晴, 余麗雙, 李 琦

(福建中醫(yī)藥大學藥學院, 福建省中藥學重點實驗室， 福建 福州 350122)

非水毛細管電泳法測定山莨菪中4種莨菪烷類生物堿

柯月嬌, 黃桂華, 張?zhí)K娜, 聶正晴, 余麗雙, 李 琦

(福建中醫(yī)藥大學藥學院, 福建省中藥學重點實驗室， 福建 福州 350122)

通過考察電泳分析條件對山莨菪中莨菪烷類生物堿分離和測定的影響， 建立中藥材山莨菪中阿托品、 山莨菪堿、 東莨菪堿和樟柳堿4種莨菪烷類生物堿非水毛細管電泳分析(NACE)的新方法. 結果表明， 在分離電壓為28 kV、 檢測波長210 nm， 緩沖體系為40 mmol·L-1Tris溶液(水 ∶甲醇 = 1 ∶3， 體積比， pH=7.0)的條件下， 4種組分在7.5 min內實現基線分離， 阿托品在5～70 μg·mL-1、 樟柳堿在5～30 μg·mL-1、 山莨菪堿和東莨菪堿在2～25 μg·mL-1的濃度范圍內均具有良好的線性關系， 檢測限分別達到0.45、 0.5、 1.0、 0.8 μg·mL-1. 該方法用于山莨菪中莨菪烷類生物堿的測定， 結果令人滿意.

非水毛細管電泳； 山莨菪； 阿托品； 山莨菪堿； 東莨菪堿； 樟柳堿

0 引言

山莨菪(Anisodustanquticus(Maxim) Pascher)為多年生茄科山莨菪屬草本植物， 又名唐古特山莨菪、 樟柳， 是我國的特有植物, 也是較常用藏藥品種， 主要分布在甘肅、 西藏、 云南、 青海等地， 生長在中高海拔的土坡、 河灘及避風向陽的山谷. 其性溫， 味辛、 甘， 有毒， 主要含有山莨菪堿、 莨菪堿、 東莨菪堿、 樟柳堿、 紅古豆堿等多種生物堿， 有解痙、 鎮(zhèn)痛、 催眠作用， 常用于急性腸炎、 紅腫疔毒、 潰瘍病跌打損傷、 惡瘡腫痛等癥的治療， 對暴發(fā)型流行性腦脊髓膜炎、 中毒型痢疾等疾病的治療有非常顯著的療效[1-2].

山莨菪是提取莨菪烷類生物堿的重要中藥資源植物， 同時也是國家二級重點保護野生植物， 采摘受到限制. 為了提高其產量， 現多以人工引種栽培品種為主. 而隨著人工栽培產量的提高， 對人工種植山莨菪進行質量控制， 特別是對其中主要生物堿的快速測定成為必要. 已報道文獻中大多是用高效液相色譜法[3-4]對山莨菪中生物堿的含量進行測定， 也有用毛細管電泳-電化學發(fā)光法(CE-ECL)測定其中2種生物堿(樟柳堿和山莨菪堿)[5]、 用區(qū)帶毛細管電泳(CZE)對莨菪浸膏片中的生物堿[6]及用涂層毛細管電泳法對洋金花中3種生物堿[7]進行分離的報道， 尚未發(fā)現有使用非水毛細管電泳法(NACE)對山莨菪中4種莨菪烷類生物堿同時進行分析測定的報道. 由于使用非水溶劑作為電泳介質， NACE除了具有CE法本身高效、 快速、 簡便等特點外， 更有利于對在水中不穩(wěn)定的物質和疏水化合物的分析.

采用以甲醇為溶劑的NACE法同時分離測定山莨菪中阿托品、 山莨菪堿、 東莨菪堿和樟柳堿4種莨菪烷類生物堿. 實驗發(fā)現這4種生物堿在非水溶液中具有更好的穩(wěn)定性， 而且用NACE法進行分析具有更低的檢測限， 更有利于山莨菪中生物堿的分析， 可為該藥材種植過程中的質量控制提供參考.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

BECKMAN P/ACETMMDQ毛細管電泳儀(美國貝克曼公司， 配備DAD二極管陣列檢測器)； 未涂層彈性石英毛細管， 50 cm × 75 μm(id)， 有效長度40 cm(永年銳灃色譜器件有限公司)； 雷磁PHS-3C精密pH計(上海精密科學儀器有限公司)； Sartorius DS110S電子天平(北京賽多利斯天平有限公司)； KQ-500E超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司).

硫酸阿托品對照品(卡邁舒生物科技有限公司)； 氫溴酸東莨菪堿對照品(上海遠慕生物科技有限公司)； 氫溴酸山莨菪堿、 氫溴酸樟柳堿對照品(中國食品藥品檢定研究院)； Tris試劑(Solarbio)； 硼砂、 磷酸等均為分析純(上海聯試化工試劑有限公司)； 甲醇為優(yōu)級純(國藥集團化學試劑有限公司)； 所用水均為超純水； 山莨菪藥材(青海西寧三江寶商貿公司藏蒙藥材商行).

1.2 對照品溶液的配制

精密稱取4種生物堿對照品各5.0 mg， 用甲醇配制成質量濃度各為1.0 mg·mL-1的對照品儲備液， 密閉置于4℃下避光保存， 實驗時用75%(體積分數， 以下同)甲醇稀釋至所需濃度.

1.3 樣品溶液的制備

山莨菪藥材中生物堿的提取與制備： 精密稱取山莨菪粉末(過粒徑270 μm篩)1 g， 置具塞錐形瓶中， 1.5 mL濃氨濕潤后， 加入30 mL氯仿， 放置24 h； 濾過， 收集濾液并補足至30 mL. 取濾液5 mL， 回收溶劑至干， 殘渣用75%甲醇溶解， 轉移至10 mL量瓶中， 75%甲醇定容至刻度， 搖勻， 用0.45 μm微孔濾膜過濾并脫氣， 即得山莨菪樣品溶液.

1.4 電泳條件

未涂層石英毛細管(50 cm × 75 μm)， 檢測波長210 nm， 溫度25 ℃， 分離電壓28 kV， 壓力進樣3.5 kPa×8 s， 緩沖溶液40 mmol·L-1Tris-75%甲醇(pH=7.0). 毛細管柱使用前分別用超純水、 0.1 mol·L-1的NaOH、 超純水和緩沖液各沖洗5、 10、 10、 5 min, 每次進樣前用電泳緩沖液沖洗3 min; 實驗結束后用0.1 mol·L-1的NaOH、 超純水各沖洗10 min.

2 結果與討論

2.1 檢測波長的選擇

將4種生物堿對照品溶液在200～300 nm范圍內進行紫外光譜掃描， 從圖1所示的光譜圖中可以觀察到山莨菪堿、 東莨菪堿、 樟柳堿和阿托品的最大吸收波長分別為208、 206、 203、 205 nm. 實驗時通過二極管陣列檢測器同時檢測記錄它們在200、 205、 210 nm波長下的電泳譜圖. 分析并比較測定結果后發(fā)現在210 nm處， 4種生物堿均能產生較強的紫外吸收并且干擾小， 同時也有較高檢測靈敏度， 故選擇210 nm為檢測波長.

2.2 緩沖體系的選擇

實驗考察了硼酸鹽-甲醇、 乙酸鹽-甲醇和Tris-甲醇三種緩沖體系. 結果表明： 緩沖體系為硼酸鹽-甲醇時， 樣品組分無法分離且電流不穩(wěn)定； 緩沖體系為乙酸鹽-甲醇時， 體系不穩(wěn)定； 而緩沖體系為Tris-甲醇時， 對分析物的總體分離效果均優(yōu)于前兩者， 可能原因是Tris體系具有更低的電子遷移率， 整個體系更穩(wěn)定， 故選擇Tris-甲醇為緩沖體系.

2.2.1 緩沖溶液濃度的影響

緩沖溶液濃度會影響分析物質的遷移時間， 進而影響分離度. 實驗選定Tris-甲醇體系后， 考察了Tris濃度在10～100 mmol·L-1范圍內4種生物堿的分離情況. 當Tris濃度大于100 mmol·L-1時， 該體系容易鹽析從而使毛細管堵塞. 而在10～100 mmol·L-1范圍內， 隨著濃度提高， 出峰時間滯后， 峰間距呈現增大趨勢； 濃度降低， 則組分分離度下降. 綜合考慮后選擇緩沖溶液Tris濃度為40 mmol·L-1. Tris濃度對分離的影響見圖2.

2.2.2 甲醇體積分數的影響

甲醇作為溶劑時， 其體積分數越高則電流越小、 峰形越尖銳， 但出峰變慢、 峰間距增大. 當甲醇體積分數高于80%時， 雖然組分的峰形和峰間距都較好， 但在該體系下溶液易鹽析， 整個緩沖體系不穩(wěn)定； 而當甲醇體積分數低于70%時， 后兩組分不能達到基線分離. 基于分離效果和穩(wěn)定性的總體考慮， 選擇甲醇體積分數為75%.

2.2.3 緩沖溶液pH值的影響

緩沖溶液pH值是影響毛細管電泳分析的重要因素之一. 實驗考察了pH值在6.55～8.50范圍內的緩沖溶液(40 mmol·L-1Tris-75%甲醇)對分離的影響. 實驗結果如圖3所示， pH值影響組分的出峰時間、 峰間距以及分離度大小， 綜合考慮后選擇pH=7.0的Tris-甲醇溶液作為電泳緩沖溶液.

2.3 分離電壓的選擇

分離電壓決定電泳的電場強度、 電滲流和電泳速度， 是影響分離效率和遷移時間的重要因素. 實驗以40 mmol·L-1的Tris-75%甲醇溶液(pH=7.0)為電泳介質， 考察了分離電壓在20～30 kV范圍內對4種生物堿分離的影響. 結果表明： 隨著分離電壓增大， 電滲流和電泳速度都增大， 遷移時間縮短， 峰間距減小， 分離度變小， 同時電流增大. 考慮到儀器的最大承載電壓為30 kV， 故選擇分離電壓為28 kV， 此時分離度和出峰時間綜合較好.

2.4 進樣時間的選擇

在分離電壓為28 kV， 柱溫25 ℃， 進樣壓力3.5 kPa條件下， 考察進樣時間在3～10 s范圍內對分離的影響. 結果如圖4所示： 進樣時間太短時， 進樣量小， 組分較難測量且相對誤差也較大； 隨著進樣時間增加， 進樣量增大， 峰形尖銳， 但峰間距縮小， 分離度變小. 綜合考慮各因素后選擇進樣時間為8 s.

2.5 最佳分離條件下的樣品譜圖對照

綜上， 最佳的電泳分離條件為： 40 mmol·L-1的Tris-75%甲醇溶液(pH=7.0)， 分離電壓28 kV， 柱溫25 ℃， 進樣壓力3.5 kPa， 進樣時間8 s. 通過比較遷移時間和加入對照品對照的方法對樣品峰進行定性. 在最佳分離條件下， 4種生物堿的對照品溶液電泳譜圖和山莨菪樣品譜圖如圖5所示. 圖中對照品與樣品組分遷移時間有略微差異的原因， 可能是樣品溶液基體較對照品溶液復雜， 故組分遷移時間受影響.

2.6 線性關系、 檢測限和精密度考察

精密量取阿托品、 山莨菪堿、 東莨菪堿和樟柳堿對照品儲備液， 用75%甲醇制備成一系列不同濃度的混合對照品溶液， 以選定實驗條件進行分析， 重復進樣3次， 考察峰面積與質量濃度ρ(μg·mL-1)的線性關系以及分析物的檢出限(S/N=3). 此外， 取一定濃度的混合對照品溶液， 連續(xù)進樣6次， 計算其峰面積A和遷移時間RSD值. 所得結果列于表1. 由表1可知，R值在0.997 0～0.999 6之間， 表明各組分在一定范圍內線性良好， 結果令人滿意. 精密度考察結果顯示各組分峰面積的RSD(n=6)為1.16%～2.06%， 遷移時間的RSD(n=6)為0.50%～0.84%， 表明該方法精密度良好.

表1 線性關系、 檢測限和精密度實驗結果Tab.1 Regression equations, detection limits and precision

2.7 重復性、 穩(wěn)定性、 樣品測定和加標回收實驗

精密稱取山莨菪細粉6份， 按樣品溶液制備方法平行制備樣品， 以選定實驗條件進行分析， 每份樣品重復進樣3次， 計算得到6份平行樣品中阿托品、 山莨菪堿、 東莨菪堿和樟柳堿含量的RSD值分別為1.49%、 2.68%、 2.58%和1.03%， 說明該方法重復性良好. 此外， 連續(xù)測定同一份供試品溶液分別在第0、 6、 12、 24、 36、 48 h時4種生物堿的峰面積， 計算得到4種生物堿48 h內峰面積的RSD值分別為2.56%、 2.17%、 2.22%、 1.80%， 說明該方法在48 h內穩(wěn)定性良好.

在最佳電泳條件下， 用所建立的方法對山莨菪中4種生物堿進行了分離測定. 用表1中回歸方程計算得到4種生物堿的平均含量及RSD值， 結果列于表2. 同時為了驗證方法的準確性， 進行了加標回收實驗. 精密稱取已知含量的山莨菪樣品粉末9份， 每份0.5 g. 分3個加入量分別準確加入四種生物堿對照品， 每個加入量平行制備3份加標樣品， 按“樣品溶液制備”項下方法處理， 進行加標回收實驗， 結果列于表3. 4種生物堿的平均回收率在97.59%～102.4%之間， RSD在2.18 %～2.82%之間， 說明該方法準確度較高、 方法可靠， 可以滿足4種生物堿含量的測定要求.

表2 山莨菪樣品測定結果Tab.2 Analysis results of Anisodus sample

表3 回收率結果Tab.3 Results of recovery

3 結語

研究建立了山莨菪中4種莨菪烷類生物堿的NACE分析新方法， 考察了緩沖溶液體系組成、 分離電壓、 檢測波長、 進樣時間等因素對4種生物堿分離的影響. 詳細考察了緩沖體系組成(濃度、 pH值、 有機溶劑)對分離的影響， 發(fā)現體系中存在75%甲醇， 可以提高生物堿的溶解度和穩(wěn)定性， 從而提高分離度和方法的靈敏度(檢出限在0.45～1.00 μg·mL-1之間)， 該靈敏度高于文獻報道的水相區(qū)帶毛細管電泳方法[6]. 而與文獻報道的高效液相色譜法[4]相比， NACE方法更具有分析時間短、 方法簡單、 分離效率高、 環(huán)保等優(yōu)勢， 可用于山莨菪藥材、 復方制劑和中草藥制品中莨菪烷類生物堿的快速測定， 并可為山莨菪人工種植過程中的質量控制提供參考. 若結合樣品在線富集技術， 進一步改善方法分析靈敏度， 該方法在生物體內樣品分析中將具有巨大的潛力.

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(責任編輯： 洪江星)

Simultaneous determination of four tropane alkaloids inAnisodustanguticusby nonaqueous capillary electrophoresis

KE Yuejiao, HUANG Guihua, ZHANG Suna, NIE Zhengqing, YU Lishuang, LI Qi

(College of Pharmacy， Fujian University of Traditional Chinese Medicine， Fujian Key Laboratory of Chinese Materia Medica， Fuzhou， Fujian 350122， China)

A capillary electrophoresis method has been developed for the determination of four tropane alkaloids, atropine, anisodamine, scopolamine, anisodine inAnisodustanguticusafter an investigation of basic factors which govern the nonaqueous capillary electrophoresis (NACE) separation of these alkaloids. The results showed that the four components could be well separated within 7.5 min at a separation voltage of 28 kV in a 40 mmol·L-1Tris system running buffer (water: methanol = 1 ∶3， volume ratio, pH=7.0) when the detection wave was set at 210 nm. A good linear relationship was observed in the range of 5～70, 5～30 μg·mL-1for atropine and anisodine respectively, 2～25 μg·mL-1for anisodamine and scopolamine. The detection limits were 0.45, 0.5, 1.0, 0.8 μg·mL-1for them. The method has been applied to the analysis of the four tropane alkaloids inAnisodustanquticus, and the result was satisfactory.

nonaqueous capillary electrophoresis;Anisodustanguticus; atropine; anisodamine; scopolamine; anisodine

10.7631/issn.1000-2243.2016.05.0723

1000-2243(2016)05-0723-05

2015-03-23

李琦(1976-)， 副教授， 主要從事藥物色譜與光譜分析方面的研究， hellorickey@sina.com

國家自然科學基金資助項目(81202913)； 福建省科技廳社發(fā)處重點資助項目(2013Y0057)； 福建中醫(yī)藥大學重點學科專項校管課題資助項目(X2014115-學科)

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