馬鹿茸中水溶性蛋白質(zhì)的含量測(cè)定及其影響因素考察

黃幫蕊，李佳芮，王春賀，金洋，馬方圓，金向群※，高兵，常彤

(1．吉林大學(xué)藥學(xué)院，長(zhǎng)春?130021，?2．中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長(zhǎng)春?130112)

鹿茸為傳統(tǒng)名貴中藥，來(lái)源于鹿科動(dòng)物梅花鹿或馬鹿的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角[1]。鹿茸中的主要有效成分為多肽及蛋白類，在對(duì)鹿茸質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)時(shí)，選擇恰當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)檢測(cè)方法十分重要。本試驗(yàn)主要對(duì)考馬斯亮藍(lán)顯色法測(cè)定馬鹿茸中水溶性蛋白質(zhì)的含量進(jìn)行了方法學(xué)考察，并研究馬鹿茸儲(chǔ)存時(shí)間、干燥方法等因素對(duì)其水溶性蛋白含量的影響，以期為馬鹿茸的加工、存儲(chǔ)提供參考，并為馬鹿茸質(zhì)量評(píng)價(jià)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

UV-5500分光光度計(jì)(上海市元析儀器有限公司)；AB204-N分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；JT2001電子分析天平(上海精天電子儀器有限公司)；TGL-16M型離心機(jī)(江蘇金壇市恒豐儀器制造有限公司)；YRD-100真空冷凍干燥機(jī)(上海玉成干燥設(shè)備有限公司)；PT-2010P-A烘箱(東莞市寶大儀器有限公司)。

牛血清白蛋白(純度：98%，批號(hào)：20140415002，SIGMA公司)；考馬斯亮藍(lán)G-250(批號(hào)：131108，中國(guó)惠世生化試劑有限公司)；馬鹿茸(長(zhǎng)生鹿業(yè)有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

對(duì)照品溶液的制備：精密稱取牛血清白蛋白10.070mg，加水溶解并定容至10mL，即得。

供試品溶液的制備：取新鮮低溫干燥馬鹿茸粉末0.125g，用10mL蒸餾水潤(rùn)濕并充分?jǐn)噭颍?℃靜置48h，4℃ 6000r/min離心40min，取上清液，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，即得。

考馬斯亮藍(lán)G-250溶液的制備：稱取50mg考馬斯亮藍(lán)G-250，加95%乙醇25mL溶解，再加85%磷酸，用蒸餾水定容至500mL，即得。

2.2 水溶性蛋白的含量測(cè)定

2.2.1測(cè)定波長(zhǎng)的選擇在200nm～700nm范圍內(nèi)用紫外分光光度儀掃描牛血清白蛋白對(duì)照品及適宜濃度的供試品溶液，兩者在594nm處都有最大吸收，因此，將594nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制配制濃度為0.105mg/mL、0.210mg/mL、0.315mg/mL、0.420mg/mL、0.525mg/mL、0.630mg/mL、0.735mg/mL、0.840mg/mL一系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別取每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.2mL，置10mL刻度試管中，加入考馬斯亮藍(lán)G-250顯色劑4mL，混勻，放置10min，同法制備空白溶液，于594nm處測(cè)其吸光度。以牛血清蛋白濃度為橫坐標(biāo)X、吸光度為縱坐標(biāo)Y繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算其回歸方程為：y=0.0231x+0.1114，R2=0.995，牛血清蛋白線性范圍為5μg/mL～40μg/mL(圖1)。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.3含量測(cè)定結(jié)果分別精密量取供試品溶液0.2mL，共6份，置10mL刻度試管中，加入考馬斯亮藍(lán)G-250顯色劑4mL，混勻，放置10min，于594nm處測(cè)其吸光度，根據(jù)回歸方程計(jì)算樣品中水溶性蛋白的含量為3.49%±0.31%。

2.2.4精密度試驗(yàn)精密量取供試品溶液0.2mL，置10mL刻度試管中，加入考馬斯亮藍(lán)G-250顯色劑4mL，混勻，放置10min，于594nm處測(cè)其吸光度，連續(xù)測(cè)定6次，RSD為0.4713%，表明精密度良好(表1)。

表1精密度試驗(yàn)結(jié)果

Table 1Results of precision test

2.2.5穩(wěn)定性試驗(yàn)精密量取供試品溶液0.2mL，置10mL刻度試管中，加入考馬斯亮藍(lán)G-250顯色劑4mL，混勻，放置10min，于594nm處測(cè)其吸光度，分別于0min、10min、20min、30min、40min、60min時(shí)測(cè)定，結(jié)果RSD為0.5231%，表明供試品溶液在60min內(nèi)穩(wěn)定(表2)。

表2穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

Table 2Results of stability test

2.2.6重復(fù)性試驗(yàn)精密稱取供試品藥材6份，按“2.1”項(xiàng)的方法制備供試品溶液，各取0.2mL，置10mL刻度試管中，加入考馬斯亮藍(lán)G-250顯色劑4mL，混勻，放置10min，于594nm處測(cè)其吸光度，測(cè)定并計(jì)算其水溶性蛋白含量，結(jié)果RSD值為1.2723%，表明方法重復(fù)性較好(表3)。

表3重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

Table 3Results of repeatability test

2.2.7回收率試驗(yàn)分別取已知含量的供試品樣品粉末各6份，精密稱定0.1250g，按“2.1”項(xiàng)的方法制備供試品溶液，分別精密吸取供試品溶液各0.1mL，并分別加入對(duì)照品溶液，置10mL刻度試管中，加入考馬斯亮藍(lán)G-250顯色劑4mL，混勻，放置10min，于594nm處測(cè)其吸光度，結(jié)果回收率為99.33%，RSD為0.8583%(表4)。

表4回收率試驗(yàn)結(jié)果

Table 4Results of recovery test

2.3 影響因素考察

2.3.1干燥方法影響考察結(jié)果對(duì)于不同的干燥方法(編號(hào)1、6)，低溫干燥的馬鹿茸水溶性蛋白含量為3.58%±0.42%，高溫干燥的馬鹿茸水溶性蛋白含量為1.47%±0.37%，對(duì)其進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，t=9.234，P=0.000，2組水溶性蛋白含量差異顯著(P<0.05)?？梢?jiàn)，干燥方法不同，馬鹿茸中水溶性蛋白含量變化較大，高溫干燥后水溶性蛋白含量明顯下降(表5)。

表5不同處理?xiàng)l件下馬鹿茸的水溶性蛋白含量

Table 5The content of water-soluble proteins in velvet antler under different processing conditions

2.3.2儲(chǔ)存時(shí)間影響考察結(jié)果通過(guò)對(duì)放置0個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月、9個(gè)月、12個(gè)月的低溫干燥馬鹿茸(編號(hào)1、2、3、4、5)的水溶性蛋白含量進(jìn)行ANOVA方差分析后得，F(xiàn)=44.401，P=0.000，差異顯著(P<0.05)，即不同的儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)馬鹿茸中水溶性蛋白的含量有顯著影響，存儲(chǔ)時(shí)間越長(zhǎng)，含量越少(表6、圖2)。

表6儲(chǔ)存時(shí)間考察結(jié)果

Table 6Results of Storage time ScS

3 討論

鹿茸是藥、食兩用的藥材，具有壯腎陽(yáng)、強(qiáng)筋骨、益精血等滋補(bǔ)作用，是保健佳品；此外，還具有調(diào)沖任、托瘡毒等作用?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，鹿茸能使大鼠離體心臟收縮幅度加大、改善心肌缺血程度，對(duì)血管內(nèi)皮損傷也有良好的保護(hù)和修復(fù)作用。鹿茸還有促進(jìn)傷口愈合、抗氧化、抗衰老、抗疲勞、增強(qiáng)免疫力等作用[2]。鹿茸中的主要有效成分為多肽及蛋白類，建立一種快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)其蛋白濃度的方法必不可少?？捡R斯亮藍(lán)顯色法在許多實(shí)驗(yàn)中已成為用來(lái)定量檢測(cè)蛋白濃度的首選方法，其與傳統(tǒng)的測(cè)量方法相比，具有操作更簡(jiǎn)便、更快、更靈敏的優(yōu)勢(shì)，并且該方法測(cè)定蛋白時(shí)受其他試劑和非蛋白成分干擾較小[3]。應(yīng)用考馬斯亮藍(lán)顯色法測(cè)

圖2 水溶性蛋白含量隨儲(chǔ)存時(shí)間變化圖

Fig.2Thecontentofwater-solubleproteinsalongwithstoragetimechanged

定鹿茸水溶性蛋白的原理為：蛋白質(zhì)分子均含有肽鍵，蛋白質(zhì)的肽鍵能與考馬斯亮藍(lán)G-250染料上的陰離子結(jié)合，形成穩(wěn)定絡(luò)合物，溶液變?yōu)樗{(lán)色，此穩(wěn)定絡(luò)合物在594nm處吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比，因此594nm處測(cè)定吸光度，可計(jì)算出樣品中蛋白質(zhì)含量[4]?？捡R斯亮藍(lán)G-250顯色法中的染料對(duì)不同的蛋白質(zhì)反應(yīng)有差異，故測(cè)定時(shí)必須隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線或?qū)φ掌啡芤簩?duì)照，以保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確、可靠[5]。

方法學(xué)考察結(jié)果表明，考馬斯亮藍(lán)與馬鹿茸水溶性蛋白中的酰胺基團(tuán)結(jié)合非常穩(wěn)定，在60min之內(nèi)吸光度值變化很小，精密度較高，重復(fù)性較好，同時(shí)，該方法的回收率符合要求，因此考馬斯亮藍(lán)顯色法可作為馬鹿茸水溶性蛋白含量的測(cè)定方法。

馬鹿茸水溶性蛋白含量影響因素考察結(jié)果中顯示，儲(chǔ)存時(shí)間延長(zhǎng)及高溫干燥后均可導(dǎo)致水溶性蛋白含量的下降，其結(jié)果與劉淑娟[6]等報(bào)道的在所有儲(chǔ)存條件下，鹿茸中水溶性蛋白含量均呈下降趨勢(shì)的結(jié)果相似，導(dǎo)致這種結(jié)果的原因可能為隨著儲(chǔ)存時(shí)間延長(zhǎng)或高溫干燥后，鹿茸水溶性蛋白產(chǎn)生變性或變質(zhì)，從而影響水溶性蛋白在水中的溶解度或其與考馬斯亮藍(lán)結(jié)合的能力。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[K].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010:303.

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