黃燦，陳沁（1.上海大學生命科學學院，上海200436；2.中國科學院蘇州生物醫(yī)學工程技術研究所，江蘇蘇州215163）

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現(xiàn)代生物技術在植物病原菌檢測中的應用

黃燦1，2，陳沁1，*
（1.上海大學生命科學學院，上海200436；2.中國科學院蘇州生物醫(yī)學工程技術研究所，江蘇蘇州215163）

植物病原菌根據(jù)形態(tài)觀察的方法進行分類鑒定比較困難。綜述了國內(nèi)外關于現(xiàn)代生物技術在植物病原菌檢測應用的最新成果，旨在促進我國植物病原菌研究的快速發(fā)展。

病原菌；現(xiàn)代生物技術；檢測應用

近年來，隨著現(xiàn)代生物學技術的發(fā)展，生物學、血清學以及分子生物學等多種檢測方法應用于植物檢疫工作，檢疫手段不斷得到補充和完善。在基層檢疫部門，針對植物病原菌檢測較多的采用形態(tài)學觀察和PCR相結(jié)合的方法；在國境口岸檢疫部門，實時熒光定量PCR已經(jīng)得到了立項，并作為一種普遍的植物病原菌檢測方法大量使用。與傳統(tǒng)植物病原菌檢測方法相比，現(xiàn)代生物學技術的應用可以大大提高檢測的準確性和靈敏度，尤其是免疫學檢測技術和紅外光譜檢測技術的發(fā)展，使高通量并快速檢測樣本成為可能。但由于試劑、設備及方法的局限，這些高效靈敏的檢測方法仍然得不到普及。

1　常規(guī)分離鑒定方法

根據(jù)形態(tài)學和生理生化特征來鑒定菌落是最簡單也最早鑒定病原菌的方法。一些新發(fā)現(xiàn)的病菌由于未及時建立有效的檢測措施，也采用形態(tài)觀察的方法［1］。這種方法完成一次檢驗需要一周甚至數(shù)周時間，無法滿足生產(chǎn)要求。結(jié)果一般用于初步判斷。

聚合酶鏈式反應（PCR）是最常見的植物核酸檢測技術。經(jīng)過這些年的發(fā)展，植物病害的多樣性及復雜性使得常規(guī)PCR技術難以滿足。PCR技術本身的快速發(fā)展，為病原菌的檢測提供了更多的選擇。如巢式PCR是用兩套引物擴增完整片段的變異PCR方法。煙草青枯病菌（Ralstonia solanacearum）、玉米細菌性枯萎病菌（Erwinia stewartii）、琯溪蜜柚黑斑病菌（Phyllosticta citriasiana）、紅掌細菌性疫病菌（Xanthomonas campestris）、西瓜種子中的細菌性果斑病菌（Pseuomonas pseudoalcaligenes）、水稻中的稻曲病菌（Ustilaginoidea virens）、芒果中的炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioiles）、甘蔗中的宿根矮化病菌（Leifsonia xyli）和黃化植原體（phytop lasma）、進境果實中的梨火疫病菌（Erwinia amylovory）和玉米內(nèi)州萎蔫病菌（Clavibacter michiganensis）等都建立了相應巢式PCR檢測體系［2-13］。在植物病菌檢疫方面，巢式PCR靈敏度比常規(guī)PCR高100倍。該項技術已經(jīng)十分成熟，目前市場上已經(jīng)開發(fā)出相應的試劑盒，提高了使用的便捷性。

2000年開始，實時熒光定量PCR用于植物病原真菌方面［14-23］，實時熒光PCR逐步發(fā)展出了與Taqman探針相結(jié)合的技術。在體系中加入一個熒光標記探針，探針產(chǎn)生的熒光屬于積累熒光，使得熒光信號強度與擴增產(chǎn)物成直接比例關系，為香梨黑斑病和紅棗植物病害病原菌的快速檢測提供了技術保障［24-25］。但該探針標記成本較高，不便普及應用。與Taqman探針工作原理相同的有Allglo探針和LNA探針等，這些探針成本較低，在植物檢測領域有很大的應用前景。

溴化乙錠（EB）是一種高度靈敏的核酸染色劑，廣泛應用于觀察瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠中的DNA。EB具有致癌性，能嵌入堿基分子，導致錯配，限制了它的使用范圍。尋找其他可以替代的核酸染料是必要的。Kang等［26］使用SYBR Green I結(jié)合熒光實時定量PCR的 方 法檢 測 水 稻 白 葉 枯 病 菌（Xanthomonas campestris），靈敏度高于EB染色法25倍～100倍，且不具有毒性，可以替代EB作為各種核酸電泳的染色劑。此外，普通染料難以滲透微生物孢子，影響與DNA的結(jié)合，Rawsthorn等［27］用疊氮溴化丙錠（PMA）對分離出的細菌孢子進行染色，成功檢測出枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。馮建軍等［28］利用PMA與實時熒光定量PCR相結(jié)合的方法，有效的抑制了混合體系中死細胞DNA的擴增，為檢測榆木種子中細菌性枯萎病菌（Pantoea stewartii）活細胞提供了一種方便、快捷的新方法。市場上，核酸染料的種類越來越多，在應用上，必須根據(jù)實際檢測的需要，選擇合適的染料。

2　核酸檢測方法

2.1多重PCR

多重PCR（multiplex PCR）又稱復合PCR，指在同一反應體系中加入二對及以上的引物，同時擴增多個核酸片段。理論上，只要引物和反應體系設計合理就可以同時檢測出若干個基因，具有高效性、系統(tǒng)性和經(jīng)濟簡便性的特點。在引物設計過程中，要防止不同引物組相互配對，形成二聚體或發(fā)卡結(jié)構(gòu)，所以通常選擇與退火溫度相近的引物組。張麗芳等［29］通過優(yōu)化引物和模板濃度，摸索擴增參數(shù)，建立了能同時檢測煙草青枯病、黑脛病和猝倒病的多重PCR反應體系。此外，Pothier等［30］用多重PCR結(jié)合DNA斑點雜交的方法從176個黃藤種桃樣品中檢測出了核果樹細菌性斑點病菌（Xanthomonas arboricola），靈敏度高達400 U。這種可以用于不同病原菌的大規(guī)模擴增方法，彌補了單純PCR反應工作量大、費時費力的缺點，但是體系的退火溫度需要反復摸索，在體系中存在多對基因或引物時，反應靈敏度會大大降低。PCR技術與其它相關檢測手段的聯(lián)合使用，是發(fā)揮穩(wěn)定性和特異性的新方向。未來開發(fā)的重點應是聯(lián)合新技術的開發(fā)和優(yōu)化，使檢測范圍進一步擴大，進而適合基層檢測應用。

2.2基因芯片技術

在當前的數(shù)據(jù)時代大背景下，企業(yè)人力資源管理的觀念勢必是要進行更新的。對于傳統(tǒng)的思想觀念進行更新，是時代發(fā)展的必然要求。其中，企業(yè)可對于相關工作人員進行系統(tǒng)性的培訓，使得企業(yè)內(nèi)部的員工接受新知識、掌握新能力［4］。另外，對于企業(yè)人力資源管理觀念的更新，并非是摒除一切傳統(tǒng)的思想管理觀念，而是在此基礎上進行更新發(fā)展，既要牢記傳統(tǒng)觀念下的精華部分，又要適應新時代的發(fā)展，盡心創(chuàng)新進步，也就是常說的“吸其精華，去其糟粕”，這句名言對于企業(yè)人力資源管理方面的應用頗為適用。

基因芯片是用點樣法固定在玻璃板上的DNA探針微陣列，發(fā)展于20世紀90年代。當帶有熒光標記的靶基因與基因組DNA芯片進行雜交產(chǎn)生互補匹配的序列時，熒光顯影會對雜交信號強度進行測試，計算機軟件綜合比較與分析后可獲得大量的基因表達信息［31］。龍海等［32］用熒光標記的PCR擴增后，與基因芯片上的探針進行雜交，可以區(qū)分3種檢疫性黃單胞菌（Xanthomonas Campestris）。羅煥亮等［33］通過分析比對11種檢疫性植原體的16SrRNA序列，設計出通用引物和特異性探針，建立了植原體（phytop lasma）基因芯片檢測技術，實現(xiàn)了高通量檢測植原體病原的方法。基因芯片主要特點是高通量、微型化和自動化，可以在1 cm2的載體表面固定數(shù)以萬計探針分子，同步快速地全自動分析信息，在全基因組水平進行系統(tǒng)宏觀的檢測研究。基因芯片技術雖然有很多優(yōu)點，但是存在檢測成本高、設計要求較為嚴格等局限性，所以不能在基層單位的植物病原菌檢測工作中得到廣泛使用。

2.3環(huán)介導等溫擴增技術

環(huán)介導等溫擴增技術（LAMP）是一種由日本科學家在2000年開發(fā)的核酸恒溫擴增方法。該方法針對靶標序列的6個區(qū)域設計4條引物，利用鏈取代反應在等溫條件下孵化，擴增過程會產(chǎn)生副產(chǎn)物焦磷酸鎂，通過肉眼觀察熒光的生成就可判斷結(jié)果。在實踐應用中，利用恒溫箱和水浴鍋，一步就可完成對目的基因的確定。目前在人獸共患的病原微生物中使用較多，在植物病原菌中鮮有報道［34］。汪萬春等［35］用LAMP軟件在線設計引物，建立的針對馬鈴薯環(huán)腐病菌（Clavibacter michiganense）檢測方法，靈敏度達150 CFU/mL。袁鈞等［36］根據(jù)玉米細菌性枯萎病菌（Pantoea stewartii）基因組DNA的保守區(qū)域，設計出LAMP引物，該檢測體系的靈敏度達到了45 CFU/mL。但是該方法也存在一些弱點和技術問題，如引物設計復雜，擴增產(chǎn)物不易驗證等。由于靈敏度高、檢測時間短、且不需要專門設備等優(yōu)點，LAMP在我國基層檢驗部門中將越來越普及。

3　免疫學檢測方法

3.1酶聯(lián)免疫吸附技術

酶聯(lián)免疫吸附技術（ELISA）是利用可溶性抗原或抗體結(jié)合到聚苯乙烯等固相載體上，通過抗原抗體結(jié)合專一性進行免疫反應的定性和定量的檢測方法，也是目前植物細菌病害診斷上應用比較廣的一種免疫學方法，多用來檢測馬鈴薯帚頂病和韭菜黃色斑紋病等［37-38］。免疫血清制備耗時耗力，可能存在交叉反應，造成假陽性。

近幾年，ELISA反應得到優(yōu)化，發(fā)展出雙抗體夾心法（DAS-ELISA）、間接法、競爭法等。其中夾心法主要用于檢測大分子抗原，間接法用于測定特異抗體，競爭法用于檢測小分子抗原。在植物病原檢疫中，前兩種方法的應用較為普遍。喬寧等［39］把純化的番茄黃化曲葉病毒外殼蛋白作為抗原使家兔產(chǎn)生免疫反應，制備出了對應的多克隆抗體作為包被抗體，并用堿性磷酸酶對抗體進行標記作為酶標抗體，建立了番茄黃化曲葉病毒的DAS-ELISA。周麗洪等［40］也用同樣的方法制備出家兔免疫抗體血清，再用間接ELISA診斷出麗格海棠細菌性葉斑病。DAS-ELISA和間接ELISA對于診斷植物病原體具有特異性強、靈敏度高的特點，但是耗時較長，免疫過程中的每個環(huán)節(jié)都會影響它的特異性和敏感度，探索反應的最佳條件、簡化步驟和降低費用，是實現(xiàn)標準化和規(guī)?；瘧玫谋亟?jīng)之路。

3.2PCR-ELISA

這是將PCR和ELISA兩種技術結(jié)合在一起的方法。將寡核苷酸共價交聯(lián)在PCR管壁上，用傳統(tǒng)PCR方法經(jīng)過擴增、洗滌后，把交聯(lián)在管壁上的擴增產(chǎn)物作為固相產(chǎn)物進行ELISA反應，把洗滌液中的少量擴增產(chǎn)物作為液相產(chǎn)物，進行凝膠電泳或核酸雜交。Block等［41］用酶聯(lián)免疫和實時熒光PCR的方法結(jié)合在一起，對玉米青枯病樣本進行了鑒定試驗，建立了酶聯(lián)免疫捕捉-實時定量PCR檢測體系，大大提高了檢測靈敏度。陳曦等［42］用PCR—ELISA檢測玉米細菌性枯萎病菌（Pantoea stewartii）和玉米內(nèi)州萎焉病菌（Clavibacter michiganensis），只用8 h就檢測出了兩種病菌，其靈敏度比普通PCR方法高出100倍。但是該方法操作較為繁瑣，而且同批樣本產(chǎn)物之間的交叉污染程度遠遠大于ELISA。PCR-ELISA是一種適合推廣的綜合檢測方法，其將越來越受到海關等檢疫部門的重視。優(yōu)化PCR-EL ISA技術體系，使之穩(wěn)定、易操作是今后研究的主要方向。

3.3微球免疫分析

微球免疫分析（xMAP）的技術原理是把不同待測物的抗體分子或基因探針以共價交聯(lián)的方式結(jié)合到特定的熒光編碼微球上，加入待測的擴增片段，所形成的復合物再與標記熒光素發(fā)生結(jié)合反應，微球在流動鞘液的帶動下單列依次通過紅綠激光來判定熒光編碼和熒光強度，從而達到快速準確的定量目的。目前xMAP已成為一種替代的微生物檢測方法。這種技術多用來分析食源性致病菌、毒素［43］和潛在的臨床診斷的生物標志物［44-45］。到目前為止，用xMAP技術檢測植物病原菌，只有為數(shù)不多的幾例報道［46-47］，且都是針對植物病毒的檢測。xMAP技術不需要繁瑣的DNA提取和純化步驟，具有其他分離方法難以比擬的操作簡便、分離迅速完全的特點，屬于新的病原菌分離鑒定方法，有廣闊的開發(fā)應用前景。xMAP技術與熒光定量PCR、ELISA和免疫熒光顯微術等相結(jié)合，還能實現(xiàn)特殊的檢測目的，為植物病原菌的檢測提供更加高效的手段。

4　紅外光譜技術

傅立葉變換紅外光譜（FTIR）檢測技術利用分子振動能級的變化來鑒定分子中存在的官能團。近年來，由于紅外光譜法能在樣品非破壞情況下準確反映生物大分子甚至分子基因的變化，在食源性致病菌檢測鑒定中大量使用。微生物種類的差別在FTIR圖譜上主要表現(xiàn)為峰形、峰的數(shù)量、峰位及特定峰的相對強度上，準確度較高。李小龍等［48］對150片小麥葉片進行紅外掃描處理后，鑒定出了小麥條銹病和葉銹病；徐曉鷗等［49］只用2 h左右，從豌豆和菜豆中同時檢測出了細菌性疫病，且光譜結(jié)果的特異性強。Thaitrong等［50］建立了用FTIR法鑒定西瓜果斑病菌（Pseudomonas pseudoalcaligenes）的兩個亞種的技術。同樣的方法，可以用來判斷萵苣霜霉病和辣椒疫病的光譜信息［51-52］。柴阿麗等［53］通過比較正常葉片和病變?nèi)~片的光譜圖，確定了3個黃瓜褐斑病敏感譜帶，再結(jié)合峰面積值和系統(tǒng)聚類分析，可以用作早期黃褐病的鑒定。

這些年，隨著近紅外光譜儀器和化學計量學軟件的發(fā)展，近紅外光譜分析技術已逐漸應用到對各種水果的無損檢測中。通過該技術得到的光譜數(shù)據(jù)含有噪聲，需要進行去噪處理，來提高模型穩(wěn)定性和預測結(jié)果的準確性。運用光譜數(shù)據(jù)去噪法的漫投射光纖探頭對馬鈴薯塊莖進行檢測，內(nèi)部品質(zhì)信息被光譜儀吸收并轉(zhuǎn)化為數(shù)據(jù)就能顯示在計算機上，判斷馬鈴薯是否遭受病害［54］。該方法操作簡單，且不破壞植物樣本的組織，但對設備依賴性很大。在國內(nèi)，該項工作剛剛起步，研究較少，還停留在實驗室階段，有待更深入的研究。

5　其他方法

隨著科學技術的發(fā)展，植物病原體的檢測手段也越來越多。色譜技術、菌體脂肪酸分析系統(tǒng)等都可以用作植物病原菌檢測，但由于操作繁瑣、實用性不強等特點，對植物病原菌的研究一直比較少。二代測序技術的發(fā)展使得基因檢測具有高通量、高效性以及很強的實用性，Qinhua等［55］用焦磷酸測序法檢測野油菜黃單胞菌葉斑病，數(shù)分鐘就可獲得大量信息，但其所依賴的焦磷酸測序儀價格極其昂貴，并非一般實驗室所能配備。

此外納米技術在提取核酸的過程中逐漸顯示出良好的特點。連海燕等［56］建立了一種以納米磁珠提取核酸為基礎，同時結(jié)合RT-PCR/RT-qPCR技術檢測植物類病毒的方法。磁性納米材料比表面積大、容易修飾，具有可操作性。以納米磁珠為載體，提取的核酸質(zhì)量高。該方法具有操作簡單、重復性好、穩(wěn)定性高等優(yōu)點。應用到出入境檢疫系統(tǒng)中，對于提高檢疫水平和相關農(nóng)產(chǎn)品的進出口通過率有很重要的意義

6　結(jié)語

植物病原菌主要通過土壤、昆蟲、植物體材料、空氣等途徑傳播。目前較為實用的檢測方法是病菌分離培養(yǎng)配合PCR鑒定，檢測快速且成本低，但經(jīng)常有漏檢的情況發(fā)生，對不同病害的檢測水平上也存在差異。近年來隨著分子生物學、免疫學、光譜等技術的快速發(fā)展，尤其是幾種學科的交叉研究，新的植物病原菌檢測方法不斷出現(xiàn)，在檢測水平上體現(xiàn)出傳統(tǒng)方法無可比擬的優(yōu)點。然而這些方法在實際應用中受到技術、設備等的制約，需要在實驗室進一步研究和優(yōu)化，暫時不適合推廣應用。在實際的檢疫工作中，我們應該根據(jù)實際條件及檢測樣品的特點，選擇合適的檢測方法。隨著現(xiàn)代生物學技術的廣泛應用，植物病原菌檢疫正朝著快速、高敏感性、高特異性、高通量及自動化的方向發(fā)展。

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Application of Modern Biological Methods in Detecting of Plant Phytopathogens

HUANG Can1，2，CHEN Qin1，*
（1.College of Life Sciences，Shanghai University，Shanghai 200436，China；2.Suzhou Institute of Biomedical Engineering and Technology，Chinese Academy of Sciences，Suzhou 215163，Jiangsu，China）

It is difficult for pathogenic bacterium to be classified and identified by the methods of morphological observation in plant.The new studies of detection methods for pathogenic bacterium during plant processing and storage were summarized in the paper.The purpose is to promote the rapid development of pathogenic bacteria of plant in our country.

pathogenic bacterium；modern biological technology；detection methods

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.13.051

黃燦（1989—），男（漢），碩士研究生，研究方向：生物抗病分子機制及病毒致病機理。

陳沁（1969—），女（漢），教授，博士，研究方向：農(nóng)作物抗逆分子機制及植物與微生物互作關系。

2015-02-13