潘黛安，張鶴，董穎，王珊，邊帥，王秋，齊濱，趙雨，趙大慶（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林長(zhǎng)春130117）

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基礎(chǔ)研究

哈蟆油蛋白酶解物抗疲勞功效研究

潘黛安，張鶴*，董穎，王珊，邊帥，王秋，齊濱，趙雨，趙大慶*
（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林長(zhǎng)春130117）

研究哈蟆油蛋白酶解物的抗疲勞作用。采用雙酶法制備哈蟆油蛋白酶解物，以哈蟆油蛋白酶解物低、中、高劑量組和空白對(duì)照組連續(xù)給小鼠灌胃30 d，測(cè)定小鼠負(fù)重游泳時(shí)間、血清尿素含量、血乳酸含量和肝糖原含量。與空白對(duì)照組相比，各劑量組小鼠負(fù)重游泳時(shí)間均明顯延長(zhǎng)（P＜0.05），高、中劑量組小鼠游泳后血清尿素含量顯著降低（P＜0.05），高劑量組小鼠游泳后3個(gè)時(shí)間點(diǎn)血乳酸曲線下面積均小于空白對(duì)照組（P＜0.05）；各劑量組小鼠肝糖原含量無顯著性差異（P＞0.05）。哈蟆油蛋白酶解物具有緩解體力疲勞作用。

哈蟆油；蛋白酶解物；抗疲勞

哈蟆油［1］（Oviductus Ranae）是中國林蛙（Rana temporaria chensinensis David）雌蛙輸卵管，采制后經(jīng)干燥而得，又稱“林蛙油”，吉林省為主產(chǎn)區(qū)，是我國特有的名貴中藥材。哈蟆油味甘、咸，性平，具有補(bǔ)腎益精、健脾益胃、滋陰補(bǔ)腎、潤(rùn)肺生津等功效，對(duì)體弱氣虛、精力耗損、記憶力不佳、神經(jīng)衰弱等療效較好，富有滋補(bǔ)“軟黃金”的美譽(yù)?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明哈蟆油具有提高機(jī)體免疫力［2］、抗氧化［3］、抗疲勞、抗應(yīng)激等作用［4］。目前對(duì)于哈蟆油成分的研究發(fā)現(xiàn)，主要成分為蛋白質(zhì)，約占總量的50%以上［5］。有學(xué)者將哈蟆油分為水溶性成分和非水溶性成分，分別進(jìn)行抗疲勞試驗(yàn)研究，研究發(fā)現(xiàn)哈蟆油水溶性成分及其酶解物和非水溶性成分及其酶解物都具有抗疲勞功效，且酶解后抗疲勞功效進(jìn)一步增強(qiáng)［6-9］。由于哈蟆油中的糖蛋白分子量大，黏度高，不易生產(chǎn)加工，采用蛋白酶酶解的方法可顯著降低分子量，使其易于加工和人體消化吸收。但尚鮮有文獻(xiàn)報(bào)道采用雙酶法制備得到的哈蟆油酶解物的藥理活性，因此本實(shí)驗(yàn)采用胃蛋白酶和堿性蛋白酶雙酶法制備哈蟆油蛋白酶解物，研究酶解后哈蟆油蛋白的抗疲勞的作用，為哈蟆油的產(chǎn)品開發(fā)提供理論參考。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)藥物

新鮮哈蟆油去除筋膜等雜質(zhì)后陰干，粉碎成細(xì)粉，按料液比1∶100（g/mL）加入pH 4.5的檸檬酸溶液，浸泡36 h，勻漿后煮2 h，冷卻至室溫，用10 mmol/L HCl溶液調(diào)pH 2～3。采用最佳酶解工藝［10］，用檸檬酸浸提和水煎煮的方法提取哈蟆油蛋白，先按照酶與底物比1∶2 000（g∶g）加入胃蛋白酶酶解2 h，再按照酶與底物比1∶100（g∶g）加入堿性蛋白酶酶解6 h，離心，制得哈蟆油蛋白酶解物樣品，哈蟆油蛋白酶解物的提取率為80%。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)ICR雄性小鼠160只，體重18 g～22 g，長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK-（吉）2011-0004；基礎(chǔ)飼料由長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK-（吉）2010-0001；清潔級(jí)動(dòng)物室環(huán)境設(shè)施合格證號(hào)：吉?jiǎng)釉O(shè)字10-1005號(hào)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（吉）2010-0011。

1.3試劑

尿素測(cè)定試劑盒：深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；血乳酸測(cè)試酶膜：山東省科學(xué)院生物研究所；肝糖原試劑盒：南京市建成生物工程研究所。

1.4儀器

游泳箱（50 cm×50 cm×40 cm）；秒表；AB135-S型電子天平：梅特勒-托利多公司；ALC2100電子天平：艾科勒公司；722分光光度計(jì)：上海奧析科學(xué)儀器有限公司；TBA-120FR型全自動(dòng)生化分析儀：日本東芝；SBA-40C型生物傳感分析儀：山東省科學(xué)院生物研究所。

1.5方法

1.5.1動(dòng)物分組與劑量選擇

將160只小鼠隨機(jī)分為4大組（n=40），分別用于負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)、血清尿素氮測(cè)定、血乳酸測(cè)定、肝糖原測(cè)定，每個(gè)大組隨機(jī)分為4個(gè)小組（n=10），按哈蟆油蛋白酶解物人服用劑量的1、10、30倍設(shè)置劑量組，分別為0.52、5.20、15.60 mg/10 g×BW×d，空白對(duì)照組給予生理鹽水，連續(xù)灌胃30 d。

1.5.2負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)

末次給予受試樣品30 min后，將小鼠尾根部負(fù)荷5%體重的鉛皮，置游泳箱中游泳，水深約30 cm，水溫（25±1）℃。實(shí)驗(yàn)時(shí)水槽內(nèi)同時(shí)放入低、中、高劑量組和空白對(duì)照組小鼠各一只。記錄小鼠自開始游泳至死亡的時(shí)間［11］，即小鼠的負(fù)重游泳時(shí)間（min）。

1.5.3血清尿素測(cè)定

末次給予受試樣品30 min后，在游泳箱中不負(fù)重游泳90 min，水溫（30±0.5）℃，休息60 min后，小鼠摘眼球采血。置于4℃中靜置3 h，分離血清，進(jìn)行尿素含量測(cè)定。采用日本東芝TBA-120FR型全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定。

1.5.4血乳酸測(cè)定

末次給予受試樣品30 min后，用毛細(xì)管眼球內(nèi)眥取血20 μL，然后使小鼠在水溫為（30±0.5）℃的游泳箱中不負(fù)重游泳10 min。分別于游泳后立即（游泳后0 min）和游泳后休息20 min各采血20 μL，采用山東省科學(xué)院生物研究所生產(chǎn)的生物傳感分析儀測(cè)定以上3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血乳酸值。（溶血?jiǎng)┘皽y(cè)定液均由該所提供）。以3個(gè)時(shí)間點(diǎn)血乳酸曲線下面積判斷結(jié)果：3個(gè)時(shí)間點(diǎn)血乳酸曲線下面積（mmol/L）=5×（游泳前血乳酸值+3×游泳后0 min血乳酸值+2×游泳后休息20 min血乳酸值）

1.5.5肝糖原測(cè)定

末次給予受試樣品30 min后處死小鼠，取肝臟，以生理鹽水洗滌后，用濾紙吸干多余水分，精確稱取肝臟75 mg，每管加入225 μL試劑盒提供的堿溶液，用簿膜封住管口，扎一透氣孔，沸水浴20 min，冷卻后加入7.2 mL蒸餾水，充分混勻，按試劑說明書操作加入顯色劑，沸水浴5 min，用722分光光度計(jì)在620 nm波長(zhǎng)進(jìn)行比色測(cè)定，按如下公式換算肝糖原。

1.6結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性，血乳酸、血清尿素、肝糖元/肌糖元3項(xiàng)生化指標(biāo)中任2項(xiàng)指標(biāo)陽性，可判定該受試樣品具有緩解體力疲勞的作用。

1.7數(shù)據(jù)處理

采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件，通過單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，試驗(yàn)結(jié)果表示為。

2　結(jié)果

2.1哈蟆油蛋白酶解物對(duì)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間及小鼠增重的影響

哈蟆油蛋白酶解物對(duì)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間及小鼠增重的影響見表1。

由表1可見，經(jīng)口給予小鼠不同劑量的哈蟆油蛋白酶解物30 d，各實(shí)驗(yàn)組小鼠增重與空白對(duì)照組比較無顯著性差異（P＞0.05），高、中劑量組游泳時(shí)間長(zhǎng)于空白對(duì)照組，且差異有極顯著性（P＜0.01），低劑量組游泳時(shí)間長(zhǎng)于空白對(duì)照組，且差異有顯著性（P＜0.05）。說明哈蟆油蛋白酶解物能延長(zhǎng)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間而對(duì)小鼠增重?zé)o影響。

表1　哈蟆油蛋白酶解物對(duì)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間及小鼠增重的影響（）Table 1　Effect of Oviductus Ranae protein hydrolyzate on swimming time and weight gain in mice（）

表1　哈蟆油蛋白酶解物對(duì)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間及小鼠增重的影響（）Table 1　Effect of Oviductus Ranae protein hydrolyzate on swimming time and weight gain in mice（）

注：*為與空白對(duì)照組比較P＜0.05；**為與空白對(duì)照組比較P＜0.01。

組別　動(dòng)物數(shù)/只　劑量/（mg/10 g×BW×d）　始重/g　終重/g　增重/g　游泳時(shí)間/min空白對(duì)照　10　19.6±0.8　36.5±1.8　16.9±1.8　6.97±2.46哈蟆油蛋白酶解物　10　0.52　19.8±1.3　37.0±3.5　17.3±3.5　7.43±1.73*哈蟆油蛋白酶解物　10　5.20　19.7±1.1　36.6±2.7　17.0±2.3　8.49±2.35**哈蟆油蛋白酶解物　10　15.60　20.0±1.3　36.8±3.6　16.8±3.1　11.11±3.37**

2.2哈蟆油蛋白酶解物對(duì)小鼠血清尿素及小鼠增重的影響

哈蟆油蛋白酶解物對(duì)小鼠游泳后血清尿素及小鼠增重的影響見表2。

表2　哈蟆油蛋白酶解物對(duì)小鼠游泳后血清尿素及小鼠增重的影響（）Table 2　Effect of Oviductus Ranae protein hydrolyzate on serum urea and weight gain in mice after swimming（）

表2　哈蟆油蛋白酶解物對(duì)小鼠游泳后血清尿素及小鼠增重的影響（）Table 2　Effect of Oviductus Ranae protein hydrolyzate on serum urea and weight gain in mice after swimming（）

注：*為與空白對(duì)照組比較P＜0.05。

組別　動(dòng)物數(shù)/只　劑量/（mg/10 g×BW×d）　始重/g　終重/g　增重/g　血清尿素/（mmol/L）空白對(duì)照哈蟆油蛋白酶解物哈蟆油蛋白酶解物哈蟆油蛋白酶解物10 10 10 10 0.52 5.20 15.60 20.3±1.1 20.6±0.8 20.2±1.2 20.2±1.1 37.1±2.6 36.4±2.2 36.6±2.4 36.3±2.1 16.8±2.1 15.8±2.1 16.4±2.1 16.1±2.2 10.65±1.20 10.55±1.62 9.91±1.13* 9.17±1.62*

由表2可見，經(jīng)口給予小鼠不同劑量的哈蟆油蛋白酶解物30 d，各實(shí)驗(yàn)組小鼠增重與空白對(duì)照組比較無顯著性差異（P＞0.05），高、中劑量組小鼠游泳后血清尿素低于空白對(duì)照組，且與空白對(duì)照組比較有顯著性差異（P＜0.05），說明哈蟆油蛋白酶解物具有抑制小鼠游泳后血清尿素升高的作用而對(duì)小鼠增重?zé)o影響。

2.3哈蟆油蛋白酶解物對(duì)小鼠血乳酸值及小鼠體重的影響

給予哈蟆油蛋白酶解物小鼠游泳前、后及休息20 min 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)血乳酸值見表3。

表3　給予哈蟆油蛋白酶解物小鼠游泳前、后及休息20 min 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)血乳酸值（）Table 3　The blood lactic acid levels of three time points before swimming，after swimming and 20 min after resting in mice of giving Oviductus Ranae protein hydrolyzate（）

表3　給予哈蟆油蛋白酶解物小鼠游泳前、后及休息20 min 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)血乳酸值（）Table 3　The blood lactic acid levels of three time points before swimming，after swimming and 20 min after resting in mice of giving Oviductus Ranae protein hydrolyzate（）

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哈蟆油蛋白酶解物對(duì)小鼠3個(gè)時(shí)間點(diǎn)血乳酸曲線下面積及小鼠增重的影響見表4。

由表4可見，經(jīng)口給予小鼠不同劑量的哈蟆油蛋白酶解物30 d，各實(shí)驗(yàn)組小鼠增重與空白對(duì)照組比較無顯著性差異（P＞0.05），高劑量組小鼠游泳后3個(gè)時(shí)間點(diǎn)血乳酸曲線下面積有所降低，與空白對(duì)照組比較有顯著性差異（P＜0.05），說明哈蟆油蛋白酶解物能夠抑制游泳時(shí)血乳酸的產(chǎn)生而對(duì)小鼠增重?zé)o影響。

表4　哈蟆油蛋白酶解物對(duì)小鼠3個(gè)時(shí)間點(diǎn)血乳酸曲線下面積及小鼠增重的影響Table 4　Effect of Oviductus Ranae protein hydrolyzate on the areas under the curve of the three time points of blood lactic acid and weight gain in mice

2.4哈蟆油蛋白酶解物對(duì)小鼠肝糖原含量及小鼠增重的影響

哈蟆油蛋白酶解物對(duì)小鼠肝糖原含量及小鼠增重的影響見表5。

表5　哈蟆油蛋白酶解物對(duì)小鼠肝糖原含量及小鼠增重的影響（）Table 5　Effect of Oviductus Ranae protein hydrolyzate on the content of hepatic glycogen and weight gain in mice（）

表5　哈蟆油蛋白酶解物對(duì)小鼠肝糖原含量及小鼠增重的影響（）Table 5　Effect of Oviductus Ranae protein hydrolyzate on the content of hepatic glycogen and weight gain in mice（）

組別　動(dòng)物數(shù)/只　劑量/（mg/10 g×BW×d）　始重/g　終重/g　增重/g　肝糖原/（mg/g肝組織）空白對(duì)照哈蟆油蛋白酶解物哈蟆油蛋白酶解物哈蟆油蛋白酶解物10 10 10 10 0.52 5.20 15.60 20.4±1.3 19.7±1.2 20.1±1.0 20.2±1.3 37.0±2.5 37.1±3.2 36.8±3.4 36.7±2.7 16.5±3.2 17.4±2.9 16.7±3.3 16.5±2.4 35.43±6.87 35.63±8.89 36.04±9.68 36.45±10.73

由表5可見、經(jīng)口給予小鼠不同劑量的哈蟆油蛋白酶解物30 d，各實(shí)驗(yàn)組小鼠增重與空白對(duì)照組比較無顯著性差異（P＞0.05），各劑量組肝糖原儲(chǔ)備與空白對(duì)照組比較無顯著性差異（P＞0.05），即哈蟆油蛋白酶解物對(duì)增加肝糖原儲(chǔ)備和小鼠增重未見影響。

3　討論

疲勞是一個(gè)復(fù)雜的生理狀態(tài)，是腦力或體力消耗到一定程度時(shí)必然出現(xiàn)的一種正常的生理現(xiàn)象。產(chǎn)生疲勞的主要原因是能源物質(zhì)的消耗和代謝物質(zhì)的堆積［12］。所謂抗疲勞，就是通過一些方法手段補(bǔ)充能源物質(zhì)或加速堆積物質(zhì)的代謝。如可以依靠營養(yǎng)物質(zhì)的補(bǔ)充、中醫(yī)藥療法來消除機(jī)體疲勞，也可以通過休息、睡眠及某些物理方法等達(dá)到抗疲勞的目的［13］。為避免營養(yǎng)物質(zhì)的補(bǔ)充影響小鼠體重進(jìn)而影響受試樣品的抗疲勞功效，因此本實(shí)驗(yàn)中分別對(duì)給予受試樣品后小鼠體重的差異進(jìn)行了測(cè)量。

機(jī)體運(yùn)動(dòng)可以加速能源物質(zhì)的消耗，因此通過運(yùn)動(dòng)，即小鼠負(fù)重游泳的時(shí)間長(zhǎng)短來反應(yīng)機(jī)體疲勞的程度。本研究結(jié)果表明，服用哈蟆油蛋白酶解物可明顯延長(zhǎng)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間，且高、中劑量的哈蟆油蛋白酶解物可顯著延長(zhǎng)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間而對(duì)小鼠增重?zé)o影響。尿素是氨基酸蛋白質(zhì)在體內(nèi)分解代謝的最終產(chǎn)物之一，運(yùn)動(dòng)后血清尿素的含量會(huì)明顯升高。高、中劑量組小鼠游泳后血清尿素含量均明顯降低，低劑量組與空白對(duì)照組相比無顯著性差異，說明哈蟆油蛋白酶解物具有抑制小鼠游泳后血清尿素升高的作用而對(duì)小鼠增重?zé)o影響。乳酸是造成運(yùn)動(dòng)性疲勞的重要原因，機(jī)體運(yùn)動(dòng)消耗糖原，糖原分解產(chǎn)生大量乳酸，乳酸在肌肉中堆積，造成機(jī)體疲勞，因此，減少血液中乳酸的產(chǎn)生。本研究中高劑量組可明顯抑制小鼠游泳時(shí)血乳酸的產(chǎn)生，各劑量組對(duì)小鼠增重?zé)o顯著性差異。糖原是機(jī)體運(yùn)動(dòng)的主要能量來源，而肌糖原作為儲(chǔ)備能量，其含量的減少可直觀的反應(yīng)出疲勞發(fā)生的程度［14］。本研究中各劑量組對(duì)小鼠體重及增加肝糖原儲(chǔ)備均未見影響。

根據(jù)1.6項(xiàng)下結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性，血乳酸、血清尿素、肝糖元/肌糖元3項(xiàng)生化指標(biāo)中任2項(xiàng)指標(biāo)陽性，可判定該受試樣品具有緩解體力疲勞的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，小鼠負(fù)重游泳試驗(yàn)為陽性，血清尿素和血乳酸2項(xiàng)生化指標(biāo)為陽性，因此可判定哈蟆油蛋白酶解物能提高機(jī)體運(yùn)動(dòng)耐力，改善機(jī)體能量代謝，降低血乳酸含量，從而延緩疲勞的產(chǎn)生和加速疲勞的消除，具有抗疲勞功效。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果進(jìn)一步證明了哈蟆油蛋白酶解物酶解物的抗疲勞功效，為哈蟆油中主要成分蛋白酶解物的保健品開發(fā)提供了理論參考。

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Study on the Anti-fatigue Effect of Oviductus Ranae Protein Hydrolyzate

PAN Dai-an，ZHANG He*，DONG Ying，WANG Shan，BIAN Shuai，WANG Qiu，QI Bin，ZHAO Yu，ZHAO Da-qing*
（Changchun University of Chinese Medicine，Changchun 130117，Jilin，China）

Researching the anti-fatigue effect of Oviductus Ranae protein hydrolyzate.Using double enzyme to prepare Oviductus Ranae protein hydrolyzate.Four doses of Oviductus Ranae protein hydrolyzate with low，medium and high dose group and a blank control group were applied to mice continuously for 30 d.Then measured loaded swimming time，serum urea content，blood lactic acid content and hepatic glycogen of mice.Compared with blank control group，the loaded swimming time of mice of each dose group was significantly prolonged（P＜0.05），the serum urea content after swimming of mice of high and middle dose groups were both significantly lower（P＜0.05），the areas under the curve of the three time points of blood lactic acid after swimming of mice of high dose group were lower than the blank control group（P＜0.05），the hepatic glycogen content of each dose group was no significant differences（P＞0.05）.Oviductus Ranae protein hydrolyzate had the effect of relieving physical fatigue.

Oviductus Ranae；protein hydrolyzate；anti-fatigue

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.13.001

吉林省醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展引導(dǎo)資金項(xiàng)目（20150311031YY）

潘黛安（1991—），女（漢），碩士研究生，研究方向：中藥有效成分研究。

張鶴（1985—），女，助理研究員；趙大慶（1963—），男，教授。

2015-07-07