張 薇, 唐 彬, 黎福榮

(中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心, 廣州 510080)

TX 小鼠研究進(jìn)展

張 薇, 唐 彬, 黎福榮

(中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心, 廣州 510080)

TX 小鼠(toxic milk mouse)是由DL近交系小鼠繁殖到第68 代所產(chǎn)生的自然突變品系。主要表現(xiàn)為低色素化、生長(zhǎng)遲緩、震顫和運(yùn)動(dòng)功能障礙等，其與Wilson 病的共同點(diǎn)包括: 遺傳方式屬于常染色體隱性遺傳、成年小鼠體內(nèi)銅大量沉積使血清銅和血清銅藍(lán)蛋白水平降低等特點(diǎn)。文章從TX 小鼠的病理生理學(xué)、致病機(jī)理、病理治療學(xué)等多個(gè)方面綜述了TX小鼠的研究現(xiàn)狀。

TX 小鼠; 銅離子積累; ATP7B 蛋白

肝豆?fàn)詈俗冃?Wilson’s disese, Wilson病)，是較常見的常染色體單基因隱性遺傳疾病，該病以銅代謝障礙為特征，是ATP7B基因病變導(dǎo)致ATP7B蛋白功能障礙，不能將細(xì)胞內(nèi)多余銅有效轉(zhuǎn)移出細(xì)胞，從而形成細(xì)胞內(nèi)銅過(guò)度蓄積，引起細(xì)胞損傷或凋亡，導(dǎo)致組織病變，發(fā)病率約為三萬(wàn)五千分之一[1]; 病變主要累及雙側(cè)基底神經(jīng)節(jié)、角膜、肝臟、腎臟，并引起相應(yīng)并發(fā)癥狀和體征[2]。神經(jīng)系統(tǒng)典型癥狀是四肢不自主顫抖,可表現(xiàn)為錐體外系的癥狀如：帕金森樣動(dòng)作或舞蹈樣動(dòng)作以及言語(yǔ)不清、肌張力亢進(jìn)和行為異常等癥狀; 消化系統(tǒng)癥狀主要表現(xiàn)為肝硬化、脾腫大、黃疸、肝腹水等;其他臟器可表現(xiàn)為腎損傷、皮膚色素沉積[3]等癥狀, 20歲前發(fā)病最為常見[4]。深入探索Wilson 病的機(jī)理和完善治療方法很有必要。在Wilson 病患者身體上進(jìn)行研究或治療的嘗試違背倫理，而T X (toxic milk mouse)小鼠是目前最佳的Wilson 病動(dòng)物模型之一，雖然其無(wú)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀及角膜色素環(huán)(K-F)環(huán)，并不能完全模擬Wilson 病患者的臨床表現(xiàn)。但研究表明[5]，TX小鼠自5月齡后存在自我恢復(fù)的趨勢(shì)，TX 小鼠與人類Wilson 病的差異性可能成為治療Wilson 病的潛在方法。

TX小鼠最早出現(xiàn)于1974 年，是DL近交系小鼠繁殖到第68 代所產(chǎn)生的自然突變品系，并于F88培育成功, TX 小鼠的ATP7B 基因與人的同源性高達(dá)82%, 其生命過(guò)程中具有與Wilson 病患者相類似的銅生化特征及病理過(guò)程[6]。本文作者首先從TX小鼠的病理生理學(xué)、致病機(jī)理學(xué)、治療學(xué)3個(gè)方面的研究展開綜述, 對(duì)TX 小鼠最新研究提供方向，也期待為開展Wilson 病動(dòng)物模型的研究提供參考。

1 TX 小鼠病理生理學(xué)

生理學(xué)上，TX 小鼠的血清銅和血清銅藍(lán)蛋白含量?jī)H為正常鼠的30%左右。

銅離子自小鼠2月齡開始在各個(gè)臟器中沉積，肝和腦為主[7], 以肝臟明顯表現(xiàn)為大量銅沉積，在32周齡時(shí)高達(dá)到正常組的40～50 倍，差異十分顯著。陳曦等[8]認(rèn)為，臟器的銅離子積累也是自2 月齡, 但其20 周齡時(shí)銅積累量到達(dá)最大, 可達(dá)到對(duì)照組的70～90 倍, 高峰時(shí)期達(dá)990 mg/kg 左右。同時(shí)Biempica等[9]也報(bào)道, 4 月齡時(shí)肝臟銅約800 mg/kg, 5月齡時(shí)達(dá)最高峰900 mg/kg，但至15～19 月齡時(shí)肝臟銅的含量約為高峰時(shí)的一半，可見TX 小鼠自5月齡后存在自我恢復(fù)的趨勢(shì)，因此應(yīng)用TX 小鼠研究Wilson 病選擇合適月齡很重要。

病理學(xué)方面，陳曦等[10]研究表明，9月齡時(shí)的TX 小鼠在光鏡下出現(xiàn)小結(jié)節(jié)樣的肝細(xì)胞增生，且排列紊亂喪失正常肝索結(jié)構(gòu)。增生肝細(xì)胞附著于肝板結(jié)構(gòu)多數(shù)成對(duì)出現(xiàn)，部分肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)為腫脹、水樣變性、嗜酸性變或脂肪樣變及玻璃樣壞死，胞質(zhì)內(nèi)脂滴較多，胞核腫大，大量的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)出現(xiàn)在血竇中。石濤等[11]在光鏡下也觀察到該小鼠肝細(xì)胞排列紊亂、腫脹,部分胞核增大呈空泡狀，伴有大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，同時(shí)可見活躍增生的卵圓細(xì)胞。同時(shí)電子顯微鏡下觀察到多數(shù)肝細(xì)胞的溶酶體結(jié)構(gòu)有較多的顆粒狀電子致密物沉積，伴有線粒體增多腫脹。陳曦等[10]通過(guò)對(duì)TX小鼠的組織銅含量和血銅藍(lán)蛋白活性改變分析表明，4、5 月齡最為明顯，認(rèn)為該時(shí)期的小鼠最適合做Wilson 病模型實(shí)驗(yàn)，1 月齡時(shí)蛋白活性改變不明顯適用癥狀前治療研究，2 月齡癥狀開始發(fā)生可作為疾病初期階段的模型。Biempica 等[9]對(duì)后續(xù)月齡的TX 小鼠觀察認(rèn)為，5 月齡后的TX 小鼠可作為肝功能恢復(fù)治愈實(shí)驗(yàn)。由此可知，盡管TX 小鼠基因發(fā)生突變?cè)斐筛纹鞴俨∽?，但這種突變是非致命性的，TX小鼠自身存在免疫機(jī)制來(lái)抵制這種病變并能進(jìn)行自我修復(fù)。而人類的Wilson 病患者并不存在這種自我修復(fù)的能力，因此進(jìn)一步發(fā)掘這種修復(fù)的機(jī)制或許是Wilson 病研究的一個(gè)重要方向。

2 致病機(jī)理

ATP7B 蛋白是肝細(xì)胞表達(dá)的一種銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)ATP 酶，作用是在肝細(xì)胞內(nèi)銅濃度較低時(shí)，其定位于高爾基體并協(xié)助合成全銅藍(lán)蛋白[12]; 當(dāng)肝細(xì)胞內(nèi)銅含量升高時(shí)，ATP7B 蛋白發(fā)生重定位，攜帶銅離子經(jīng)膽汁排出體外[13]。ATP7B 蛋白也同時(shí)可以結(jié)合細(xì)胞內(nèi)多余的銅，以囊泡形式轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜，然后釋放至細(xì)胞外，達(dá)到排泄銅的效果[14,15]。由于ATP7B 基因A6044G 的錯(cuò)義突變，使得ATP7B 蛋白第八跨膜區(qū)的1856 位蛋氨酸(Met)突變?yōu)槔i氨酸(Val)，編碼產(chǎn)物發(fā)生改變，合成銅藍(lán)蛋白和經(jīng)膽汁排銅的主要功能喪失，使得全銅藍(lán)蛋白轉(zhuǎn)銅功能低下,膽汁排銅效率低，使肝臟銅含量增高、機(jī)體排銅障礙，因而各個(gè)臟器銅含量顯著增加[16]。

ATP7A 與 ATP7B 蛋白屬于同一家族，其也能夠促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)銅離子的排出。ATP7A 蛋白在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中有排出多余的銅、維持細(xì)胞內(nèi)銅穩(wěn)態(tài)的作用，其機(jī)理是腦組織合成神經(jīng)遞質(zhì)、肽類、銅結(jié)合酶等物質(zhì)的一種遞呈性工具，是作為一種保護(hù)性機(jī)制而存在的蛋白，而其排銅作用只能將銅離子在不同細(xì)胞及組織之間轉(zhuǎn)移，不能代替ATP7A蛋白的功能而將銅離子排出體外[17]。近年來(lái)研究表明[18,19]， ATP7B蛋白 和 ATP7A 蛋白可以在某些部位共同表達(dá)，二者在細(xì)胞內(nèi)銅離子的排出上相輔相成，即當(dāng)細(xì)胞內(nèi)銅過(guò)高時(shí)，ATP7A蛋白移向細(xì)胞基底外側(cè)膜，而ATP7B蛋白移向細(xì)胞頂膜，各自獨(dú)立將細(xì)胞內(nèi)多余的銅排出細(xì)胞或體外[20,21]。但對(duì)動(dòng)物腎臟組織的研究表明[22-24]，ATP7B 蛋白功能并不能相應(yīng)地被 ATP7A 蛋白代償，該二種銅轉(zhuǎn)運(yùn)ATP 酶任一失活都會(huì)造成銅離子的蓄積。當(dāng) ATP7B蛋白功能發(fā)生缺陷時(shí)，腦組織內(nèi)的銅開始蓄積，首先激活的是ATP7A 蛋白的保護(hù)性作用，使得ATP7B 蛋白排銅越困難，更加重了銅在腦內(nèi)的蓄積。然而在TX小鼠胚胎發(fā)育中不同的年齡段，ATP7A 與ATP7B 銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在組織中的定位及其各自的功能不同，Roberts等[25]研究表明，ATP7A蛋白在胚胎肝組織中大量存在，而ATP7B 隨著個(gè)體發(fā)育到成熟是才大量表達(dá)，他們認(rèn)為，TX小鼠早期胚胎發(fā)育中，ATP7A調(diào)節(jié)細(xì)胞中銅穩(wěn)態(tài)，而ATP7B隨個(gè)體的發(fā)育而逐漸地合成各種含銅生物酶，若ATP7A在腦內(nèi)不能協(xié)助ATB7B蛋白排出大量蓄積的銅，便會(huì)損傷小鼠的神經(jīng)系統(tǒng)。另外，由于95%左右的銅離子是結(jié)合在全銅藍(lán)ATB7B 蛋白上的，其排銅障礙會(huì)使得TX 母鼠血清銅及乳汁銅含量的降低[27]，且一旦TX 乳鼠長(zhǎng)期食用該低銅乳汁會(huì)出現(xiàn)生長(zhǎng)遲緩、低色素化、生長(zhǎng)遲緩和運(yùn)動(dòng)障礙等表現(xiàn)[2,29]，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致死亡，因此，TX純合鼠早期需代哺乳正常母鼠乳汁才能正常生長(zhǎng)。

3 TX 小鼠的治療研究

3.1 藥物治療研究

陳林等[30]運(yùn)用中藥復(fù)方對(duì)不同月齡的TX小鼠進(jìn)行中藥肝豆湯治療，表明肝豆湯能夠調(diào)整ATP7B 蛋白表達(dá)的功能，調(diào)控銅的排泄從而控制細(xì)胞內(nèi)銅穩(wěn)態(tài)。肝豆湯治療組TX小鼠肝組織中ATP7B 蛋白含量較同月齡模型組小鼠表達(dá)高且差異顯著，認(rèn)為肝豆湯可上調(diào)肝組織中ATP7B 蛋白表達(dá)，促進(jìn)過(guò)量銅離子從膽汁中排出，降低肝細(xì)胞內(nèi)銅離子的含量。

Medici等[31,32]運(yùn)用表觀遺傳學(xué)理念治療TX 孕鼠表明，膽堿飲食可以抑制TX 胎鼠代謝缺陷基因的轉(zhuǎn)錄及肝細(xì)胞的分化，通過(guò)提高總DNA 甲基化水平，如PCA 螯合銅及膳食補(bǔ)充膽堿等來(lái)改善肝臟的損傷[33]，以此提高低銅仔鼠的存活率和壽命。

3.2 細(xì)胞治療應(yīng)用

Allen等[34]利用肝細(xì)胞移植法治療TX 小鼠4個(gè)月后表明, 其脾臟、肝臟、腎臟銅含量明顯減少，但腦中的銅含量無(wú)改變; 再利用骨髓干細(xì)胞移植法治療也能適當(dāng)?shù)卣{(diào)整其銅代謝障礙[35]。石濤等[11]同樣采用胚胎肝細(xì)胞移植治療TX 小鼠，觀察到胚胎肝細(xì)胞移植后2 周內(nèi)，TX 小鼠的血清銅由0.3 mg/L上升至0.6 mg/L，銅藍(lán)蛋白由9.0 U/L 逐漸上升至14.5 U/L, 且受體肝臟組織內(nèi)可觀察到供體細(xì)胞定居并呈結(jié)節(jié)樣的增生，可見肝細(xì)胞移植能夠使TX 小鼠銅代謝障礙得到一定的恢復(fù)。陳曦等[10]的骨髓干細(xì)胞移植治療表明，疾病早期的TX 小鼠接受治療，只能改善腦內(nèi)的銅代謝，對(duì)腎臟銅代謝不起作用。目前比較一致認(rèn)可肝細(xì)胞移植法可降低TX小鼠肝臟、腎臟和脾臟的銅含量，骨髓干細(xì)胞移植法可降低TX 小鼠腦內(nèi)銅的含量，共同到達(dá)治療改善的目的。

3.3 基因治療應(yīng)用

pcDNA3.0(+)系列的載體同時(shí)具備真核和原核細(xì)胞啟動(dòng)子一段序列, 是較理想的真核表達(dá)載體[36],其構(gòu)建的重組質(zhì)粒既可在原核生物復(fù)制又可在真核細(xì)胞中表達(dá)，是集克隆、表達(dá)和測(cè)序三合一高效的真核表達(dá)載體，適用于基因治療。湯其強(qiáng)等[37]利用基因治療法表明，100 μg 治療劑量的重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.0/ATP7B使TX 小鼠血ALT 的含量明顯下降，同時(shí)表明該ATP7B 基因質(zhì)粒也能改善TX小鼠肝功能。

4 TX 小鼠的應(yīng)用前景

4.1 蛋白質(zhì)學(xué)研究展望

TX 小鼠ATP7B 基因突變?cè)斐珊铣葾TP7B 蛋白的排銅離子能力下降，致使銅離子在小鼠各個(gè)器官中積累導(dǎo)致病變。然而突變?cè)斐葾TP7B 蛋白三維結(jié)構(gòu)的變化目前尚未研究透徹[38,39]。核磁共振波譜法、X 射線衍射晶體分析法及冰凍電鏡法是目前用于蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的主流研究方法，ATP7B 蛋白是大分子的跨膜蛋白且難以形成晶體結(jié)構(gòu)，因此并不適宜X 射線衍射晶體分析法，而核磁共振波譜法及低溫電子顯微技術(shù)不適宜大分子蛋白的三維結(jié)構(gòu)研究。國(guó)內(nèi)外對(duì)ATP7B 蛋白三維結(jié)構(gòu)的研究極少, 僅用核磁共振波譜法對(duì)ATP7B 蛋白的第3-6銅離子結(jié)合區(qū)，A 區(qū), N 區(qū)的三維結(jié)構(gòu)報(bào)道[40,41]，除此之外對(duì)ATP7B 蛋白三維結(jié)構(gòu)的研究還有計(jì)算機(jī)輔助預(yù)測(cè)分析的方法如: 同源建模、從頭預(yù)測(cè)、結(jié)構(gòu)類型識(shí)別[42,43]等，盡管這些方法具有一定的科學(xué)性，可以提前預(yù)知ATP7B 蛋白三維結(jié)構(gòu)，但是最終還是要依靠主流的三種方法對(duì)ATP7B 蛋白進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)的研究, 正因技術(shù)上存在困難造成ATP7B 蛋白研究甚少, 而排銅離子效率的減弱是ATP7B 蛋白改變所產(chǎn)生的結(jié)果, 因此, 對(duì)ATP7B 蛋白三維結(jié)構(gòu)的透徹研究是闡明TX 小鼠病變機(jī)制的重要手段。

4.2 病理學(xué)研究展望

TX 小鼠目前基本來(lái)自國(guó)外，在一定程度上缺乏了對(duì)其研究的必要條件，而系統(tǒng)性地對(duì)其病理學(xué)研究更少[44,45]，研究?jī)?nèi)容僅涉及較短時(shí)期TX小鼠的一些病理變化特征且研究點(diǎn)過(guò)于單一。本文作者認(rèn)為，對(duì)TX 小鼠病理學(xué)的研究應(yīng)該要從多方面進(jìn)行，且研究應(yīng)該涉及TX 小鼠整個(gè)生命周期，即從出生到老年直至死亡。并可用同樣月齡的野生型DL 小鼠做對(duì)照，分別收集各自的肝、腦、脾、腎、心臟、肺、骨骼肌以及皮膚組織等進(jìn)行銅離子的測(cè)定對(duì)比，除了常規(guī)病理石蠟切片外，更可以利用電鏡對(duì)以上各組織的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行探究，在細(xì)胞層次上分析銅離子積累對(duì)細(xì)胞中線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等細(xì)胞器的損害情況。

本文作者認(rèn)為，在生物學(xué)上有必要進(jìn)行以下方面的實(shí)驗(yàn)，如可通過(guò)免疫組織化學(xué)方法,了解CTR1、ATP7A、ATP7B 蛋白在各個(gè)月齡段各個(gè)器官的表達(dá)與空間定位; 也可通過(guò)Western blot 技術(shù)對(duì)各個(gè)月齡段各個(gè)器官CTR1、ATP7A、ATP7B 蛋白進(jìn)行定量檢測(cè); 以及通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法研究各個(gè)月齡段CTR1 mRNA、ATP7A mRNA、ATP7B mRNA在各個(gè)器官的表達(dá)水平。然而是否TX 小鼠銅代謝異常刺激TX 小鼠啟動(dòng)某些沉寂基因?qū)е裸~積累減少，需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)來(lái)探索，找出TX 小鼠銅積累減少的機(jī)制或許是協(xié)助治療Wilson病的重要進(jìn)展。

5 結(jié)語(yǔ)

Wilson 病是一種具有不同發(fā)病年齡和不同臨床表型的嚴(yán)重銅代謝障礙性疾病。Wilson病表現(xiàn)型的復(fù)雜多樣性表明Wilson 病的病理機(jī)制研究還存在很多尚未解決的問(wèn)題[46]。TX 小鼠盡管不表現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，無(wú)K-F 環(huán)，但其ATP7B mRNA 的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有明顯改變且ATP7B 基因功能部分保留，使具有與 Wilson 病患者相類似的病理過(guò)程和銅生化特征，且通過(guò)銅超載后對(duì)其代謝通路和病理生理改變的研究有助于深入探討Wilson 病的病理發(fā)生機(jī)制，是目前最穩(wěn)定同時(shí)也最理想的Wilson 病動(dòng)物模型，人類Wilson 病中銅積累只會(huì)隨年齡的增加而增加，而TX 小鼠在5月齡后銅積累出現(xiàn)明顯的減少趨勢(shì)，因此進(jìn)一步發(fā)掘銅積累減少的機(jī)制或許是Wilson 病研究的一個(gè)重要方向。

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Research Progress on Toxic Milk Mouse

ZHANG Wei, TANG Bin, LI Fu-rong
(Laboratory Animal Center of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, China)

Toxic milk mouse is mutant a strain that produced by DL mice at F68. The main pathological shows are low pigmentation, growth retardation, tremor and movement disturbance. The common ground with Wilson disease are autosomal recessive inheritance, and large quantities of copper deposit in adult mouse that lead the levels of serum copper and serum ceruloplasmin protein declined. This paper reviews the researches on Toxic milk from several aspects, including pathophysiology, disease mechanism, diagnostics and therapy.

Toxic milk mouse; Accumulation of copper; Protein ATP7B

Q95-33

A

1674-5817(2017)01-0473-06

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.06.014

2016-08-25

廣東省科技基礎(chǔ)條件建設(shè)項(xiàng)目(No: 2013B060300010)

張 薇(1964-), 女, 高級(jí)實(shí)驗(yàn)師, 碩士, 從事中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究工作。E-mail: zwygqj@163.com