紀永生郭文豪

（1.生物梅里埃（上海）生物制品有限公司 上海 201315；2.上海交通大學 上海 200240）

側向層析免疫診斷試劑信號放大的方法

紀永生1，2郭文豪1，2

（1.生物梅里埃（上海）生物制品有限公司 上海 201315；2.上海交通大學 上海 200240）

傳統(tǒng)的側向層析免疫診斷試劑（LFI， lateral flow immunoassay）具有快速、便宜、操作簡便等特點。但是檢測靈敏度相對于ELISA，免疫熒光，化學發(fā)光等檢測試劑較低。為提高傳統(tǒng)LFI的檢測靈敏度，研究者開發(fā)了多種方法。本文討論了常用的幾種方法，并且對各自的優(yōu)缺點進行了闡述。

側向層析 免疫診斷 信號放大

側向層析免疫診斷（Lateral flow immunoassay）是出現(xiàn)于20世紀80 年代初期的一種將免疫技術和色譜層析技術相結合的基礎上建立的一種簡單、快速的免疫學檢測技術［1］。它是將特異性的抗原或抗體以條帶狀固定在硝酸纖維素膜（NC 膜）上，把標記過的另一抗原或抗體吸附在標記物墊上，當待測樣品加到試紙條一端的樣品墊上后，通過毛細作用向前移動，溶解標記物墊上的已經標記過的抗原或抗體后相互反應，再移動至固定了抗原或抗體的區(qū)域時，待測物和標記物反應后的復合物與之發(fā)生特異性結合而被截留，聚集在檢測帶上，通過可目測的顯色標記物得到直觀的結果由于該技術操作簡便［2］，快捷，試劑成本低。操作人員不需要接受特別的培訓。因此，近30年來，它被廣泛應用于醫(yī)學診斷，工業(yè)分析，食品安全以及環(huán)境檢測等各個方面［3］。但是跟傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫檢測試劑，熒光標記免疫檢測試劑，放射標記免疫檢測試劑等等相比，靈敏度顯得相對低，為了拓寬側向層析免疫診斷試劑的應用范圍，各種放大信號，提高靈敏度的方法也被應用到側向層析免疫診斷的平臺上。本文就一些放大信號的方法做一下討論。

1 高靈敏標記物法

在側向層析免疫診斷試劑中最常用的顯色標記物是納米膠體金顆粒和納米彩色乳膠微球。采用的納米膠體金顆粒一般在10nm到60nm，而采用的納米彩色乳膠微球一般在200nm到400nm。膠體金顆粒表面積小，蛋白吸附的少，但是顏色深。乳膠顆粒表面積大，蛋白吸附的多，但是顏色淺。兩者在實際應用中，體現(xiàn)的靈敏度比較接近。為了尋求更高的靈敏度，其他各類標記物也被應用到了側向層析免疫診斷的平臺上。

1.1 量子點quantum dots

量子點（q u a n t u md o t s），又稱半導體納米微晶粒（semiconductor nanocrystal），通常是由ⅡB和ⅥA族元素組成，目前研究較多的主要是CdX（X=S、Se、Te）。通常量子點的研究粒徑范圍為2～20nm，在受到光激發(fā)或電壓后能產生熒光發(fā)射［4］。量子點也可以標記各種分子到它們的表面，因此它也被應用到了側向免疫層析免疫診斷試劑中，作為顯色標記物，取代膠體金顆?；蛘呷槟z顆粒。但是需要配備紫外燈去激發(fā)量子點的熒光，同時要熒光讀數儀判讀結果，或者用數碼相機拍攝顯示熒光的照片。如果需要肉眼判讀結果，需要佩戴橙色過濾眼睛。相比于膠體金，熒光量子點可以提高靈敏度10到300倍。但是提高靈敏度的同時，也丟失了LFIA一部分簡便的特性，它需要額外的儀器去做判讀。

1.2 磁珠Magnetic Nanoparticle

磁珠是指有磁性的Fe3O4顆粒。體積可以從nm級到um級。與膠體金顆粒相比，磁珠沒有鮮明的顏色，呈深褐色。除了肉眼可辨外，它也可以通過磁信號檢測進行追蹤。同時，用磁珠作為標記物制成的檢測試劑，信號可以長時間保存，在首次檢測以后可以再回顧復測。相比于常規(guī)的膠體金檢測試劑，用磁信號檢測時，靈敏度能提高40倍［5］。缺點是與量子點標記一樣，需要額外的儀器幫助判讀。

1.3 上轉換磷光材料標記UCP

上轉換磷光材料（UCP）是一種可以對能量進行尚轉換的稀土金屬合成物。它在紅外光激發(fā)下，能夠發(fā)射波長短于激發(fā)光的可見光。用UCP材料作為標記物，可以大幅提高檢測的靈敏。同時由于不同的UCP材料具有不同的特征光譜， 可以一次性對生物樣品的多種目標進行檢測。而獨特的上轉換發(fā)光現(xiàn)象，使它跟其他的熒光材料相比，消除了待檢樣品自發(fā)熒光的干擾，提高了信噪比。同其他的熒光標記物一樣，UCP也需要熒光讀數儀來判讀。

1.4 酶標記Enzyme

采用ELISA的方法，將標記物墊上的蛋白標記上酶，如HRP ，試劑條的其他結構不變。在第一步加入樣品層析完成以后，再加入底物，通過顯色反應得到不同強度的條帶。相較于普通的側向層析，測試的步驟增加了，需要添加底物，以及清洗。整體的測試時間也會延長。如果催化產生的是熒光，那么同樣還需要熒光讀數儀進行判讀。雖然信號放大了，但是需要耗費的成本也增加了。

1.5 同時采用金顆粒標記和酶標記

（1）將HRP酶標記到金顆粒上［6］。（2）將HRP酶標記到抗體或抗原上，然后把抗體或抗原再標記到金顆粒上。HRP催化底物（3，30，5，50-Tetramethylbenzidine （TMB）； 3-Amino-9-ethylcarbazole（AEC）； 3，30-Diaminobenzidine tetrahydrochloride （DAB））反應顯色。同時金顆粒的存在也會加強酶催化底物的顯色反應。這個三個底物產生的顯色物是非可溶性的，因此不會發(fā)生層析，從而留在本來已經產生的色帶的位置，從而加強了信號。同單酶標記一樣，操作時需加入，清洗，加底物，清洗等環(huán)節(jié)，因此操作步驟增加，測試時間延長。

1.6 銀染法

由于操作簡單，靈敏度高等特點。銀離子在納米金顆粒外部成核的現(xiàn)象已經被廣泛應用于定性和定量的生物感應器的信號放大。側向層析免疫診斷試劑也可以用銀染法獲得更高的靈敏度。當然，它是建立在金顆粒標記的基礎上的。在第一步層析免疫反應已經完畢后，金顆粒已經在測試線聚集。在試劑條測試線的位置加入硝酸銀溶液和氫醌溶液或者將試劑條浸入溶液中，使已在抗原位置沉積的金顆粒發(fā)揮催化作用，促進銀離子被氫醌還原為銀原子，后者圍繞金顆粒形成一層黑色的銀殼，而大幅度增強色帶的深度。放大的效果是在10倍以上［7］。可是作為快速診斷試劑，在側向層析免疫反應完成以后，額外還要進行銀染，同樣還是增加了操作步驟。為了達到平常的側向層析免疫診斷試劑的操作簡易程度。

1.7 紅外信號檢測法

金屬納米顆粒在光照下產熱。通過這個原理，運用普通的LED光源和紅外線接收槍也可以大幅提高普通金標記的側向層析免疫診斷試劑的靈敏度。提高幅度達32倍，甚至有潛力到1000倍。采用這種方法，無需對傳統(tǒng)的金標記側向層析免疫診斷試劑做改變。無需更換標記物。只需要建立參考值或標準曲線。需要更多考慮的是如何才能產生穩(wěn)定的熱信號，將CV控制的盡量低。

1.8 聚合金顆粒法

聚酰胺-胺型樹枝狀高分子（PAMAM），像樹枝一樣，具有很多分叉，水溶性，是具有多功能性的大分子?？梢远ㄖ凭_的大小和形狀，以及表面的基團。得益于外圍的功能性樹枝狀基團，很多位點可以用來連接各種分子，以及納米顆粒，比如量子點。納米金顆粒通過電荷作用同樣也可以連接到PAMAM的表面。單個納米金顆粒由于體積小，能包被的抗體或抗原比較少，通過PAMAM的作用，可以將多個納米金顆粒組成納米金團，增大單個金團的表面積，增加抗體抗原的包被量，從而提高靈敏度。聚合金顆粒法相比傳統(tǒng)的單金顆粒側向層析免疫診斷試劑，依然可以用肉眼判讀。主要改變的就是增加了聚合單個納米金顆粒成為納米金團的步驟，隨后標記抗原抗體，以及制作其他組分的過程都一樣，而靈敏度可以提高20倍。所以在側向層析免疫診斷試劑開發(fā)的過程中有較大的應用潛力。所需要特別注意的是，嚴格控制PAMAM的量，以及聚集時間，避免過多的納米金顆粒聚集從而沉淀。

1.9 雙層金標墊法

傳統(tǒng)金標記側向層析免疫診斷試劑在樣品墊和膜之間有一層標記墊。雙層金標墊法就是在傳統(tǒng)的試劑結構上再加一層金標墊。這上面包被的金顆粒，用于捕獲另一層金標墊的傷的金顆粒。第一層的金顆粒了標記了捕獲目標抗原的抗體，同時用BSA進行封閉。所以最后金顆粒連著的是抗體以及BSA。第二層的金顆粒包被抗-BSA抗體，再選用另一個封閉劑封閉（人血白蛋白，PEG等）。在反應過程中，第一層的金顆粒上的抗體抓住抗原，再被另一個包被在膜上的抗體截留在測試線。第二層的金顆粒在層析的過程中，被第一層的金顆粒攔截。從而使更多的納米金顆粒在測試線位置聚集放大測試信號。雙層金標墊方法可以使靈敏度提高40到1000倍［8］。

2 改變試劑條結構

在銀染法中已經提到過，研究者結合銀染法，運用雙向層析結構，使得銀染操作也在一步完成，以便獲得高靈敏度的同時，保留操作的簡易性。這一節(jié)講的是，傳統(tǒng)試劑條結構的變化對信號放大的作用。研究者通過增加金標墊和樣品墊的尺寸，保留測試線原有的寬度，提高了標記物的使用了，而且延長了層析反應的時間，最后獲得靈敏的提高，信號放大了約8倍。試劑條整體改動的不大，但是對于生產卻增加了不少難度。并且由于增加了樣品墊的尺寸，對樣品的加入量也有了更大的需求。

2.1 改變操作過程

為了獲得高靈敏度，有研究者采取了濃縮樣品中目標蛋白的方法，獲得更高濃度的目標蛋白復合物的濃度，再加入到試劑條上，進行測試。靈敏度也能提高10倍。濃縮的方法是借用Triton X114能與水在4度混溶，而在37度能形成水相和去污劑相的原理，以及生物分子的疏水性和分子量大小等特性會讓它們在水相和去污相形成不同分布濃度的特性實現(xiàn)的［24］。研究也嘗試了將金顆粒與樣本混合反應后再進行濃縮，同意也是可行的。雖然兩者在不同的檢測項目上都顯現(xiàn)出了10倍的信號放大，但是混合金顆粒和樣本，加長了樣本與金顆粒的反應時間，所以有著更高放大倍數的可能性。相對于傳統(tǒng)操作方法，多了預加樣，并且需要不同溫度的孵育，對于POC的應用提出較高的條件，但是對于靈敏度的提高，效果還是比較直觀的。

2.2 應用Streptavidin-biotin系統(tǒng)

Streptavidin和biotin是一對具有高親和力的物質，至少比抗原-抗體結合力高百萬倍， 是目前發(fā)現(xiàn)的自然界中具有最強親和力的物質［9］。在雙層金標墊法中，Streptavidin-biotin被用來作為兩個金顆粒之間的連接系統(tǒng)。除了這個應用外，它也被直接應用于傳統(tǒng)的側向層析免疫診斷試劑，用于信號放大。

3 總結

LFI已經在醫(yī)學，工業(yè)，研究多個領域得到了廣泛的應用，通過各種信號放大的方法，LFI檢測靈敏度得到進一步提高，應用范圍也將更將寬廣。在將來，信號放大的方法也將進一步融合，使得信號得到層級放大，最后接近甚至達到各類大型自動化免疫儀器所具有的靈敏水平。

［1］祖立闖，王金良，李嬌，沈志強.膠體金免疫層析技術在動物疫病診斷上的應用［J］.動物醫(yī)學進展，2010（8）：101-105

［2］鞠瑩，曹遠銀.膠體金免疫層析快速診斷技術［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學進展，2009（11）：2191-2193

［3］袁志杰，楊柳，鄭文杰，何剛，羅曉慶.膠體金免疫層析技術的研究現(xiàn)狀與前景［J］.齊齊哈爾醫(yī)學院學報，2015（1）：84-85.

［4］嚴拯宇，黃玉，廖聲華.Ⅰ-Ⅲ-Ⅵ族量子點的合成方法和生物應用［J］.化學通報，2015（2）：113-118.

［5］Liu，C.，Jia，Q.，Yang，C.，Qiao，R.，Jing，L.，Wang， L.，Xu，C.，Gao，M.Lateral flow immunochromatographic assay for sensitive pesticide detection by using Fe3O4 nanoparticle aggregates as color reagents，Anal Chem.2011 Sep 1；83（17）：6778-84. doi：10.1021/ac201462d. Epub 2011Aug9.

［6］Wang，Yuhong，F(xiàn)ill，Catherine，Nugen，Sam R Development of chemiluminescent lateral flow assay for the detection of nucleic acids，Biosensors，Volume 2，Issue 1，page 32-42.

［7］Anfossi，L.，Di Nardo，F(xiàn).，Giovannoli，C.，Passini， C.，Baggiani，C.，Increased sensitivity of lateral flow immunoassay for ochratoxin A through silver enhancement，2013 Dec；405（30）：9859-67

［8］Zhu，J.，Zou，N.，Mao，H.，Wang，P.，Zhu，D.，Ji，H.，Cong，H.，Sun，C.，Wang， H.，Zhang， F.，Qian， J.，Jin， Q.，Zhao，J.，Evaluation of a modified lateral flow immunoassay for detection of high-sensitivity cardiac troponin I and myoglobin，Biosens Bioelectron.2013 Apr15；42：522-5.

［9］孔令青，李勇，高洪，嚴玉霖.生物素-親和素標記技術［J］.動物醫(yī)學進展，2008 （4）：100-102.

R446.6

A

1674-2060（2016）01-0102-02