劉來兵， 劉　健，**， 出良釗，， 楊　華，， 李玉美

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬白云醫(yī)院， 貴州 貴陽　550014； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)， 貴州 貴陽　550004)

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人腦膠質(zhì)瘤細胞體外培養(yǎng)與形態(tài)學(xué)觀察*

劉來兵1， 劉健1，2**， 出良釗1，2， 楊華1，2， 李玉美2

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬白云醫(yī)院， 貴州 貴陽550014； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)， 貴州 貴陽550004)

[摘要]目的： 探討人腦膠質(zhì)瘤原代細胞體外培養(yǎng)的方法。方法： 手術(shù)切除腦膠質(zhì)瘤患者的病灶組織，采用機械分離胰酶消化法獲取膠質(zhì)瘤細胞，倒置顯微鏡下觀察膠質(zhì)瘤細胞的形態(tài)學(xué)變化，通過差速貼壁、反復(fù)傳代、自然純化法獲得純度高、生物性狀穩(wěn)定、增殖能力強的細胞株，繪制細胞生長曲線，免疫組織化學(xué)技術(shù)鑒定原代細胞及其純度。結(jié)果： 培養(yǎng)成功的原代細胞貼壁生長狀態(tài)好，有明顯的對數(shù)生長期；惡性程度越高細胞增殖越快，可傳代培養(yǎng)，膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP)染色陽性率達93%，證明培養(yǎng)的細胞為純度較高的膠質(zhì)瘤細胞。結(jié)論： 機械分離胰酶消化法適合于體外膠質(zhì)瘤細胞的原代培養(yǎng)。

[關(guān)鍵詞]神經(jīng)膠質(zhì)瘤； 胰酶; 消化; 細胞培養(yǎng); 生長曲線; 免疫組織化學(xué)

腦膠質(zhì)瘤是發(fā)生于神經(jīng)外胚層的惡性腫瘤，在成人的發(fā)病率約為6/10萬，5年生存率20%～30%[1-3]。部分腦膠質(zhì)瘤惡性程度高，生存期短。原代細胞剛從腫瘤組織中分離出來，包含了腫瘤細胞的各種信號，生物學(xué)特性沒有發(fā)生很大的變化，仍保留原來的遺傳學(xué)特性，這樣培養(yǎng)出的腫瘤細胞與在體腫瘤細胞的真實狀態(tài)最接近, 是研究抗腫瘤藥物作用機制及腫瘤基因表達的理想細胞模型[4]。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1標本來源

收集2011年10月～2012年3月15例腦膠質(zhì)瘤患者新鮮手術(shù)標本進行細胞培養(yǎng)，所取標本征得患者或家屬的知情同意，所有標本經(jīng)術(shù)后病理檢查確診。其中男9例，女6例，22～67歲，平均45.2歲。按WHO(2007)中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類標準[5]：星形細胞瘤6例(Ⅱ級)，間變形星形細胞瘤6例(Ⅲ級)，膠質(zhì)母細胞瘤3例(Ⅳ)。

1.1.2實驗儀器及試劑

CO2培養(yǎng)箱(日本SANYO)，DMEM/F12(Hyclone公司)，鼠抗人GFAP(武漢博士德)，SABC試劑盒(北京中杉金橋)等。

1.2方法

1.2.1原代細胞培養(yǎng)將手術(shù)切除的新鮮腫瘤標本(選擇腫瘤細胞豐富的實質(zhì), 避開與正常組織交界區(qū)、鈣化處、出血、壞死液化區(qū))放入含雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)液的瓶中，冰浴下立即送實驗室；鏡下選取較單純的腫瘤組織(剔除壞死組織和血管等組織)，眼科剪剪成約1 mm3小塊，研磨約1 min，滴加適量的胰酶-EDTA(0.02%EDTA及0.25%胰蛋白酶)37 ℃消化5 min，終止消化后用吸管輕輕吹打，使細胞盡量分散，用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾；過濾后的懸液離心、重懸，按5×104/mL接種于50 mL的培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)30 min后，將細胞懸液移至另一培養(yǎng)瓶中，去除成纖維細胞，48 h后更換培養(yǎng)液，棄除未貼壁細胞，以后每3 d換液1次。倒置相差顯微鏡下觀察不同時期細胞的生長情況并照相。

1.2.2傳代及純化細胞細胞融合達80%～90%后，滴加胰酶-EDTA(0.02%EDTA及0.25%胰蛋白酶)37℃消化，當觀察到細胞突起回縮、形態(tài)變圓、細胞間隙變大，約有80%細胞漂浮時，加入等體積的含10% FBS的DMEM/F12完全培養(yǎng)基中止消化；按1∶2傳代，經(jīng)多次傳代擴增培養(yǎng)，使細胞逐漸得到純化和擴增。

1.2.3細胞生長曲線的測定取已鋪滿培養(yǎng)瓶底的膠質(zhì)瘤細胞，消化后以5×104個/mL的密度接種于24孔培養(yǎng)板。每24 h取3孔進行細胞計數(shù)，連續(xù)7 d，以細胞數(shù)量為縱坐標，時間為橫坐標繪制細胞生長曲線。按Patterson 公式計算細胞倍增時間為：Td=tlg 2/lg(Nt/No)，其中Td為倍增時間(h)，t為細胞數(shù)由No增至Nt所需的時間，No為接種時的細胞數(shù)，Nt為培養(yǎng)t h后的細胞數(shù)。

1.2.4鑒定腫瘤細胞收獲P3代生長狀態(tài)良好的細胞， 4%多聚甲醛液固定，滴加相應(yīng)的GFAP一抗(滴度1∶100)，4 ℃過夜，滴加相應(yīng)的二抗，DAB顯色，脫水，透明，中性樹膠封片，在高倍鏡下(400×)隨機選取10個視野，計數(shù)1 000個腫瘤細胞中陽性腫瘤細胞所占的百分率。

2結(jié)果

2.1人膠質(zhì)瘤原代培養(yǎng)細胞

接種后48 h換液，去除不貼壁的細胞和碎片后，鏡下可見單個分散或數(shù)個克隆樣貼壁的細胞，形態(tài)較為均勻，呈棱形伸展狀態(tài)或多邊形，以棱形細胞為主(圖1A)；第3天可觀察到貼壁細胞有分裂增殖，細胞數(shù)目增加明顯，腫瘤細胞形態(tài)多樣，呈棱形、三角形、多角形等，細胞輪廓清晰(圖1B)。4～5 d原代培養(yǎng)的細胞逐漸形成分散的細胞集落(圖1C)，于培養(yǎng)6～7 d天漸漸鋪滿培養(yǎng)瓶底，細胞達90%融合(圖1D)，呈鋪路石樣排列，惡性程度越高細胞增殖越快。

2.2傳代及純化細胞

培養(yǎng)的細胞達90%左右融合時，消化傳代。傳代的細胞形態(tài)與原代相似，傳代細胞生長潛伏期短，接種2～3 h后即貼壁伸展，逐漸恢復(fù)為棱形，12～24 h完全貼壁，傳代后的細胞增殖速度較快， 3～5 d即可傳代1次，且細胞形態(tài)單一均勻，呈鋪路石樣排列(圖2A、2B)。

2.3細胞生長曲線

生長曲線顯示細胞接種第2天后細胞進入對數(shù)生長期，第3～5天為對數(shù)生長期，培養(yǎng)第7天細胞增殖達到高峰，第7天后細胞生長進入平臺期，見圖3。

2.4第3代人膠質(zhì)瘤細胞鑒定

注：A 為培養(yǎng)48 h(200×),B為培養(yǎng)第3天(200×),C為培養(yǎng)第5天(200×),D為培養(yǎng)第7天(100×)圖1　原代培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤細胞Fig.1　Primary cultured glioma cells

注：A為第3代培養(yǎng)第2天(200×),B為第3代培養(yǎng)第5天(100×)圖2　傳代培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤細胞Fig.2　Subcultured glioma cells

圖3　膠質(zhì)瘤細胞生長曲線圖Fig.3　The glioma cell growth curve

原代培養(yǎng)的人膠質(zhì)瘤細胞經(jīng)純化傳代至第3代時，絕大多數(shù)腫瘤細胞膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP)染色陽性，細胞胞漿呈現(xiàn)棕黃色顆粒，陽性率達93%，證實所培養(yǎng)的細胞為膠質(zhì)瘤細胞(圖4A、B)。

注：A、B分別為第3代培養(yǎng)第5天細胞GFAP的表達(SABC×100，×400)圖4　第3代人膠質(zhì)瘤細胞的GFAP表達Fig.4　The GFAP expression of the third generation cells cultured for 5 days

3討論

腦膠質(zhì)瘤是顱腦腫瘤中最常見的一種，嚴重危害患者的健康。膠質(zhì)瘤細胞的原代培養(yǎng)是直接取患者的腫瘤組織在體外進行擴增、培養(yǎng)，因剛從組織中分離，其生物學(xué)特性還未發(fā)生很大的變化，仍保留原來的遺傳學(xué)特性，也最接近體內(nèi)細胞的生長特性[6],適用于藥物敏感試驗、細胞分化等實驗研究。國內(nèi)外已有大量關(guān)于膠質(zhì)瘤原代細胞培養(yǎng)的研究[7-8],腦膠質(zhì)瘤細胞的原代培養(yǎng)在膠質(zhì)瘤研究的各個領(lǐng)域均得到廣泛的應(yīng)用。

原代細胞培養(yǎng)方法有酶消化法和組織塊培養(yǎng)法，對方法的選擇很多學(xué)者持有不同的觀點[9]。本實驗先用研磨器研磨機械分離細胞，再加入胰酶短時間消化，不銹鋼濾網(wǎng)過濾進行體外培養(yǎng)，這樣既避開了單純酶消化法步驟多、組織需要量大的缺點, 還可以減輕長時間酶消化時對原代細胞的損傷作用；同時也摒棄了組織塊培養(yǎng)法細胞周期很長、成功率低等缺點，很適合目前的科學(xué)研究的需要。

大量研究證實GFAP是一種由膠質(zhì)細胞特異表達的中間絲細胞骨架蛋白，決定膠質(zhì)細胞的結(jié)構(gòu)和功能[10]。細胞的惡性轉(zhuǎn)化與細胞的形態(tài)改變密切相關(guān)，細胞形態(tài)一旦改變該細胞的生長特性與功能必發(fā)生改變。決定細胞形態(tài)的物質(zhì)主要與細胞骨架有關(guān)。真核生物細胞的骨架主要由肌動蛋白、微絲及介于兩者之間的中間絲三類網(wǎng)狀蛋白質(zhì)構(gòu)成，其中以中間絲變異高，并顯示出特異性的表達。目前GFAP是最常用于識別正?；虿±砬闆r下膠質(zhì)細胞來源的一種特異性的蛋白質(zhì)[11]。本實驗在倒置顯微鏡下觀察到體外原代培養(yǎng)細胞形態(tài)多樣，有梭形、三角形、多角形，以棱形為主，這與眾多文獻報告的原代膠質(zhì)瘤細胞的形態(tài)相符，且通過傳代的純化，細胞形態(tài)逐漸均勻、單一，以棱形為主。選用第3代細胞生長狀態(tài)良好的膠質(zhì)瘤細胞采用免疫組織化學(xué)的方法檢測膠質(zhì)細胞特異性的標志物GFAP的表達，結(jié)果顯示腫瘤細胞高度表達GFAP，胞質(zhì)染成棕黃色，陽性細胞率達93%，證明所培養(yǎng)的細胞為膠質(zhì)瘤細胞，且純度較高。

本實驗采用機械分離胰酶消化法成功培養(yǎng)出人腦膠質(zhì)瘤細胞，為下一步深入研究膠質(zhì)瘤的生物學(xué)特性及體外藥物敏感性試驗、動物驗證實驗等奠定了基礎(chǔ)。

4參考文獻

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(2015-09-27收稿，2015-11-05修回)

中文編輯： 周凌； 英文編輯： 劉華

Culture of Primary Human Glioma Cellsinvitroand Morphological Observation

LIU Laibing1, LIU Jian1，2, CHU Liangzhao1，2, YANG Hua1，2, LI Yumei2

(1.AffiliatedBaiyunHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550014,Guizhou,China;2.GuizhouMedcialUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To probe the method of culturing primary human glioma cells in vitro. Methods: Glioma cells were obtained by mechanical separation and enzymatic digestion of glioma patients' focus tissue removed by surgical resection. The morphological changes of these glioma cells were observed under inverted microscope. The cell lines of high purity, biological traits stability, strong capacity of proliferation were obtained by differential speed stick wall, repeated passaging and natural purification. The cell growth curve was drawn and immunohistochemical technique was adopted to identify the primary cells and their purity. Results: The primary cells that were cultured successfully showed a good growing status of adhering to wall, apparent logarithmic growth period. The higher malignant degree of primary cells, the faster the proliferation. Those cells could be subcultured. The positive staining rate of glial fibrillar acidic protein (GFAP) was up to 93%, proving the cultured cells were glioma cells of high purity. Conclusion: The human glioma cells can be cultured by mechanical separation and enzymatic digestion.

[Key words]glioma cells; pancreatin; digestion; cell culture; growth curve; immunohistochemistry

[中圖分類號]R739.41

[文獻標識碼]A

[文章編號]1000-2707(2016)01-0024-03

*[基金項目]國家自然科學(xué)基金(81560409)；貴陽市社會發(fā)展與民生科技計劃[筑科合同(2012)103.39號]；貴州省科技局聯(lián)合基金[黔科合LG字(2012)069號]； 教育部“創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃”[國家教育部科技司(教技涵509-IRT13058)]

**通信作者 E-mail:136721361@qq.com網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-01-07

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160107.2042.050.html