小鼠骨髓來源調(diào)節(jié)性樹突狀細(xì)胞的體外誘導(dǎo)分化及鑒定

王進(jìn)京，袁晶華，喬磊，劉義，張曉寧，李克秋，李光

(天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，天津300070)

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小鼠骨髓來源調(diào)節(jié)性樹突狀細(xì)胞的體外誘導(dǎo)分化及鑒定

王進(jìn)京，袁晶華，喬磊，劉義，張曉寧，李克秋，李光

(天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，天津300070)

摘要：目的建立小鼠骨髓來源調(diào)節(jié)性樹突狀細(xì)胞(DCreg)體外誘導(dǎo)培養(yǎng)和擴(kuò)增的方法，并進(jìn)行生物學(xué)及功能鑒定。方法取小鼠骨髓單個核細(xì)胞(BM-MNCs)，用重組小鼠白細(xì)胞介素4(rmIL-4)及重組小鼠粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rmGM-CSF)誘導(dǎo)分化，第6天細(xì)胞中含大量DCreg；取部分細(xì)胞加脂多糖(LPS)，繼續(xù)培養(yǎng)2 d(第8天)分化為成熟DC(mDC)。觀察培養(yǎng)過程中細(xì)胞形態(tài)變化，流式細(xì)胞術(shù)檢測DCreg特異性表面分子CD11b和共刺激分子CD40、CD86。取小鼠脾臟分離的CD8+ T細(xì)胞，隨機(jī)分為3組；A、B組將細(xì)胞分別與DCreg、mDC以5∶1、10∶1、20∶1混合培養(yǎng)4 d，C組細(xì)胞不處理。采用CFSE標(biāo)記法檢測CD8+ T細(xì)胞增殖情況，Real-time PCR檢測CD8+ T細(xì)胞免疫功能分子穿孔素(Prf1)和顆粒酶B(GzmB)mRNA。結(jié)果新分離的BM-MNCs呈圓形，體積較??；誘導(dǎo)第6天細(xì)胞集落數(shù)量增多，體積增大，細(xì)胞表面突起增多,CD11b陽性細(xì)胞比例達(dá)96.1%±2.7%。與mDC相比，DCreg中CD40、CD86表達(dá)陽性率降低(P均<0.05)。與B組比較，A組細(xì)胞增殖率降低(P均<0.05)；與B、C組比較，A組Prf1、GzmB mRNA表達(dá)量降低(P均<0.05)，與C組比較，B組GzmB mRNA表達(dá)量升高(P均<0.05)。結(jié)論rmGM-CSF聯(lián)合rmIL-4可成功誘導(dǎo)小鼠BM-MNCs向DCreg分化，且純度高，并具有免疫抑制功能。

關(guān)鍵詞：調(diào)節(jié)性樹突狀細(xì)胞；器官移植；免疫耐受；細(xì)胞培養(yǎng)；穿孔素；顆粒酶B

肝移植是治療終末期肝衰竭最有效的手段，尋找誘導(dǎo)肝移植免疫耐受的有效方法是研究的熱點(diǎn)之一[1]。調(diào)節(jié)性樹突狀細(xì)胞(DCreg)又稱耐受性樹突細(xì)胞(DC)，多為未成熟狀態(tài)的樹突狀細(xì)胞(imDC)，表達(dá)低水平的MHC-Ⅱ類分子及共刺激分子(CD40、CD86等)，抗原吞噬能力極強(qiáng)，但活化T細(xì)胞的能力較弱，還能抑制免疫活化分子的分泌，促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)增殖以誘導(dǎo)免疫耐受[2～4]。肝臟內(nèi)含有大量DCreg[5]，探索其具體作用可為肝移植基礎(chǔ)研究與臨床應(yīng)用提供新思路[6,7]。由于DCreg在體內(nèi)含量低，且直接從體內(nèi)分離既操作復(fù)雜又難以純化[8]，2014年12月～2015年6月，我們應(yīng)用重組小鼠白細(xì)胞介素4(rmIL-4)聯(lián)合重組小鼠粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rmGM-CSF)成功誘導(dǎo)小鼠骨髓來源單個核細(xì)胞(BM-MNCs)向DCreg分化和擴(kuò)增，為進(jìn)一步研究DCreg在肝移植免疫耐受中的作用奠定了基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料BM-MNCs分離自SPF級健康雄性C57BL/6小鼠(北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，6～8周齡，體質(zhì)量18～20 g)，用含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為(1～2)×107/mL。主要試劑：RPMI 1640培養(yǎng)基及細(xì)胞培養(yǎng)板(美國Corning公司)；胎牛血清(FBS，以色列BI公司)；rmGM-CSF、rmIL-4(美國BD公司)；抗小鼠CD11b、CD40、CD86抗體及其同型對照抗體(美國eBioscience公司)；小鼠CD8磁珠及分選柱(德國Miltenyi公司)；免疫功能分子穿孔素(Prf1)和顆粒酶B(GzmB)基因引物由上海生工合成。

1.2方法

1.2.1小鼠BM-MNCs向DCreg的誘導(dǎo)分化與擴(kuò)增將細(xì)胞以2×105/孔接種于12孔培養(yǎng)板，加入終濃度10 ng/mL的rmIL-4、20 ng/mL的rmGSM-CSF，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第3、5天半量換液并補(bǔ)足細(xì)胞因子。培養(yǎng)第6天，輕輕吹洗細(xì)胞培養(yǎng)孔，收集半懸浮細(xì)胞及疏松貼壁細(xì)胞即為imDC(含大量DCreg)。取部分細(xì)胞加入1 μg/mL的脂多糖(LPS)，繼續(xù)培養(yǎng)2 d(第8天)即可分化為成熟DC(mDC)。

1.2.2細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察培養(yǎng)過程中，每天用倒置顯微鏡觀察所誘導(dǎo)培養(yǎng)DC的形態(tài)特點(diǎn)。

1.2.3DCreg細(xì)胞表型分析采用流式細(xì)胞術(shù)。分別收集培養(yǎng)第3、6、8 天的細(xì)胞，洗滌懸浮后標(biāo)記熒光抗體：PE標(biāo)記CD11b，F(xiàn)ITC標(biāo)記CD40和CD86(僅測第6、8 天的細(xì)胞)。流式細(xì)胞術(shù)檢測各表面標(biāo)記物，以DCreg特異性分子CD11b陽性細(xì)胞所占比例表示其純度。

1.2.4DCreg免疫調(diào)節(jié)功能觀察采用混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)。①CD8+T淋巴細(xì)胞增殖觀察：采用羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂(CFSE)法。參考文獻(xiàn)[9]分離正常C57BL/6小鼠脾臟淋巴細(xì)胞，免疫磁珠法分選CD8+T細(xì)胞。CFSE標(biāo)記CD8+T細(xì)胞，將細(xì)胞分為3組。A、B組將細(xì)胞分別與DCreg、mDC以不同比例(5∶1、10∶1、20∶1)加入96孔板混合培養(yǎng)，調(diào)整每孔培養(yǎng)液至200 μL；37 ℃、5% CO2共培養(yǎng)4 d；C組不處理。收集懸浮細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測CD8+T細(xì)胞的熒光值，以CFSE熒光強(qiáng)度減弱比率代表各組的增殖率。各組均設(shè)3個復(fù)孔，取平均值。②免疫功能分子Prf1和GzmB mRNA檢測：采用Real-time PCR法。收集混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)體系中的各組細(xì)胞，TRIzol法提取總RNA，經(jīng)cDNA第一鏈合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA；Real-time PCR檢測細(xì)胞免疫功能分子Prf1和GzmB mRNA表達(dá)水平。Prf1基因引物上游為5′-CGGTGTCGTGTGGAACAATA-3′、下游為5′-TCATCATCCCAGCCGTAGTC-3′，產(chǎn)物長度為126 bp ；GzmB基因引物上游為5′-GACCCAGCAAGTCATCCCTA-3′、下游為5′-CCAGCCACATAGCACACATC-3′，產(chǎn)物長度為186 bp。并以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參照，以2-ΔΔCT法分析基因相對表達(dá)量。

2結(jié)果

2.1細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化小鼠BM-MNCs經(jīng)rmIL-4和rmGM-CSF聯(lián)合誘導(dǎo)24 h后，顯微鏡下可見多數(shù)細(xì)胞貼壁生長，體積較小，多為圓形，少部分懸浮生長；培養(yǎng)3 d后大量細(xì)胞集落形成，細(xì)胞數(shù)量顯著增多，細(xì)胞體積增大，形狀不規(guī)則，細(xì)胞表面出現(xiàn)短的毛刺樣突起，貼壁細(xì)胞減少，可見有突起的懸浮細(xì)胞；培養(yǎng)6 d時可見大部分為懸浮細(xì)胞，集落數(shù)增多，集落體積明顯增大，可見懸浮細(xì)胞表面有較多的短毛刺樣突起。加入LPS繼續(xù)培養(yǎng)2 d后，細(xì)胞集落呈分散狀態(tài)，細(xì)胞分布比較均勻，細(xì)胞表面突起明顯伸長，可見典型的較長的樹枝樣突起。

2.2DCreg細(xì)胞CD11b表達(dá)變化小鼠BM-MNCs培養(yǎng)第6、8天CD11b陽性表達(dá)率分別為96.1%±2.7%、90.5%±0.4%，高于培養(yǎng)第3天的69.1%±2.50%(P均<0.05)；第6、8天CD11b陽性表達(dá)率比較，P>0.05。

2.3DCreg細(xì)胞CD40和CD86表達(dá)變化小鼠BM-MNCs誘導(dǎo)培養(yǎng)第6天細(xì)胞CD40、CD86陽性表達(dá)率分別為21.2%±3.2%和18.7%±3.5%，第8天分別為66.9%±3.4%和70.9%±1.7%，P均<0.05。

2.4DCreg對CD8+T細(xì)胞增殖的影響見表1。

表1　DCreg對CD8+ T細(xì)胞增殖的影響

注：與A組同濃度比較，*P<0.05。

2.5DCreg對CD8+T細(xì)胞GzmB和Prf1 基因表達(dá)的影響見表2。

表2　各組CD8+ T細(xì)胞GzmB及Prf1 mRNA相對

注：與A組同濃度比較，*P<0.05；與C組比較，#P<0.05。

3討論

肝移植排斥反應(yīng)和免疫抑制劑不良反應(yīng)嚴(yán)重影響移植物的長期存活，有效誘導(dǎo)肝移植免疫耐受是治療關(guān)鍵[10]。DC作為體內(nèi)最強(qiáng)大的專職抗原提呈細(xì)胞，處于免疫反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)，不僅參與抗原特異性免疫反應(yīng)的活化，還參與免疫耐受的建立和維持[11]。DC主要來源于CD34+造血干細(xì)胞，不同來源和不同分化階段的DC功能有一定差異[6]。目前研究表明，mDC可被炎癥信號激活，進(jìn)而促進(jìn)T細(xì)胞活化與增殖，誘導(dǎo)特異性T細(xì)胞反應(yīng)；DCreg雖具有很強(qiáng)的抗原處理能力，但低表達(dá)CD40、CD80、CD86和MHC-Ⅱ類分子，可抑制T細(xì)胞活化，具有促免疫耐受性調(diào)節(jié)功能[7,12]。有研究表明，骨髓來源的DCreg在同種異基因皮膚移植、腎移植和角膜移植中具有誘導(dǎo)免疫耐受和預(yù)防免疫排斥發(fā)生的作用[13～15]。

研究表明，骨髓來源的CD34+造血干細(xì)胞數(shù)量多且純度高，更適合體外誘導(dǎo)培養(yǎng)DCreg[16]。培養(yǎng)體系中細(xì)胞因子的種類和濃度決定了干細(xì)胞向不同譜系定向分化。本研究中的rmGM-CSF主要促進(jìn)造血干細(xì)胞向DC定向分化，但還會向中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分化，所以DC純度較低。由于rmIL-4能抑制造血干細(xì)胞向中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分化，故聯(lián)合rmIL-4后可獲得數(shù)量較多、純度較高的DC[17]。

DC表面的共刺激分子不僅參與了細(xì)胞發(fā)育過程，還可以為免疫效應(yīng)細(xì)胞的活化提供必需的共刺激信號，對免疫效應(yīng)細(xì)胞的激活具有極其重要的作用[18]。本研究中，DCreg刺激同種異基因CD8+T細(xì)胞增殖的能力顯著低于mDC，可能是由于DCreg低表達(dá)共刺激分子CD86和CD40，導(dǎo)致CD8+T細(xì)胞增殖活化信號通路受阻[19]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，與DCreg共培養(yǎng)的CD8+T細(xì)胞GzmB和Prf1 mRNA表達(dá)降低，而與mDC共培養(yǎng)的CD8+T細(xì)胞GzmB和Prf1 mRNA表達(dá)升高。表明共培養(yǎng)體系中DCreg能通過抑制GzmB和Prf1基因表達(dá)進(jìn)而抑制CD8+T細(xì)胞的殺傷作用，其機(jī)制有待深入研究。

綜上所述，本研究聯(lián)合應(yīng)用細(xì)胞因子rmGM-CSF和rmIL-4誘導(dǎo)小鼠BM-MNCs向DC定向分化和增殖，第6天即可獲得數(shù)量較多、純度較高、具有免疫調(diào)節(jié)功能的DCreg，實(shí)驗(yàn)過程操作簡單，培養(yǎng)周期短，為進(jìn)一步研究DCreg在肝移植免疫耐受誘導(dǎo)中的作用奠定了基礎(chǔ)。

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Induced differentiation and identification of mouse bone marrow-derived regulatory dendritic cells in vitro

WANGJinjing,YUANJinghua,QIAOLei,LIUYi,ZHANGXiaoning,LIKeqiu,LIGuang

(TianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China)

Abstract:ObjectiveTo establish a method for the induction and amplification of regulatory dendritic cells (DCreg) derived from mouse bone marrow in vitro, and to identify their biological and functional characteristics. MethodsThe bone marrow mononuclear cells (BM-MNCs) were induced to differentiate into DCreg by recombinant mouse IL-4 and recombinant murine granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (rmGM-CSF). The cells collected on the sixth day contained a large number of DCreg. A portion of cells were cultured with lipopolysaccharide (LPS) for another 2 days to achieve the mature DC (mDC). The morphology of DCreg was observed by inverted microscope. The expression of CD40, CD11b and CD86 were detected by flow cytometry. The splenic CD8+ T cells were randomly divided into three groups: groups A, B and C. The cells in the group A and group B were incubated with DCreg or mDC at different ratios (5∶1, 10∶1, 20∶1) of mixture to culture for 4 days, and cells in the group C were not treated. We detected the proliferation of CD8+ T cells by the CFSE labeling. The expression of perforin (Prf1) and GzmB mRNA in CD8+ T cells was detected by real-time PCR. ResultsFreshly isolated MSCs were round with small volume. When induced for 6 days, much more cell colonies were found, and cells became larger with the increased cell surface projections. The positive cell percentage of CD11b was (96.1±2.7)%. Compared with mDC, the positive expression rates of CD40 and CD86 in DCreg were lower (all P<0.05). Compared with group B, the proliferation rate of group A was significantly decreased (all P<0.05). Compared with group C and group B, the expression of Prf1, GzmB mRNA of group A was reduced (all P<0.05). Compared with group C, the expression of GzmB mRNA in the group B was increased (all P<0.05).ConclusionsrmGM-CSF combined with rmIL-4 can induce the differentiation of BM-MNCs into DCreg successfully, which can obtain a large number of highly purified DCreg with immune suppressive function.

Key words:regulatory dendritic cells; organ transplantation; immune tolerance; cell culture; perforin; granzyme B

(收稿日期：2015-09-18)

中圖分類號：R392.4

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)10-0013-04

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.10.005

通信作者簡介：李光(1959-)，女，教授，主要研究方向?yàn)槠鞴僖浦才c免疫耐受。E-mail： lig@tmu.edu.cn

作者簡介：第一王進(jìn)京(1975-)，男，講師，主要研究方向?yàn)橐浦裁庖?。E-mail： wangjinjingxml@163.com

基金項(xiàng)目：國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃項(xiàng)目(2012AA021003)。