左俐俊，任亞萍

1)桂林醫(yī)學院研究生學院 桂林 541004　2)桂林醫(yī)學院組織胚胎學教研室 桂林 541004

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小鼠不同動情周期子宮內膜組織中Bcl-2、Bax和Caspase-9蛋白的表達*

左俐俊1)，任亞萍2)#

1)桂林醫(yī)學院研究生學院 桂林 5410042)桂林醫(yī)學院組織胚胎學教研室 桂林 541004

關鍵詞Bcl-2;Bax;Caspase-9;動情周期;雌激素；小鼠

摘要目的：探討B(tài)cl-2、Bax 和Caspase-9在性成熟期小鼠動情周期不同階段子宮內膜組織中的表達及定位。方法：選取32只性成熟期健康未孕雌性昆明小鼠，通過陰道脫落細胞檢測法，根據(jù)陰道涂片細胞種類，確定各小鼠所屬動情周期階段，將小鼠分4組(n=8)，分別為動情前期組、動情期組、動情后期組、動情間期組。免疫組化法檢測Bcl-2、Bax和Caspase-9蛋白在子宮內膜組織中的表達。結果：Bcl-2在子宮內膜上皮組織中表現(xiàn)出與動情周期相關的規(guī)律性表達，動情間期表達高于其他各期(P<0.05)；Bax在各動情周期均有表達，不同動情周期子宮內膜組織中Bax蛋白的表達差異無統(tǒng)計學意義(P=0.796)；Caspase-9在動情期子宮內膜組織中主要表達于黏膜上皮細胞胞質、固有層子宮腺細胞胞質、基質細胞胞質，且動情前期表達低于其他各期(P<0.05)。結論：Bcl-2、Bax、Caspase-9在動情周期中共同調節(jié)子宮內膜細胞周期性的增殖與凋亡。

Expressions of Bcl-2,Bax,and Caspase-9 proteins in mouse endometrium tissue at different stages of estrous cycle

ZUOLijun1),RENYaping2)

1)GraduateSchool,GuilinMedicalUniversity,Guilin5410042)DepartmentofHistologyandEmbryology,GuilinMedicalUniversity,Guilin541004

Key wordsBcl-2;Bax;Caspase-9;estrous cycle;estrogen;mouse

AbstractAim: To explore the expressions of Bcl-2,Bax,and Caspase-9 in endometrium at different stages of estrous cycle in mature mice.Methods: A total of 32 sexual maturity healthy mice were randomly allocated into 4 groups(n=8),and through the rats vaginal smear observation and types of the cells, the mouse′s estrous cycle stage was clearly determined.Then immunohistochemistry was carried out to screen the protein of Bcl-2,Bax,and Caspase-9 in mice.Results: Bcl-2 was highly appeared in diestrus stage(P<0.05).Bax was also expressed in the estrous cycle but had no significant difference among different stages(P=0.796).Besides, Caspase-9 in each estrus stage of mainly expressed in the mucosa epithelial cytoplasm, lamina propria uterus gland cell cytoplasm,and stromal cell cytoplasm,and it was lowly expressed in the beginning of the estrous cycle(P<0.05).Conclusion: Bcl-2,Bax, and Caspase-9 regulate the proliferation and apoptosis of endometrial cell cycle during estrous cycle.

雌性成年小鼠生殖器官發(fā)生增殖、退化的周期性變化稱為動情周期，一般為4～5 d,分為動情前期、動情期、動情后期和動情間期。目前較常用的確定小鼠動情周期的方法有外陰直接觀察法、陰道栓觀察法和陰道涂片法等。陰道涂片法具有直接、便于操作等特點，故該實驗采用此法來確定小鼠的不同動情周期。已知育齡期哺乳動物子宮內膜需達到一定厚度，其自然妊娠率最高，適于胚胎植入[1]。那么小鼠在不同動情周期子宮內膜的規(guī)律性變化是何因素所為?是否與凋亡因子Bcl-2、Bax和Caspase-9有關?故作者設計該實驗來進行探討，現(xiàn)將結果報道如下。

1材料與方法

1.1儀器及試劑 顯微鏡(日本奧林巴斯)，微量移液器(德國艾本德)，Bcl-2、Bax、Caspase-9一抗(武漢博士德)，DAB試劑盒(北京中杉金橋)，SABC免疫組化染色試劑盒(福州邁新)。

1.2動物分組及處理32只8周齡SPF級雌性昆明小鼠購自廣西醫(yī)科大學實驗動物中心，于桂林醫(yī)學院實驗動物中心飼養(yǎng)，溫度25 ℃，濕度55%～65%，光照10～12 h/d，飼料、飲用水均經(jīng)消毒處理。小鼠均未生育，為確保取材正確，于每日7:00、15:00和22:00陰道涂片觀察小鼠，直至每只小鼠完成一個完整的動情周期，連續(xù)15 d，結果示該實驗小鼠均有完整的動情周期，可以進行下一步操作。

1.3小鼠動情周期的確定及取材用沾有生理鹽水的消毒棉簽沾取陰道黏液，將棉簽黏液涂于載玻片上，經(jīng)甲醇固定、風干、染色、沖洗、風干等過程，在顯微鏡下觀察陰道脫落上皮細胞形態(tài)。根據(jù)文獻[2]動情周期判定標準進行判斷。動情間期：涂片以白細胞為主；動情前期：涂片以有核上皮為主；動情期：涂片以角化上皮為主；動情后期：涂片以角化上皮和白細胞為主。根據(jù)涂片判斷小鼠動情周期并分為4組(n=8)，將處于不同動情周期的小鼠子宮內膜取材備用，取出的組織置于體積分數(shù)10%中性甲醛中固定，用于免疫組化檢測。

1.5統(tǒng)計學處理采用SPSS 18.0進行數(shù)據(jù)分析，不同組間Bcl-2、Bax、Caspase-9蛋白相對表達量的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2結果

Bcl-2、Bax和Caspase-9在小鼠不同動情周期子宮內膜組織中的表達情況見圖1和表1。Bcl-2和Bax在各動情周期小鼠子宮內膜組織中均有表達，棕黃色陽性顆粒主要分布于子宮內膜腔上皮和腺上皮胞質，且小鼠動情間期子宮內膜明顯增厚。Caspase-9主要表達于子宮黏膜上皮細胞胞質、子宮腺細胞胞質、基質細胞胞質。

A:動情前期：B:動情期：C:動情后期：D:動情間期。圖1　小鼠子宮內膜組織中Bax(1)、Bcl-2(2)、Caspase-9(3)蛋白的表達情況(SABC，×400)

組別nBcl-2BaxCaspase-9動情前期組80.24±0.01*0.28±0.220.20±0.09動情期組80.25±0.020.28±0.410.28±0.05#動情后期組80.22±0.00*0.24±0.090.27±0.03#動情間期組80.27±0.020.27±0.030.26±0.05#F12.7600.34114.020P<0.0010.796<0.001

*:與動情間期組比較，P<0.05；#:與動情前期組比較，P<0.05。

3討論

子宮內膜對雌激素和孕激素都有反應，雌激素可引起子宮肥大，孕激素可促使子宮內膜發(fā)生特殊的妊娠周期變化。正常小鼠血漿雌激素在動情前期開始上升，動情期達到最高，且此期子宮內膜細胞不斷分裂增殖，使機體利于受孕[3]。Bcl-2和Bax作為一類重要的凋亡因子，協(xié)同調節(jié)細胞的增生與凋亡，兩者既可形成同源二聚體促進凋亡，也可形成異源二聚體抑制凋亡，且這種二聚體化過程決定了細胞對“死亡”的敏感性[4-6]。其機制是胞質中的Bax插入到線粒體內膜中，導致線粒體膜電位下降，形成Bax通道，促進細胞色素C釋放，激活Caspase而誘導細胞凋亡[7-10]。已有研究[11]表明，bcl-2基因在正位和異位子宮內膜均有表達，且雌激素可以促進其表達，孕激素則抑制其表達。該實驗結果也證實了這一點，Bcl-2在動情周期各期均有表達，且表達多見于子宮黏膜上皮細胞和固有層子宮腺細胞。此外，該研究結果顯示，Bcl-2表達在動情期與動情間期差異無統(tǒng)計學意義，說明動情期子宮內膜的凋亡抑制活動仍在進行中，為子宮內膜增厚、胚胎植入做準備，若未受精，便進入動情后期，凋亡抑制基因表達降低，凋亡加速，子宮內膜變薄。此外，動情間期雌激素將達到一個較高水平，蛋白表達也最高，此期機體凋亡抑制基因也高表達，提示Bcl-2可能通過抑制基底層腺細胞凋亡而發(fā)揮作用。也有相關實驗[12]顯示Bcl-2在人正常子宮內膜腺上皮細胞呈現(xiàn)規(guī)律性表達，而該實驗發(fā)現(xiàn)動情間期Bcl-2表達最高，動情后期為促進細胞凋亡，表達明顯降低，說明Bcl-2在子宮內膜呈現(xiàn)出的規(guī)律性表達，正是此蛋白對小鼠不同動情周期調節(jié)的微觀表現(xiàn)。有關文獻[13]顯示，Bax在育齡期女性整個月經(jīng)周期中都有表達，這與該實驗結果一致。目前對于Bax在子宮內膜的表達情況仍存在爭議，曾有學者[14]提出Bcl-2受雌激素調節(jié)，并與月經(jīng)周期有關，且發(fā)生著周期性變化，而Bax雖與子宮內膜改變有著必然聯(lián)系，卻不受性激素調節(jié)，也無此規(guī)律性變化。該研究結果證實Bcl-2和Bax共同調節(jié)子宮內膜細胞的凋亡，且Bcl-2表現(xiàn)出與動情周期相關的規(guī)律性表達，而Bax雖在各期均有表達，卻沒有可靠的規(guī)律可循，推測Bax可能通過影響B(tài)cl-2的表達起作用，也可能通過其他未知途徑來影響內膜腺體的增生與凋亡。

細胞凋亡的機制中主要有2種信號途徑，即線粒體途徑和死亡受體途徑。而在凋亡的線粒體途徑中，Caspase-9是Caspase家族中最重要的凋亡起始因子[15-16]。該研究結果顯示，Caspase-9蛋白在動情周期各期子宮內膜主要表達在黏膜上皮細胞胞質、子宮腺細胞胞質、基質細胞胞質，說明Caspase-9參與了動情周期更替的全部過程。此外，Caspase-9在動情間期的表達不是最多也不是最少，但同時結合在動情間期子宮內膜最薄的情況下能有較高的吸光度值，充分說明Caspase-9蛋白在單位面積子宮黏膜上皮細胞內表達足夠高，這是從動情期開始，子宮內膜便做好了充分的準備，歷經(jīng)后期到間期，Caspase-9在這3期子宮內膜表達最多，為順利進入下一個動情周期做準備。

綜上所述，該研究結果說明Bcl-2、Bax和Caspase-9在不同動情期階段的子宮內膜組織中有表達，子宮內膜的周期性改變需要三者的協(xié)同配合。這也提示，在人類若這個程序被干擾，可能會導致相應的子宮內膜疾病，如功能失調性子宮出血病、子宮內膜異位或癌變等。

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中圖分類號R339.2；R-332

#通信作者，女，1973年3月生，碩士，副教授，研究方向：生殖生理與疾病，E-mail：yapingrengl@163.com

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.02.011

*廣西高校科學技術研究項目2013ZD043；桂林市科學研究與技術開發(fā)項目20130416-3