梁娟 呂軍影 胡謀波 鄭雪嘉

【摘 要】目的：觀察紅花水煎液對(duì)硬皮病小鼠皮膚RORγt表達(dá)的影響，探討紅花抗SSc皮膚纖維化的免疫機(jī)制。方法：將32只BALB/C小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、醋酸潑尼松組、紅花組，每組8只。除空白對(duì)照組外，其余3組注射博來霉素緩沖液誘導(dǎo)硬皮病模型，同時(shí)予生理鹽水（空白對(duì)照組和模型對(duì)照組）、醋酸潑尼松（醋酸潑尼松組）、紅花水煎液（紅花組）灌胃處理28 d。取小鼠皮膚，蘇木素-伊紅染色測(cè)真皮厚度及評(píng)價(jià)皮膚炎癥程度；免疫組化法、蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)皮膚RORγt的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：各造模組小鼠皮膚均有不同程度增厚，炎性細(xì)胞浸潤，炎癥評(píng)分、RORγt蛋白表達(dá)均不同程度升高，與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。與模型對(duì)照組比較，醋酸潑尼松組和紅花組小鼠真皮厚度及皮膚炎癥評(píng)分、RORγt蛋白表達(dá)下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

（P < 0.05）。與醋酸潑尼松組比較，紅花組真皮厚度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），皮膚炎癥評(píng)分及RORγt蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。結(jié)論：紅花水煎液能降低硬皮病小鼠皮膚RORγt蛋白表達(dá)，抑制免疫炎癥反應(yīng)而具有抗皮膚纖維化的治療作用。

【關(guān)鍵詞】 硬皮??；紅花；RORγt；炎癥反應(yīng)；抗皮膚纖維化；小鼠

doi：10.3969/j.issn.2095-4174.2016.04.001

Effect of Saflfower Decoction on the Expression of Skin RORγt in Mice with Scleroderma

LIANG Juan，LYU Jun-ying，HU Mou-bo，ZHENG Xue-jia

【ABSTRACT】 Objective：To observe the effect of safflower decoction on the expression of skin RORγt in mice with scleroderma to explore the immune mechanism of safflower for anti-SSc skin fibrosis.Methods：

32 BALB /C mice were randomly divided into a blank control group，a model control group，a prednisone acetate group，and a safflower group，8 rats in each group.Except for the blank control group，the other 3 groups were given injection of bleomycin damping fluid to establish scleroderma models.Meanwhile，intragastric administration was given to the control and model control groups with normal saline，to the prednisone acetate group with prednisone acetate，and to the safflower group with safflower decoction for 28 days.Hematoxylin-eosin was used to measure the thickness of skin and evaluate the degree of skin inflammation.Immunohistochemistry method and Western blot were used to detect the expression level of skin RORγt.Results：Skin of Models in each group had various degrees of thickening and inflammatory cell infiltration.Inflammation score and RORγt protein expression were increased in various degrees，and the difference was statistically significant （P < 0.05） compared with the blank control group.Compared with the control group，the dermal thickness，skin inflammation score and RORγt protein expression of the prednisone acetate group and the safflower group were decreased，and the difference was statistically significant （P < 0.05）.Compared with the prednisone acetate group，the dermal thickness of the safflower group was decreased，the difference being statistically significant （P < 0.05） and the differences of skin inflammation score and RORγt protein expression having no statistical significance （P > 0.05）.Conclusion：Safflower decoction can decrease the expression of RORγt protein expression in mice with scleroderma and suppress the immune inflammatory reaction，having a therapeutic effect on skin fibrosis.

【Keywords】 scleroderma；safflower；RORγt；inflammatory reaction；anti skin fibrosis；mice

系統(tǒng)性硬皮?。╯ystemic scleroderma，SSc）是一種以局限性或彌漫性皮膚及內(nèi)臟器官結(jié)締組織纖維化或硬化，最后發(fā)展至萎縮為特點(diǎn)的自身免疫性疾病。研究發(fā)現(xiàn)，本病發(fā)生、發(fā)展過程中出現(xiàn)了免疫系統(tǒng)異?；罨默F(xiàn)象，特別是細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)在SSc發(fā)病中占主要作用[1]。SSc患者中輔助性T細(xì)胞17（T helper cell 17，Th17）免疫應(yīng)答明顯增強(qiáng)，對(duì)疾病具有至關(guān)重要的作用[2]。

維甲酸相關(guān)孤兒受體γt（retinoic acid-related orphan receptor γt，RORγt）被認(rèn)為是Th17細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子[3]，調(diào)節(jié)白細(xì)胞介素-17（interleukin 17，

IL-17）的分泌，影響炎癥效應(yīng)，通過對(duì)RORγt的抑制可阻止初始CD4+T細(xì)胞向Th17的分化，降低免疫應(yīng)答反應(yīng)，這對(duì)于SSc的發(fā)病機(jī)制和新干預(yù)措施的研究具有重要意義。紅花能夠抑制炎癥反應(yīng)[4]，

是否可通過降低RORγt的表達(dá)而抑制Th17細(xì)胞的分化，從而達(dá)到抗炎、抗皮膚纖維化作用，目前尚未見報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)通過紅花干預(yù)治療硬皮小鼠模型，觀察轉(zhuǎn)錄因子RORγt在皮膚中的表達(dá)變化，探討紅花抗SSc皮膚纖維化的免疫機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組 32只BALB/C小鼠，SPF級(jí)，雌性，體質(zhì)量18～22 g，購于廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK桂2014-0002。在清潔級(jí)環(huán)境中分籠適應(yīng)性飼養(yǎng)2 d后給予編號(hào)，將32只小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、醋酸潑尼松組和紅花組，每組8只。

1.2 主要藥物 注射用鹽酸博來霉素（日本化藥株式會(huì)社，批號(hào)140372）溶于高壓滅菌的0.01 M

PBS（pH = 7.2）中，制成濃度為200 μg·mL-1

緩沖液，過濾除菌后分裝于EP管中，4 ℃保存?zhèn)溆谩＜t花（新疆產(chǎn)，批號(hào)140901）采用常規(guī)方法加水煎煮并濃縮成濃度為1 g·mL-1的紅花水煎液，

4 ℃保存?zhèn)溆谩４姿釢娔崴善◤V東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào)141123）溶于蒸餾水中制成濃度為0.45 mg·mL-1混懸液，現(xiàn)配現(xiàn)用。以上藥物均購于本院藥房。兔抗小鼠RORγt多克隆抗體（Abcam公司）SP檢測(cè)試劑盒、DAB顯色試劑盒（北京中杉）二抗HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG（CST公司）RIPA細(xì)胞裂解液、ECL發(fā)光試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（碧云天公司）。

1.3 模型制備及給藥 按照國內(nèi)外文獻(xiàn)方法[5-6]，將所有小鼠背部中央?yún)^(qū)被毛剃除后皮下注射，除空白對(duì)照組注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01 M PBS（pH = 7.2）

（每次0.1 mL，每日1次，共28 d）外，其余各組均注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)為200 μg·mL-1的注射用鹽酸博來霉素緩沖液（每次0.1 mL，每日1次，共28 d）。造模開始即行藥物干預(yù)治療，根據(jù)小鼠與人折算系數(shù)表，計(jì)算出小鼠（體質(zhì)量20 g）使用醋酸潑尼松劑量為0.09 mg·d-1，紅花劑量為30 mg·d-1。灌胃前用蒸餾水將備用藥物稀釋成相應(yīng)濃度，醋酸潑尼松組給予醋酸潑尼松溶液0.2 mL·d-1灌胃，紅花組給予紅花水煎液0.2 mL·d-1灌胃，空白對(duì)照組和模型對(duì)照組給予等容量生理鹽水灌胃，共28 d。

2 標(biāo)本制備及指標(biāo)檢測(cè)

2.1 取 材 用藥結(jié)束后第2天，所有小鼠給予2 mL·kg-1腹腔注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的水合氯醛麻醉。取背部皮膚，一部分放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的甲醛溶液固定、脫水、石蠟包埋，連續(xù)制取

4 μm切片，用于蘇木素-伊紅染色（HE染色）和免疫組化；一部分于-80 ℃保存，用于蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）測(cè)定。

2.2 真皮厚度及炎癥評(píng)分 石蠟切片行HE染色：二甲苯、酒精脫蠟至水，蘇木素浸染，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的鹽酸酒精分化，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的伊紅溶液復(fù)染，再脫水透明封片。在光鏡下（× 200倍）觀察皮膚炎癥情況，HE染色結(jié)果示膠原纖維、粘液、軟骨呈藍(lán)色，肌纖維、纖維素和紅細(xì)胞染粉紅色、胞核染藍(lán)黑色。并采用病理圖像分析儀系統(tǒng)軟件，每只小鼠的切片隨機(jī)取5處測(cè)定真皮厚度，并按照文獻(xiàn)[7]的方法計(jì)算皮膚炎癥積分：0，沒有；1，少許；2，輕度；3，中度；4，重度。

2.3 免疫組化檢測(cè) 石蠟切片脫蠟至水，PBS洗3 min×3次，置于檸檬酸鹽緩沖溶液中進(jìn)行抗原熱修復(fù)，PBS洗3 min × 3次，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的過氧化氫溶液室溫孵育10 min，PBS洗3 min × 3次，按照SP檢測(cè)試劑盒操作步驟進(jìn)行檢測(cè)，一抗使用兔多克隆抗體RORγt，DAB顯色試劑盒進(jìn)行顯色，封片后鏡下觀察結(jié)果，采用Olmpus圖像采集系統(tǒng)和Image-pro plus 6.0圖像分析軟件進(jìn)行定量分析，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野（× 400倍），以細(xì)胞漿、細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，測(cè)定每個(gè)視野下染色的平均光密度值（IOD）=總光密度/陽性面積。

2.4 Western blot檢測(cè) 皮膚組織剪碎后置于勻漿器中，加入RIPA裂解液，4 ℃裂解30 min，高速離心后取上清液按照BCA試劑盒說明書測(cè)蛋白濃度，再加入適量蛋白上樣緩沖液，沸水浴5 min變性蛋白分裝后-20 ℃保存。用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)印蛋白到PVDF膜上，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的脫脂牛奶封閉1.5 h，一抗兔多克隆RORγt（1∶300）孵育4 ℃過夜，常溫?fù)u床下孵育二抗。以GAPDH（1∶10000）作為內(nèi)參。ECL壓片顯影，拍照得到圖片后采用Image J軟件讀取內(nèi)參、目的蛋白條帶的積分灰度值，相對(duì)含量即為目的積分灰度值（IOD）/內(nèi)參積分灰度值（IOD）。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，如果符合正態(tài)分布和方差齊性，樣本均數(shù)的比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的方差分析和q檢驗(yàn)，否則采用秩和檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 真皮厚度及炎癥評(píng)分 小鼠皮膚HE染色顯示，空白對(duì)照組小鼠皮膚結(jié)構(gòu)完整，無或有少許淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤。模型對(duì)照組小鼠皮膚明顯增厚，膠原纖維明顯增生，真皮小血管周圍可見大量炎性細(xì)胞浸潤，皮膚附屬器萎縮。醋酸潑尼松組和紅花組小鼠皮膚炎癥細(xì)胞浸潤減輕，皮膚厚度降低，纖維增生緩解。與空白對(duì)照組比較，各組小鼠真皮厚度增加，炎癥評(píng)分不同程度升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；與模型對(duì)照組比較，醋酸潑尼松組和紅花組真皮厚度及炎癥評(píng)分降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；與醋酸潑尼松組比較，紅花組真皮厚度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

（P < 0.05），皮膚炎癥評(píng)分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

（P > 0.05）。見表1、圖1。

3.2 RORγt表達(dá)水平 免疫組化分析顯示，各組小鼠皮膚均可見陽性細(xì)胞表達(dá)，空白對(duì)照組呈弱表達(dá)。Western blot分析顯示，在蛋白相對(duì)分子量為58 kD及36 kD處可見特異性陽性條帶，分別是RORγt及GAPDH蛋白表達(dá)。與空白對(duì)照組比較，造模小鼠皮膚RORγt表達(dá)水平均增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；與模型對(duì)照組比較，醋酸潑尼松組和紅花組小鼠皮膚RORγt表達(dá)水平減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；

與醋酸潑尼松組比較，紅花組小鼠皮膚RORγt表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表2、

圖2、圖3。

4 討 論

SSc也稱硬皮病，是一種以皮膚及內(nèi)臟器官（包括心、肺、腎和消化道等）進(jìn)行性增厚致纖維化、硬化為主要表現(xiàn)的自身免疫性疾病。當(dāng)前研究表明，免疫系統(tǒng)的活化和失調(diào)、血管改變、結(jié)締組織代謝異常以及三者之間的相互影響是SSc的主要發(fā)病機(jī)制，其中免疫反應(yīng)異常在SSc的發(fā)病中起著主導(dǎo)作用，是SSc血管病變和纖維化過程中的一個(gè)關(guān)鍵因素[1]。研究發(fā)現(xiàn)，T淋巴細(xì)胞活化在SSc的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。T細(xì)胞激活分泌大量的細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)等導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷，刺激成纖維細(xì)胞，進(jìn)而導(dǎo)致組織器官纖維化及功能障礙[8]。

Th17細(xì)胞是近年來新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)T細(xì)胞亞群，主要由CD4+T淋巴細(xì)胞分泌產(chǎn)生，以分泌IL-17因子為特征而不同于傳統(tǒng)的Th1和Th2細(xì)胞[9]。Th17細(xì)胞能夠介導(dǎo)炎性反應(yīng)、清除細(xì)胞外病原菌引起的感染，尤其在人類自身免疫性疾病、炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[10]。RORγt、RORα是Th17分化過程中2種轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)Th17細(xì)胞分化[11]。有研究表明，在初始T細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)入編碼RORγt的逆轉(zhuǎn)錄病毒可以誘導(dǎo)其分化Th17細(xì)胞，分泌IL-17，相反，在RORγt基因敲除的小鼠中Th17細(xì)胞分化嚴(yán)重受損[3]，這證明了RORγt在Th17細(xì)胞分化中的重要作用，也是目前常用的檢測(cè)Th17基因轉(zhuǎn)錄的標(biāo)志，可在一定程度上反應(yīng)Th17細(xì)胞的水平和功能活性[12]。本實(shí)驗(yàn)造模小鼠皮膚的RORγt蛋白表達(dá)及炎癥評(píng)分均升高，真皮厚度增加，說明Th17細(xì)胞參與了SSc免疫炎癥反應(yīng)，通過致炎作用促進(jìn)皮膚組織纖維化的形成。

近來研究表明，糖皮質(zhì)激素并不是僅有免疫抑制功能，而是對(duì)機(jī)體有雙向調(diào)節(jié)作用，主要體現(xiàn)在抗炎與促炎作用以及對(duì)于免疫細(xì)胞和免疫應(yīng)答過程中的不同調(diào)節(jié)作用[13]。醋酸潑尼松是臨床上廣泛應(yīng)用于治療SSc的中效腎上腺皮質(zhì)激素，可抑制SSc患者病理性免疫反應(yīng)，對(duì)免疫過程中許多環(huán)節(jié)起抑制作用，特別是在免疫反應(yīng)的早期階段發(fā)揮治療作用，但也可抑制患者自身免疫系統(tǒng)功能，產(chǎn)生多種副作用[14]?；钛鲋兴幣R床上已被廣泛應(yīng)用于SSc等膠原合成異常增多性疾病的治療，它們單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用能不同程度改善患者癥狀。紅花是一種傳統(tǒng)的活血化瘀中藥，具有抗炎、抗氧化、抗血栓等作用[15]，有研究表明，SSc患者通過使用紅花注射液治療后，雷諾氏現(xiàn)象明顯減輕，皮膚軟化，關(guān)節(jié)活動(dòng)度增強(qiáng)[16]。對(duì)SSc患者皮膚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)紅花能顯著促進(jìn)SSc患者皮膚成纖維細(xì)胞的膠原合成[17]。而筆者前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，紅花能夠降低血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）及Ⅰ型膠原蛋白（COL-Ⅰ）、Ⅲ型膠原蛋白（COL-Ⅲ）的表達(dá)，具有抗纖維化作用[18-19]。本實(shí)驗(yàn)通過紅花干預(yù)治療后小鼠真皮厚度、炎癥評(píng)分和皮膚組織中的RORγt蛋白均顯著下降，表明紅花可能通過抑制RORγt的表達(dá)，發(fā)揮抑制免疫炎癥反應(yīng)作用，而達(dá)到抗纖維化作用。與醋酸潑尼松組比較，①紅花組小鼠炎癥評(píng)分和RORγt蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），說明紅花水煎液的免疫抑制、抗炎作用與醋酸潑尼松相似；②紅花組小鼠真皮厚度降低顯著，可能與紅花抗過氧化、清除氧自由基、改善血管微循環(huán)等多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)作用有關(guān)；③本實(shí)驗(yàn)醋酸潑尼松組小鼠炎癥評(píng)分及RORγt表達(dá)均略低于紅花組，但真皮厚度減低不如紅花組，且觀察小鼠一般情況發(fā)現(xiàn)，醋酸潑尼松組較紅花組小鼠活動(dòng)量減少，毛發(fā)粗糙無光澤，再生較少，體質(zhì)量明顯減輕。說明醋酸潑尼松抗炎作用顯著，但可引起消化道系統(tǒng)潰瘍、免疫系統(tǒng)功能降低等較強(qiáng)毒副作用；傳統(tǒng)中藥紅花毒副作用較小，可增強(qiáng)非特異性免疫功能，對(duì)抗醋酸潑尼松免疫抑制作用[20]。

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收稿日期：2015-12-14；修回日期：2016-01-18