呂勇智 李宏達 鄒 寧 張 碩 朱 昱（中國刑事警察學(xué)院 遼寧 沈陽 110035）

新型熒光探針法檢測食品中的亞硫酸鹽含量

呂勇智 李宏達 鄒 寧 張 碩 朱 昱
（中國刑事警察學(xué)院 遼寧 沈陽 110035）

亞硫酸鹽是常見的食品添加劑，然而對人體卻有一定的毒性。通過設(shè)計、合成了一種新型的基于羥基半花菁染料的熒光探針（HHC），可以實現(xiàn)快速、準確、高效地檢測食品檢材中的亞硫酸氫根。探針分子具有較大的摩爾消光系數(shù)，可以實現(xiàn)可視化檢測。另外，HHC探針熒光強度的變化量與濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，并具有較低的極限檢測濃度，可成功的應(yīng)用于食品檢材中濃度水平的監(jiān)測。

熒光探針 亞硫酸鹽檢測 定量分析 食品檢材

食品安全是一個重大的戰(zhàn)略性問題，事關(guān)人民的身體健康和社會的和諧穩(wěn)定。食品添加劑是食品中的必要成分，對食品添加劑的檢驗已日漸成為食品安全領(lǐng)域的一項重要工作[1]。亞硫酸鹽（或）常作為食品和飲料中的添加劑，是一類很早就在世界范圍內(nèi)廣泛使用的食品添加劑。然而亞硫酸鹽具有一定毒性，大量的攝入可能導(dǎo)致皮膚過敏，呼吸道疾病（如哮喘），胃腸道疾病及臟器損傷等[2-3]。美國食品藥物管理局（The United States Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）規(guī)定食物中的亞硫酸鹽的含量不得超過10μg/mL[4]。

目前，檢測亞硫酸鹽的方法有很多種，例如滴定法[5]、蒸餾法[6]、比色法[7]、離子色譜法[8]、分光光度法[9]、電化學(xué)法[10]、毛細管電泳法[11]、酶催化法[12]等。這些方法中或者由于前處理比較繁瑣，需要借助大型分析儀器，檢測時間較長，或者存在靈敏度低，選擇性差等缺點，因而在食品檢材中對于微量亞硫酸鹽的檢測受到一定限制。熒光探針法[13-21]具有靈敏度高、選擇性好、操作簡便、檢測速度快等優(yōu)點，引起了許多科學(xué)家的關(guān)注。本文設(shè)計合成了基于羥基半花菁染料的熒光探針HHC。該探針存在著非常強的分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（ICT），在長波長處產(chǎn)生非常強的紅色熒光信號；當亞硫酸鹽與探針HHC中的C=C作用后，阻礙了ICT作用，導(dǎo)致紅色熒光信號發(fā)生猝滅，且測得的熒光信號變化量與加入的亞硫酸鹽濃度之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。本文在優(yōu)化反應(yīng)條件的基礎(chǔ)上，建立了檢測食品檢材中亞硫酸鹽含量的新型熒光探針法。該方法具有操作簡便，響應(yīng)快速，靈敏度高等優(yōu)點，存在著巨大的應(yīng)用前景。探針HHC的合成路線及與HSO3-的作用機理如圖1所示。

圖1 探針HHC的合成路線及與的作用機理

1 實驗儀器和材料

1.1 實驗儀器

熒光和紫外分光光度計采用島津公司的RF-5301PC和UV-2550進行測試，核磁共振儀采用Bruker AV-300進行測試，MALDI-TOF MS質(zhì)譜儀采用島津公司的AXIMA-CFRTM進行測試，HRMS (ESI-TOF)采用Bruker microTOF II focus進行測試。

1.2 實驗材料

實驗所用的原料樣品及溶劑均來自國藥控股有限公司，購買后未經(jīng)處理直接使用。水，冰糖，紅酒，白砂糖均采購于沈陽家樂福超市。層析硅膠采購于青島海洋化工特種硅膠有限公司。

2 實驗內(nèi)容

2.1 熒光探針HHC的合成及表征

將200mg濃度為1.2mmol的碘化3-乙基-2-甲基-3-苯并噻唑（2）和354mg濃度為1.2mmol的8-羥基-5-喹啉甲醛（1）溶于5.0mL的無水乙醇中，然后添加2滴哌啶溶液作為反應(yīng)的催化劑，在N2環(huán)境中，加熱回流4小時，然后冷卻至室溫，加入適量的乙醚，將析出的晶體過濾，再用乙醇重結(jié)晶析出灰白色固體HHC （265.2mg）產(chǎn)率為48%。1H NMR（300MHz，DMSO-d6，ppm）δ：9.06（d，J=8.6Hz，1H，ArH），9.00（d，J=3.9Hz，1H，ArH），8.84（d，J=15.2Hz，1H，-CH=CH-Ar），8.64（d，J=8.3Hz，1H，ArH），8.45（d，J=8.1Hz，1H，ArH），8.31（d，J=8.4Hz，1H，ArH），8.05（d，J=15.3Hz，1H，-CH=CH-Ar），7.89（t，J=7.4Hz，1H，ArH），7.82-7.78（m，2H，ArH），7.33(d，J=8.4Hz，1H，ArH），5.00（q，J=6.8Hz，2H，-CH2-CH3），1.50（t，J=6.7Hz，3H，-CH2-CH3）.13C NMR（75MHz，DMSO-d6，ppm）δ：162.2，147.3，141.7，140.6，136.1，132.4，131.0，128.2，125.2，125.1，124.9，124.7，123.1，122.3，114.1，113.8，112.8，95.0，44.3，13.0.MALDI-TOF Ms m/z：333.4 [M-I]+，HRMS（ESI-TOF）Calcd for C20H17N2OS+（[M]+）333.1056.Found：333.1063。

用二甲基亞砜（DMSO）作為溶劑制備5× 10-4mol/L HHC儲備液，并用磷酸鹽緩沖液(10mmol/L，pH=7.4，2%DMSO)將其稀釋到1×10-5mol/L。其他溶液用磷酸鹽緩沖溶液(10mmol/L，pH=7.4，2%DMSO)溶解制備。在25℃下，采用10mm比色皿，吸收光譜掃描范圍是200nm到700nm，找到HHC探針的最大吸收波長為568nm。然后配置不同濃度的溶液，往HHC探針溶液中滴加溶液，振蕩搖勻并以568nm為激發(fā)波長，狹縫寬度5nm，掃描范圍為550nm到800nm，測得與HHC探針混合液的熒光發(fā)射光譜圖。

用去離子水作為溶劑制備濃度均為0.25g/mL的冰糖和白砂糖儲備液，并用去離子水將紅酒稀釋100倍。然后將適量的(0，0.15或0.20μmol/L)樣品儲備液、HHC溶液(10μmol/L)加入3mL磷酸鹽緩沖溶液(10mmol/L，pH7.4，2%DMSO)中，并在25℃條件下測定熒光強度。

2.4 檢測限（LOD）

本實驗的檢測限用LOD=3δ/k表示，δ指10次空白測定結(jié)果的標準差，k指擬合曲線的斜率。

3 結(jié)果與討論

3.1 光譜性質(zhì)

由于大多數(shù)亞硫酸鹽是添加在食物中，所以要求熒光探針在水介質(zhì)中也可以進行測定。本文考察了不同pH濃度對熒光探針HHC測定的影響（如圖2所示）。結(jié)果顯示當溶液pH在7.4～9.0之間，在激發(fā)波長568nm測定下HHC的熒光強度最大，而當pH降到4，吸收帶藍移，最大吸收波長從568nm移動到431nm，紫紅色溶液變?yōu)辄S色（如圖3所示）。由此可見，HHC在弱堿性溶液中去質(zhì)子化，此時探針HHC的最大吸收波長為568nm，呈現(xiàn)紫紅色，且最大發(fā)射波長為591nm（激發(fā)波長為568nm，如圖6所示）。HHC與結(jié)合前，由于分子內(nèi)電荷的轉(zhuǎn)移（亞胺離子和酚羥基上氧負離子相互作用），使得HHC產(chǎn)生了強烈的熒光效應(yīng)。而當(50mol/L)加入到HHC溶液中，在568nm和591nm處的最大吸收峰和最大發(fā)射峰消失，溶液顏色從紫紅變?yōu)闊o色。由于反應(yīng)前后產(chǎn)生明顯的顏色變化，因此，HHC能夠用于的可視化檢測。另外，根據(jù)滴定曲線和Job擬合曲線可知，HHC和之間的化學(xué)計量比為1∶ 1（如圖4所示），通過ESI-MS可知，[HHC-HSO3]+=415.51，也進一步證明了兩者之間的化學(xué)計量比為1∶1，同時也印證了圖1所示的反應(yīng)機理。

圖2 不同pH條件下探針HHC的熒光強度

圖3 探針HHC(10μmol/L)在pH分別為4.0、7.4和9.0時的吸收譜圖

圖4 探針HHC與作用的Job擬合曲線

在發(fā)射光譜中，我們可以看到在591nm處混合溶液的熒光強度隨著濃度的增加而逐漸減弱，并且熒光強度的變化量與加入的濃度（0～10μmol/L）呈現(xiàn)很好的線性關(guān)系（R2=0.999，如圖6所示），檢測極限為6.8mol/L。

圖5 探針HHC(10μmol/L)響應(yīng)的吸收光譜圖

圖6 探針HHC（10μmol/L）響應(yīng)的發(fā)射光譜圖

在室溫條件下，對探針HHC與類似分析物之間的相互作用進行了研究（分析物包含：陰離子、氧化劑和生物硫醇，如圖7所示）。柱狀圖結(jié)果表明：僅有能夠使探針HHC在591nm處的發(fā)射峰消失，其他分析物與HHC不發(fā)生作用，探針HHC與的相互作用不受其他分析物的干擾。因此，探針HHC可應(yīng)用于復(fù)雜樣品中的檢測。

圖7 探針HHC（10μmol/L）識別的選擇性和干擾性柱狀圖

實驗選取自來水、冰糖、稀釋的紅酒和白砂糖作為待測食品檢材，利用探針HHC對待測檢材進行分析。結(jié)果表明，探針HHC可以快速、準確、高效地識別食品檢材中及加標樣品中的，且都獲得了非常理想的回收率（93.3%～101.4%，如表1所示）。此外，利用我們的檢測方法和傳統(tǒng)的滴定法對同一食品檢材進行分析，獲得了一個高度吻合的結(jié)果（如表2所示）。

Sample HSO3-level(μM) NaHSO3 added(μM) NaHSO3 founded by HHC(μM) Recovery% Tap water - - - -1 0.15 0.14±0.008 93.3 2 0.20 0.20±0.009 100.0 Crystal sugar 1.62 - - -1 0.15 1.76±0.012 99.4 2 0.20 1.81±0.022 99.5 Diluted Red wine 0.54 - - -1 0.15 0.70±0.015 101.4 2 0.20 0.73±0.012 98.6 Granualared sugar 2.22 - - -1 0.15 2.36±0.024 99.6 2 0.20 2.41±0.031 99.6

表2 傳統(tǒng)滴定法與探針HHC比較分析結(jié)果

4 結(jié)論

本文成功合成了基于羥基半花菁染料的熒光探針HHC，并將其應(yīng)用于復(fù)雜樣品中的定性與定量分析。結(jié)果表明，探針HHC不僅能夠快速、高靈敏度、高選擇性地識別

，而且還可以實現(xiàn)可視化檢測的目的。探針HHC的熒光強度變化量與加入的濃度（0～10μmol/L）呈現(xiàn)很好的線性關(guān)系，極限檢測濃度為6.8nmol/L，可被成功地應(yīng)用于食品檢材中濃度水平監(jiān)測。此外，這種新型熒光探針法的研究可以促進食品、環(huán)保等公共安全領(lǐng)域中無機毒性離子的檢測與鑒定的發(fā)展。

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DF794.3

A

2095-7939(2016)01-0077-04

2015-11-25

2015年度遼寧省教育廳科技研究項目；2015年度中國刑事警察學(xué)院研究項目。

呂勇智（1990-），男，福建廈門人，中國刑事警察學(xué)院碩士研究生，主要從事刑事毒物、毒品分析檢驗研究。

孟凡騫）