蔡杏珊 劉燕文 張?jiān)毫?陳俊宇 馬尚明 譚耀駒

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·論著·

細(xì)菌超聲分散計(jì)數(shù)儀在分枝桿菌藥物敏感性試驗(yàn)中的應(yīng)用價(jià)值

蔡杏珊 劉燕文 張?jiān)毫?陳俊宇 馬尚明 譚耀駒

目的 評(píng)估細(xì)菌超聲分散計(jì)數(shù)儀(簡(jiǎn)稱“分散儀”)在分枝桿菌藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱“藥敏試驗(yàn)”)中的應(yīng)用價(jià)值。方法 使用分散儀和磨菌瓶?jī)煞N方法對(duì)結(jié)核分枝桿菌(MTB)標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv和130株臨床分離株進(jìn)行分散處理，通過(guò)肉眼觀察和抗酸染色兩種方法對(duì)比這兩種處理方式的分散效果；同時(shí)通過(guò)平板菌落計(jì)數(shù)和藥敏試驗(yàn)來(lái)評(píng)估分散儀處理對(duì)分枝桿菌的活性及藥敏結(jié)果的影響。結(jié)果 (1)分散效果：130株分枝桿菌臨床分離株中，111株菌落形態(tài)為粗糙型，包括MTB 98株，龜膿腫分枝桿菌、恥垢分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌等共13株，經(jīng)分散儀和磨菌瓶?jī)煞N方法處理后肉眼及顯微鏡觀察，菌落呈現(xiàn)均勻分散的菌株分別占94.59%(105/111)和60.36%(67/111)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=37.28，P<0.05)。(2)菌株活性：上述兩種方法處理后的菌懸液經(jīng)7H10平板和中性羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)，分別于(12.10±1.85) d和(11.50±2.05) d長(zhǎng)出中等大小菌落，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.30，P>0.05)。統(tǒng)計(jì)上述兩法處理后接種在7H10平板上的菌落數(shù)，分別為(215.00±0.95)×104CFU/ml和(207.00±1.10)×104CFU/ml，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.93，P>0.05)；羅氏培養(yǎng)基菌落數(shù)分別為(178.00±1.31)×104CFU/ml和(185.00±1.75)×104CFU/ml，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.01，P>0.05)。(3)藥敏試驗(yàn)：分散儀處理與磨菌瓶處理菌懸液對(duì)異煙肼、鏈霉素、利福平、乙胺丁醇等一線抗結(jié)核藥物的藥敏試驗(yàn)結(jié)果符合率分別為100.00%(130/130)、90.00%(117/130)、96.15%(125/130)、98.46%(128/130)，Kappa值分別為1.00、0.73、0.88、0.90；對(duì)阿米卡星、左氧氟沙星、莫西沙星、力克菲蒺、利福布汀、丙硫異煙胺、利奈唑胺等二線抗結(jié)核藥物的藥敏試驗(yàn)結(jié)果符合率分別為98.46%(128/130)、98.46%(128/130)、98.46%(128/130)、98.46%(128/130)、98.46%(128/130)、98.46%(128/130)、99.23%(129/130)，Kappa值分別為0.74、0.85、0.79、0.85、0.89、0.91、1.00。兩種處理方法處理后的菌懸液應(yīng)用MGIT 960液體比例法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)的報(bào)告陽(yáng)性時(shí)間分別為(8.90±0.97) d和(9.30±1.23) d，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.02，P>0.05)。結(jié)論 在分枝桿菌藥敏試驗(yàn)的菌懸液制備過(guò)程中，對(duì)比傳統(tǒng)磨菌瓶處理方法，分散儀處理能更快、更好地實(shí)現(xiàn)菌株分散，并且達(dá)到菌落分散和濁度檢測(cè)一體化，同時(shí)不影響菌株的活性和藥敏試驗(yàn)結(jié)果。

分枝桿菌，結(jié)核； 超聲處理； 結(jié)核，抗多種藥物性

結(jié)核分枝桿菌(MTB)的藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱“藥敏試驗(yàn)”)是耐藥結(jié)核病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。目前在我國(guó)各級(jí)結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室中，最常用的耐藥檢測(cè)方法仍然是基于固體培養(yǎng)基培養(yǎng)的比例法和MGIT 960的液體比例法[1]，而菌懸液標(biāo)本的制備是其關(guān)鍵步驟[2]。常用的方法是磨菌瓶法：通過(guò)振蕩瓶中的玻璃珠與菌落，從而使菌落分散，然后加入含 0.5% Tween-80的生理鹽水進(jìn)行稀釋，與麥?zhǔn)?號(hào)標(biāo)準(zhǔn)比濁管或比濁儀比濁并稀釋至1個(gè)麥?zhǔn)蠞岫?MCF)，經(jīng)稀釋后接種到含藥羅氏管進(jìn)行耐藥性檢測(cè)。上述方法雖然能使菌落分散成菌體，成功完成藥敏檢測(cè)，但存在操作繁鎖、耗時(shí)長(zhǎng)、比濁粗糙，以及生物安全風(fēng)險(xiǎn)等問(wèn)題。而細(xì)菌超聲分散計(jì)數(shù)儀采用超聲分散的原理使菌落分散，同時(shí)自動(dòng)檢測(cè)濁度，最后經(jīng)人工接種到含藥培養(yǎng)管培養(yǎng)進(jìn)行耐藥性檢測(cè)，具有操作簡(jiǎn)單、安全、標(biāo)準(zhǔn)化，耗時(shí)短等優(yōu)勢(shì)。筆者分別采用細(xì)菌超聲分散計(jì)數(shù)儀 (簡(jiǎn)稱“分散儀”)和傳統(tǒng)的研磨瓶法制備臨床MTB菌株的菌懸液樣本，以評(píng)估分散儀在MTB藥敏試驗(yàn)中的應(yīng)用價(jià)值。

材料和方法

1.菌株來(lái)源：實(shí)驗(yàn)中所用的MTB標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv和130株分枝桿菌臨床分離株均由廣州市胸科醫(yī)院檢驗(yàn)科實(shí)驗(yàn)室提供。

2.主要儀器與試劑：(1)儀器：細(xì)菌超聲分散計(jì)數(shù)儀(超聲功率為19 W；廣東體必康生物科技有限公司生產(chǎn))、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱、4 ℃冰箱、生物安全柜、奧林巴斯光學(xué)顯微鏡、Eppendorf 微量移液器、BD960全自動(dòng)快速分枝桿菌培養(yǎng)儀。(2)試劑耗材：磨菌瓶、直徑9 cm平板、平板封口膜、7H9培養(yǎng)基、7H10培養(yǎng)基、羅氏中性培養(yǎng)基、接種環(huán)、生理鹽水、0.5% Tween-80生理鹽水、1.5 ml Eppendorf管、超聲分散專用試管、載玻片、鏡油、Baso抗酸染色液。

3. 分散儀分散效果試驗(yàn)：H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株和130株分枝桿菌臨床分離株均采用接種環(huán)挑取羅氏培養(yǎng)基內(nèi)菌落約一環(huán)，放入預(yù)先加有2 ml生理鹽水的超聲分散專用試管中，然后將該試管放入分散儀中進(jìn)行超聲分散：超聲5 s，間隔5 s，持續(xù)1 min。根據(jù)儀器提示加入相應(yīng)體積稀釋液，將菌懸液稀釋至1 MCF(1 mg/ml)。取同濃度磨菌瓶研磨的菌懸液樣本，肉眼觀察對(duì)比這兩種不同方式處理后菌懸液的分散效果。用生理鹽水將分散儀和研磨瓶分別處理制備的1 MCF菌懸液進(jìn)行10倍梯度稀釋，直至10-4mg/ml，然后各取0.1 ml菌液進(jìn)行抗酸染色。根據(jù)肉眼觀察和顯微鏡觀察兩種方法來(lái)評(píng)價(jià)不同處理方式的分散效果。

4.分散儀分散后菌株活性試驗(yàn)：分散儀和磨菌瓶均對(duì)H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株和130株分枝桿菌臨床分離株進(jìn)行分散處理，制備濁度為1 MCF的菌懸液樣本，再用生理鹽水對(duì)菌懸液進(jìn)行10倍梯度稀釋，直至10-3mg/ml，然后分別取100 μl菌懸液接種至7H10固體培養(yǎng)基平板和中性羅氏培養(yǎng)基上。接種時(shí)用接種環(huán)將菌液均勻涂布于平板和羅氏培養(yǎng)基上，最后將兩種培養(yǎng)基置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)過(guò)程中定期觀察菌落生長(zhǎng)狀態(tài)，待14 d菌落生長(zhǎng)至合適大小時(shí)進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，并統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。

5.分散儀對(duì)藥敏試驗(yàn)結(jié)果的影響：分散儀和磨菌瓶均對(duì)H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株和130株分枝桿菌臨床分離株進(jìn)行分散處理，參照文獻(xiàn)[3]進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，以評(píng)估兩種分散處理方法對(duì)分枝桿菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果的影響。一線藥物(異煙肼、利福平、鏈霉素、乙胺丁醇)的藥敏試驗(yàn)采用 MGIT 960 法，待儀器自動(dòng)報(bào)告結(jié)果時(shí)，記錄報(bào)陽(yáng)時(shí)間并分析結(jié)果；二線藥物(阿米卡星、左氧氟沙星、莫西沙星、力克菲蒺、利福布汀、丙硫異煙胺、利奈唑胺)采用傳統(tǒng)固體比例法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，于30 d時(shí)統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)并分析結(jié)果。

A：分散儀分散(抗酸染色 ×1000)；B：研磨瓶分散(抗酸染色 ×1000)圖2 不同分散方式處理后的結(jié)核分枝桿菌H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株菌懸液抗酸染色鏡檢結(jié)果

6.質(zhì)量控制：采用H37Rv標(biāo)準(zhǔn)菌株作為分散儀和磨菌瓶處理的分散菌落，菌懸液接種7H10平板及羅氏培養(yǎng)基用以驗(yàn)證處理后菌懸液的活性，接種含藥培養(yǎng)基以驗(yàn)證藥敏試驗(yàn)的準(zhǔn)確性，并以其結(jié)果作為本研究的質(zhì)量控制。

7.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析。應(yīng)用卡方檢驗(yàn)對(duì)分散儀和磨菌瓶處理后菌懸液均勻的菌株百分率進(jìn)行比較；對(duì)兩法處理后接種培養(yǎng)基的菌落數(shù)和報(bào)告陽(yáng)性時(shí)間進(jìn)行t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；對(duì)兩法處理后的菌液藥敏培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)行一致性檢驗(yàn)(Kappa檢驗(yàn))，Kappa≥0.75認(rèn)為兩者一致性較好。

結(jié) 果

1號(hào)和2號(hào)管均為磨菌瓶處理后的菌懸液；3號(hào)管為分散儀分散后的菌懸液圖1 磨菌瓶和分散儀處理后菌懸液分散效果的比較

1.分散效果：應(yīng)用分散儀和磨菌瓶?jī)煞N處理方式對(duì)130株分枝桿菌臨床分離株及H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行處理，肉眼觀察結(jié)果表明，分散儀分散的菌液更均勻，無(wú)明顯大的菌落顆粒；而磨菌瓶研磨處理后的菌液中存在明顯較大的菌落顆粒，見(jiàn)圖1。

抗酸染色鏡檢結(jié)果表明，分散儀分散后的菌懸液菌體分散得更均勻，無(wú)明顯的菌體聚集現(xiàn)象，而研磨瓶處理后的菌懸液存在明顯的菌體聚集現(xiàn)象，見(jiàn)圖2。

130株臨床分離株中，有111株菌落形態(tài)呈粗糙型，包括MTB 98株，龜膿腫分枝桿菌、恥垢分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌等共13株；在分散儀和磨菌瓶處理后肉眼及鏡下所見(jiàn)的菌落呈現(xiàn)均勻分散的菌株分別占94.59%(105/111)和60.36%(67/111)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=37.28，P<0.05)。19株菌落形態(tài)呈光滑濕潤(rùn)型的分枝桿菌經(jīng)上述兩種方法處理后肉眼及顯微鏡所見(jiàn)的菌落全部呈均勻分散。

2.菌株活性驗(yàn)證：將分散儀和磨菌瓶分別處理后的130株臨床分枝桿菌分離株菌懸液接種在7H10米氏平板和羅氏培養(yǎng)基上，分別于(12.10±1.85) d和(11.50±2.05) d長(zhǎng)出中等大小菌落，兩處理方法的報(bào)告陽(yáng)性時(shí)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.30，P>0.05)。統(tǒng)計(jì)上述兩法處理后接種在7H10平板上的菌落數(shù)，分別為(215.00±0.95)×104CFU/ml和(207.00±1.10)×104CFU/ml，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.93，P>0.05)；羅氏培養(yǎng)基菌落數(shù)分別為(178.00±1.31)×104CFU/ml和(185.00±1.75)×104CFU/ml，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.01，P>0.05)。

3.藥敏試驗(yàn)結(jié)果：通過(guò)分散儀和磨菌瓶這兩種處理方式完成對(duì)MTB標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv和分枝桿菌臨床分離株的菌懸液制備，然后進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。結(jié)果表明，分散儀處理與磨菌瓶處理比較，對(duì)于異煙肼、鏈霉素、利福平、乙胺丁醇等一線抗結(jié)核藥物的藥敏試驗(yàn)結(jié)果符合率分別為100.00%(130/130)、90.00%(117/130)、96.15%(125/130)、98.46%(128/130)，Kappa值分別為1.00、0.73、0.88、0.90，見(jiàn)表1；對(duì)阿米卡星、左氧氟沙星、莫西沙星、力克菲蒺、利福布汀、丙硫異煙胺、利奈唑胺等二線抗結(jié)核藥物的藥敏試驗(yàn)結(jié)果符合率分別為98.46%(128/130)、98.46%(128/130)、98.46%(128/130)、98.46%(128/130)、98.46%(128/130)、98.46%(128/130)、99.23%(129/130)，Kappa值分別為0.74、0.85、0.79、0.85、0.89、0.91、1.00，見(jiàn)表2。同時(shí)，以上兩種處理方法處理后的菌懸液應(yīng)用MGIT 960液體比例法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)的報(bào)告陽(yáng)性時(shí)間分別為(8.90±0.97) d和(9.30±1.23) d，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.02，P>0.05)。

討 論

超聲波是一種頻率高于20 000 Hz的聲波，已廣泛用于診斷學(xué)、治療學(xué)、工程學(xué)、生物學(xué)等領(lǐng)域，并取得巨大的成就。本研究所用的細(xì)菌超聲分散計(jì)數(shù)儀以液體為媒介，通過(guò)超聲波在液體中的“空化”作用，將液體中聚集成團(tuán)的菌落進(jìn)行分散和解團(tuán)聚，從而達(dá)到分散細(xì)菌的作用。小功率的超聲有分散作用而無(wú)損于細(xì)菌體，但大功率的超聲可使細(xì)菌及細(xì)胞破碎。筆者從分散儀對(duì)分枝桿菌的分散效果、細(xì)菌活性和耐藥性的影響等方面探討其在分枝桿菌處理過(guò)程中的應(yīng)用價(jià)值。

分散儀對(duì)試管內(nèi)菌落超聲5 s，間隔5 s，持續(xù)1 min，與傳統(tǒng)磨菌瓶分散處理方式相比，分散儀對(duì)菌落形態(tài)為粗糙型的分枝桿菌處理具有明顯的分散效果，能均勻分散的菌株占94.59%，大于磨菌瓶處理的60.36%；在菌株活力方面，兩法處理后接種在7H10和羅氏培養(yǎng)基上的菌落數(shù)相接近，菌落的生長(zhǎng)時(shí)間也沒(méi)有差異；兩法處理后所做的11種藥物的耐藥性檢測(cè)結(jié)果一致性也很好。研究表明，分散儀不但可以很好地分散分枝桿菌，而且對(duì)細(xì)菌沒(méi)有造成損傷，對(duì)菌株的活性和耐藥性無(wú)明顯影響，同時(shí)操作更簡(jiǎn)便，自動(dòng)分散，同步實(shí)現(xiàn)分散濁度，整個(gè)分散過(guò)程在密閉空間內(nèi)完成，給操作人員提供更好的安全保障。

分子檢測(cè)方法是目前在臨床MTB耐藥檢測(cè)中比較流行的檢測(cè)方法[4-6]。該方法的主要優(yōu)點(diǎn)是快速、方便。但還存在一些缺點(diǎn)，如檢測(cè)敏感度低，不能同時(shí)檢測(cè)多種耐藥突變基因等。傳統(tǒng)的MTB藥敏試驗(yàn)技術(shù)成熟，能全面檢測(cè)出針對(duì)多種不同藥物具有耐藥性的菌株，但該方法操作復(fù)雜，操作環(huán)境相對(duì)開(kāi)放，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中產(chǎn)生的氣溶膠對(duì)操作人員的生命安全存在潛在威脅，且實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)，通常4～8周才能得到結(jié)果。在傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)的前期菌懸液制備階段，通過(guò)分散儀來(lái)代替?zhèn)鹘y(tǒng)磨菌瓶研磨處理，更能保證安全、高效和標(biāo)準(zhǔn)化的操作，使實(shí)驗(yàn)過(guò)程更加規(guī)范化和系統(tǒng)化。

表1 分散儀和磨菌瓶處理菌懸液進(jìn)行一線抗結(jié)核藥物藥敏試驗(yàn)結(jié)果的比較(株)

表2 分散儀和磨菌瓶處理菌懸液進(jìn)行二線抗結(jié)核藥物藥敏試驗(yàn)結(jié)果的比較(株)

[1] 申曉娜,趙雁林,肖和平.結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性表型檢測(cè)的研究進(jìn)展.中國(guó)防癆雜志,2013,35(6):463-467.

[2] 中國(guó)防癆協(xié)會(huì). 結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程. 中國(guó)防癆雜志,1996, 18(2):127-134．

[3] 趙雁林,逄宇. 結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程. 北京：人民衛(wèi)生出版社, 2015.

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(本文編輯：李敬文)

Value of the bacterial ultrasonic dispersion counter applicated in mycobacterial drug susceptibility testing

CAIXing-shan,LIUYan-wen,ZHANGYuan-liang,CHENJun-yu,MAShang-ming,TANYao-ju.

ClincalLaboratory,GuangzhouChestHospital,Guangzhou510095,China

TANYao-ju,Email:gzchtan@163.com

Objective To evaluate the application of the bacterial ultrasonic dispersion counter (indicated as instrument below) in mycobacterial drug susceptibility testing. MethodsMycobacteriumtuberculosisH37Rv and 130 strains of clinical isolates were de-clumped by both declumping instrument and bacterial clusters. The de-clumping efficiencies of these two methods were compared by visual observation and acid-fast staining, while the effect of de-clumping instrument on activity and drug sensitivity of Mycobacterium was evaluated using the plate count and drug susceptibility test, respectively. Results (1) De-clumping effect. Of the 130 strains, 111 were rough mycobacterial strains, including 98Mycobacteriumtuberculosisstrains and 13 non-tuberculosis mycobacterium strains such asMycobacteriumchelonei,MycobacteriasmegmatisandMycobacteriumkansasii, et al; evaluated by visual observation and microscopic examination, homogenous declumping of the bacterial clusters were 94.59% (105/111) and 60.36% (67/111) strains after being treated with declumping instrument and bacterial clusters, respectively, the difference was statistically significant (χ2=37.28,P<0.05). (2) Viability of strain. After being processed by 7H10 and L?wenstein-Jensen media for (12.10±1.85) days and (11.50±2.05) days, sizes of bacterial colonies of the bacterial suspension treated with the above two methods showed no significant difference (t=1.30,P>0.05). Numbers of bacterial colonies on 7H10 of the two bacterial suspensions were (215.00±0.95)×104CFU/ml and (207.00±1.10)×104CFU/ml, respectively, there was no statistically significant difference (t=0.93,P>0.05); so was the difference on the L?wenstein-Jensen media ((178.00±1.31)×104CFU/ml vs. (185.00±1.75)×104CFU/ml,t=1.01,P>0.05). (3) Drug susceptibility testing. The coincident rates of bacterial suspensions treated with de-clumping instrument and bacterial clusters to first-line drugs, such as isoniazide, streptomycin, rifampicin and ethambutol were 100.00% (130/130), 90.00% (117/130), 96.15% (125/130) and 98.46% (128/130) withKappavalues of 1.00, 0.73, 0.88 and 0.90, respectively; while the coincident rates to second-line drugs, such as amikacin, levofloxacin, moxifloxacin, isoniazid-aminosalicylate, rifabutine, protionamide and linezolid were 98.46% (128/130), 98.46% (128/130), 98.46% (128/130), 98.46% (128/130), 98.46% (128/130), 98.46% (128/130) and 99.23% (129/130) withKappavalues of 0.74, 0.85, 0.79, 0.85, 0.89, 0.91 and 1.00, respectively. The positive times of the two bacterial suspensions treated with drug sensitive test by MGIT 960 liquid proportion method were (8.90±0.97) days and (9.30±1.23) days, there was no statistically significant difference (t=1.02,P>0.05). Conclusion Compared to the traditional mechanical grinding, the instrument helps to achieving faster and better de-clumping effects in the process of preparing bacterial suspensions for mycobacterial drug susceptibility testing. It could also achieving the integration of colonies dispersion and turbidity detection without affecting the bacterial viability or drug susceptibility.

Mycobacteriumtuberculosis; Sonication; Tuberculosis, multidrug-resistant

10.3969/j.issn.1000-6621.2016.11.014

510095 廣州市胸科醫(yī)院檢驗(yàn)科

譚耀駒，Email:gzchtan@163.com

2016-08-31)