韓露，高全立，宋永平，周健(鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 河南省腫瘤醫(yī)院，鄭州450008)

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·論著·

IL對(duì)NK細(xì)胞殺傷人骨髓瘤RPMI 8226細(xì)胞活性的影響及其機(jī)制

韓露，高全立，宋永平，周健(鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 河南省腫瘤醫(yī)院，鄭州450008)

摘要：目的探討IL對(duì)NK細(xì)胞殺傷人骨髓瘤RPMI 8226細(xì)胞活性的影響，并探討其機(jī)制。方法取正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞，隨機(jī)分為6 組，對(duì)照組以單純培養(yǎng)基培養(yǎng)，IL-2組加入1 000 U/mL IL-2，IL-7組加入40 ng/mL IL-7，IL-21組加入20 ng/mL IL-21，IL-2+IL-7組分別加入1 000 U/mL IL-2和40 ng/mL IL-7，IL-2+IL-7+IL-21組分別加入1 000 U/mL IL-2、40 ng/mL IL-7和20 ng/mL IL-21，均培養(yǎng)5天。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組NK細(xì)胞比例及其表面激活性受體NKG2D、NKp46、NNKp30陽性表達(dá)細(xì)胞比例，RT-PCR法檢測(cè)各組NK細(xì)胞NKG2D mRNA、NKP46 mRNA和NKP30 mRNA，CFSE/PI雙染法檢測(cè)各組NK細(xì)胞對(duì)RPMI 8226細(xì)胞的細(xì)胞毒效應(yīng)(殺傷率)。結(jié)果除IL-7組外，其余各組NK細(xì)胞比例和細(xì)胞表面NKG2D陽性表達(dá)細(xì)胞比例均較對(duì)照組升高(P均<0.05)。各組NK細(xì)胞NKG2D mRNA、NKP46 mRNA和NKP30 mRNA表達(dá)量比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。對(duì)照組NK細(xì)胞對(duì)RPMI 8226細(xì)胞的殺傷率為2.13%±0.42%、IL-2組為58.73%±1.80%、IL-7組為1.90%±0.60%、IL-21組為14.43%±1.22%、IL-2+IL-7組為34.27%±2.35%、IL-2+IL-7+IL-21組為37.47%±0.60%，各組與對(duì)照組比較P均<0.05。結(jié)論單因子IL-2、IL-21，雙因子IL-2+IL-7和多因子IL-2+IL-7+IL-21均能提高NK細(xì)胞對(duì)人骨髓瘤RPMI 8226細(xì)胞的殺傷活性，以單因子IL-2作用效果最好；其作用機(jī)制可能為IL增加NK細(xì)胞數(shù)量和其表面活化性受體NKG2D的表達(dá)量。

關(guān)鍵詞：多發(fā)性骨髓瘤；自然殺傷細(xì)胞；白細(xì)胞介素；天然細(xì)胞毒受體；NKG2D

多發(fā)性骨髓瘤(MM)是一種漿細(xì)胞惡性增殖性疾病，發(fā)病率占血液系統(tǒng)腫瘤的10%[1]。多藥聯(lián)合化療對(duì)MM的完全緩解率低于5%。造血干細(xì)胞移植聯(lián)合高劑量化療方案能夠延長(zhǎng)MM患者生存期，但移植相關(guān)疾病病死率高、缺乏人類白細(xì)胞抗原(HLA)相合供者使造血干細(xì)胞移植難以實(shí)施。近年來，細(xì)胞免疫治療成為化療和造血干細(xì)胞移植后清除殘留腫瘤細(xì)胞的重要手段[2]。NK細(xì)胞是一類具有直接殺傷靶細(xì)胞效應(yīng)的淋巴細(xì)胞。IL-2可增強(qiáng)外周血NK細(xì)胞的體外殺傷活性，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于惡性腫瘤的治療，有效率為15%～20%[3]。但I(xiàn)L-2對(duì)MM及其他IL對(duì)MM的影響及其作用機(jī)制研究較少。2010年1月～2011年3月，本研究觀察了IL-2、IL-7、IL-21對(duì)NK細(xì)胞殺傷人骨髓瘤RPMI 8226細(xì)胞活性的影響，現(xiàn)分析結(jié)果并探討其機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料①主要試劑：RPMI 1640培養(yǎng)液(Hyclone公司)，GT-T551培養(yǎng)液(TaKaRa公司)，胎牛血清(FBS，Gibco公司)，重組人IL-2(山東泉港藥業(yè)有限公司)、IL-7(Peprotech公司)、IL-21(Peprotech公司)，NKG2D-APC、NKP46-APC、NKP30-APC、CD3-FITC/CD16+CD56+-PE流式細(xì)胞熒光標(biāo)記抗體(Biolegend公司)，碘化丙啶(PI，Sigma公司)。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Reagent試劑盒、PCR Marker(Invitrogen公司)，RT-PCR反應(yīng)試劑盒(大連寶生物工程公司)?；罴?xì)胞熒光染料羧基(CFSE，Invitrogen公司)。②細(xì)胞株：人骨髓瘤細(xì)胞株RPMI 8226由鄭州大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室提供。③人外周血樣品：取自鄭州大學(xué)身體健康的大學(xué)生志愿捐獻(xiàn)者。

1.2人骨髓瘤RPMI 8226細(xì)胞培養(yǎng)人骨髓瘤RPMI 8226細(xì)胞置于含100 mL/L FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2、充分濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3NK細(xì)胞收集、分離與培養(yǎng)采用Ficoll密度梯度離心法分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)(獻(xiàn)血2 h內(nèi)完成)，PBS洗滌兩次，細(xì)胞計(jì)數(shù)后以5×106/mL分別接種于6個(gè)25 cm2培養(yǎng)瓶置于含100 μg/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素、5%自體血漿的10 mL GT-T551培養(yǎng)基培養(yǎng)。隨機(jī)分為6 組，對(duì)照組以單純培養(yǎng)基培養(yǎng)，IL-2組加入1 000 U/mL IL-2，IL-7組加入40 ng/mL IL-7，IL-21組加入20 ng/mL IL-21，IL-2+IL-7組分別加入1 000 U/mL IL-2和40 ng/mL IL-7，IL-2+IL-7+IL-21組分別加入1 000 U/mL IL-2、40 ng/mL IL-7和20 ng/mL IL-21，作用3天后離心換液并全量補(bǔ)充以上細(xì)胞因子，5天后收獲細(xì)胞。

1.4相關(guān)指標(biāo)觀察

1.4.1NK細(xì)胞比例及其表面激活性受體NKG2D、NKP46、NKP30表達(dá)采用直接免疫熒光標(biāo)記法標(biāo)記各組細(xì)胞NK細(xì)胞比例，即CD3-/CD16+CD56+細(xì)胞百分比；FACS Calibur流式細(xì)胞儀(B-D公司)檢測(cè)NK細(xì)胞表面激活性受體NKG2D、NKP46、NKP30陽性表達(dá)細(xì)胞百分比。

1.4.2NK細(xì)胞NKG2D mRNA、NKP46 mRNA和NKP30 mRNA表達(dá)采用RT-PCR法。采用TRIzol一步法提取各組細(xì)胞總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。NKG2D、NKP46和NKP30引物序列均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成(見表1)。按照說明書步驟采用ABI7300實(shí)時(shí)定量PCR儀上樣擴(kuò)增，ABI7300系統(tǒng)分析熒光值，采用2-ΔΔCt法對(duì)結(jié)果進(jìn)行相對(duì)定量分析。

表1　NKG2D、NKP46、NKP30、β-actin引物序列及產(chǎn)物

1.4.3NK細(xì)胞對(duì)人骨髓瘤RPMI 8226細(xì)胞的殺傷率收集靶細(xì)胞RPMI 8226，細(xì)胞計(jì)數(shù)后用預(yù)溫好的CFSE-PBS液重懸，37 ℃放置5 min，加入含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基終止反應(yīng)，離心棄上清，用GTT-551培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞終濃度為5×105/mL；分別將各組NK細(xì)胞密度調(diào)整為5×106/mL；將上述兩種細(xì)胞按20∶1(660 mL∶330 mL)比例混合，培養(yǎng)箱中放置4 h；每管加終濃度為1.5 mg/mL的PI，上機(jī)檢測(cè)，CellQuest軟件分析結(jié)果，計(jì)算靶細(xì)胞殺傷率[3]。

2結(jié)果

2.1各組NK細(xì)胞比例及其表面激活性受體NKG2D、NKP46、NKP30陽性表達(dá)細(xì)胞百分比比較除IL-7組，各組NK細(xì)胞比例及其表面NKG2D陽性表達(dá)細(xì)胞百分比均較對(duì)照組升高(P均<0.05)。見表2。

表2　　　　各組CD3-/CD16+CD56+細(xì)胞及其表面受體NKG2D、

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

2.2各組NK細(xì)胞NKG2D mRNA、NKP46 mRNA和NKP30 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較各組NK細(xì)胞NKG2D mRNA、NKP46 mRNA和NKP30 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表3。

表3　　　　各組NK細(xì)胞NKG2D mRNA、NKP46 mRNA

2.3各組NK細(xì)胞對(duì)RPMI 8226細(xì)胞的殺傷率對(duì)照組NK細(xì)胞對(duì)RPMI 8226細(xì)胞的殺傷率為2.13%±0.42%、IL-2組為58.73%±1.80%、IL-7組為1.90%±0.60%、IL-21組為14.43%±1.22%、IL-2+IL-7組為34.27%±2.35%、IL-2+IL-7+IL-21組為37.47%±0.60%，IL-7組較對(duì)照組降低，其余組均較對(duì)照組升高，組間比較P均<0.05。

3討論

NK細(xì)胞是一類具有直接殺傷靶細(xì)胞效應(yīng)的淋巴細(xì)胞，在機(jī)體的免疫系統(tǒng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，NK細(xì)胞表面有活化性受體和抑制性受體，這些受體與靶細(xì)胞表面相應(yīng)的配體結(jié)合，形成兩種不同的信號(hào)傳遞系統(tǒng)，對(duì)NK細(xì)胞的殺傷功能起激活或抑制作用[3]。NK細(xì)胞表面的活化性受體包括NKG2D、天然細(xì)胞毒受體(NCRs)、KIR2DS及其輔助刺激活化性受體CD244、NTB2A、CD59等[4]。NKG2D為NK細(xì)胞表面重要的活化性受體[5]，NKG2D與其配體結(jié)合后，能直接或輔助激活一系列的免疫細(xì)胞，在機(jī)體抗腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用。NCRs家族包含三種免疫球蛋白樣分子，即NKP46、NKP44和NKP30[6,7]。NCRs在細(xì)胞表面的表達(dá)程度與NK細(xì)胞功能的發(fā)揮密切相關(guān)，但NCRs的配體至今尚未明確[8]。NK細(xì)胞抑制性受體包括免疫球蛋白超家族、C型凝集素家族。抑制性受體和其相應(yīng)配體結(jié)合，傳導(dǎo)抑制信號(hào)，從而阻止NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。因此，如要提高NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷活性，除降低抑制性信號(hào)外，激發(fā)NK細(xì)胞的活化性信號(hào)更為重要[9,10]。

本研究結(jié)果顯示，除了IL-7組NK細(xì)胞比例(CD3-/CD16+CD56+)較對(duì)照組降低外，其余各組NK細(xì)胞比例均較對(duì)照組升高，表明單因子IL-2或IL-21、雙因子IL-2+IL-7和三因子IL-2+IL-7+IL-21培養(yǎng)均能促進(jìn)NK細(xì)胞擴(kuò)增；NK細(xì)胞被IL-2或IL-21單獨(dú)刺激后殺傷活性較未被刺激時(shí)明顯增強(qiáng)，NK細(xì)胞比例較未被刺激時(shí)明顯增多，NKG2D陽性表達(dá)細(xì)胞百分比明顯上調(diào)；表明IL-2或IL-21對(duì)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性影響可能一方面是增加NK細(xì)胞數(shù)量，另一方面通過上調(diào)NKG2D增強(qiáng)NK細(xì)胞的殺傷能力。但RT-PCR結(jié)果顯示，IL-2或IL-21活化的NK細(xì)胞NKG2D mRNA相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組比較并無明顯差異。推測(cè)IL-2或IL-21雖然可以上調(diào)細(xì)胞表面NKG2D表達(dá)，但并不能影響其基因水平，IL-2或IL-21對(duì)于NKG2D的調(diào)節(jié)作用可能主要是通過影響其mRNA的翻譯水平實(shí)現(xiàn)的，這與以往的研究相吻合[11,12]。IL-7組誘導(dǎo)培養(yǎng)NK細(xì)胞比例及活化性受體的相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能是本研究中IL-7的工作濃度過低，也可能是單一的IL-7并不能誘導(dǎo)NK細(xì)胞的產(chǎn)生。IL-2+IL-7組和IL-2+IL-7+IL-21組NK細(xì)胞比例及激活性受體的相對(duì)表達(dá)量并未較單獨(dú)的IL-2作用增強(qiáng)，表明IL-2、IL-7和IL-21聯(lián)合并無協(xié)同作用，其機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

研究發(fā)現(xiàn)，IL-2可上調(diào)NK細(xì)胞表面受體NKG2D、KIR2DL1、KIR2DL2表達(dá)[13]。Lu等[14]研究表明，IL-2、OKT-3和IFN-γ刺激培養(yǎng)的CIK，可使其細(xì)胞表面高表達(dá)NKG2D受體，且可阻斷MM細(xì)胞的NKG2D配體，CIK對(duì)MM細(xì)胞的細(xì)胞毒效應(yīng)明顯降低，NKG2D和其配體相互作用是介導(dǎo)CIK殺傷MM細(xì)胞的重要機(jī)制。Denman等[15]研究發(fā)現(xiàn)，膜型IL-21可促進(jìn)NK細(xì)胞活化并增強(qiáng)NK細(xì)胞的殺傷活性，膜型IL-21刺激NK細(xì)胞表面高表達(dá)NCRs、CD16和NKG2D，并可分泌大量細(xì)胞因子。本研究結(jié)果顯示，單因子IL-2或IL-21、雙因子IL-2+IL-7和多因子IL-2+IL-7+IL-21均能提高NK細(xì)胞對(duì)人骨髓瘤RPMI 8226細(xì)胞的殺傷活性，其中以單因子IL-2作用效果最好；其機(jī)制可能與細(xì)胞因子誘導(dǎo)NK細(xì)胞數(shù)量及其細(xì)胞表面活化性受體NKG2D表達(dá)增加有關(guān)，但其確切機(jī)制還需進(jìn)一步探討。

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Influence of interleukin in inducing the cytotoxicity of NK cells against human multiple myeloma RPMI 8226 cells and its mechanism

HANLu,GAOQuanli,SONGYongping,ZHOUJian

(TheAffiliatedTumorHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450008,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the influence of interleukin (IL) in inducing the cytotoxicity of natural killer (NK) cells against the activity of human multiple myeloma RPMI 8226 and the correlated molecular mechanisms. MethodsThe human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were randomly divided into 6 groups: the control group (simple culture medium), IL-2 group (added with 1 000 U/mL IL-2), IL-7 group (40 ng/mL IL-7), IL-21 group (20 ng/mL IL-21), IL-2+IL-7 group (1 000 U/mL IL-2+40 ng/mL IL-7) and IL-2+IL-7+IL-21 group (1 000 U/mL IL-2, 40 ng/mL IL-7+20 ng/mL IL-21). They were all cultured for 5 days. The proportion of NK cells and the expression of activated receptors (NKG2D, NKp46, NKp44 and NNKp30) were measured by flow cytometry. The expression of NKG2D mRNA, NKP46 mRNA and NKP30 mRNA was measured by RT-PCR. Cytotoxicity of NK cells against RPMI8226 cells was analyzed by CFSE/PI double staining. ResultsExcept the IL-7 group, the proportion of NK cells and the expression of NKG2D in the other groups were increased as compared with those of the control group (all P<0.05). No significant difference in the gene expression of NKG2D, NNKp46 and NKp30 was found among these groups (all P>0.05). The cell-killing rate of NK cells on RPMI8226 cells in the control group was 2.13%±0.42%, and that in the IL-2 group was 58.73%±1.80%, the IL-7 group was 1.90%±0.60%, the IL-21 group was 14.43%±1.22%, the IL-2+IL-7 group was 34.27%±2.35%, and the IL-2+IL-7+ IL-21 group was 37.47%±0.60%. Significant difference was found in the cell-killing rate between the control group and the other groups (all P<0.05). ConclusionsThe single factor IL-2, IL-21, double-factor IL-2+ IL-7 and multi-factor IL-2+ IL-7+IL-21 can enhance the cytotoxic effect of NK cells against RPMI 8226 cells, and the single factor IL-2 is the best. The increased number of NK cells and the expression of cell surface activation acceptor (NKG2D) may be the possible mechanism.

Key words:multiple myeloma; natural killer cell; interleukin; natural cytotoxicity receptor; NKG2D

(收稿日期：2015-12-02)

中圖分類號(hào)：R733.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-266X(2016)12-0001-04

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2016.12.001

通信作者簡(jiǎn)介：周健(1975-)，男，副主任醫(yī)師，主要研究方向?yàn)檠翰〉拿庖咧委?。E-mail: zhoujiandoctor@163.com

第一作者簡(jiǎn)介：韓露(1979-)，女，住院醫(yī)師，主要研究方向?yàn)檠翰〉拿庖咧委?。E-mail: luhan0377@163.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81000921)。