線粒體熒光標記的單顆粒水平高通量評估方法

韓錦艷 許靜怡 張翔 周穎星 陳超翔 顏曉梅

摘 要 線粒體是真核細胞能量代謝和信號轉(zhuǎn)導的調(diào)控中樞，雖然各種靈敏、特異的線粒體熒光標記技術(shù)已經(jīng)被廣泛應用于線粒體研究，但仍缺乏單線粒體水平的熒光染色性能評估方法。基于超高靈敏流式檢測技術(shù)（High sensitivity flow cytometry， HSFCM）能對單個線粒體進行高靈敏、高通量、多參數(shù)定量分析的獨特優(yōu)勢，本研究發(fā)展了一種單線粒體水平的熒光標記高通量評估方法。將攜帶靶向線粒體綠色熒光蛋白基因的pAcGFP1-Mito質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至人宮頸癌HeLa細胞中，用G418篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞，分別從瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞中提取線粒體。此外，從未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的正常HeLa細胞中提取線粒體，分別進行MitoTracker Green標記以及SYTO 62線粒體DNA染色，應用實驗室自行研制的超高靈敏流式檢測裝置在單線粒體水平對這4種線粒體標記方法的熒光亮度、標記效率和穩(wěn)定性進行評估。實驗結(jié)果表明，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞中單個線粒體的綠色熒光蛋白（GFP）熒光亮度為瞬時轉(zhuǎn)染的17.7倍，比MitoTracker Green標記的線粒體亮度高約兩個數(shù)量級，且標記穩(wěn)定性好。本研究為線粒體標記方法的選擇提供了一種先進的分析方法。

關(guān)鍵詞 線粒體；超高靈敏流式檢測技術(shù)；瞬時轉(zhuǎn)染；穩(wěn)定轉(zhuǎn)染；染料標記