曹靈芝++樊正勤++趙耘

【摘要】 目的 探討慢性乙型肝炎（CHB）患者應用核苷（酸）類似物（NAs）治療后基因耐藥變異的類型及與具體NAs、使用方法的相關性。方法 37例NAs治療中出現病毒學反彈病例作為研究對象， 檢測抗乙肝病毒（HBV）基因耐藥變異位點， 分析HBV耐藥基因變異類型與初始應用NAs具體藥物及使用方法的相關性。結果 檢測出耐藥位點陽性共35例：單藥治療組26例， 序貫治療組9例；單個位點突變14例， 兩個位點突變16例， 三個位點突變5例。結論 各種NAs均會出現不同程度的耐藥變異， 具有較高耐藥屏障的藥物發(fā)生耐藥的可能性較低。

【關鍵詞】 慢性乙型肝炎；耐藥；核苷（酸）類似物

CHB治療在近年中有了長足的進步， 主要歸功于口服NAs的應用。HBV治療過程中， 隨著治療時間的延長， 往往會出現病毒耐藥株， 影響抗病毒治療應答[1]。與未發(fā)生耐藥的患者比較， 耐藥不僅可導致疾病進展， 還會加大治療難度， 增加醫(yī)療成本[2]。因此， 如何及時靈敏地預測耐藥株的出現， 為臨床醫(yī)生提供最佳替換治療方案或重新選擇治療時機顯得尤為重要。作者對NAs治療中出現病毒學反彈的37例CHB患者， 應用HBV RT區(qū)擴增及測序， 檢測HBV基因耐藥變異位點， 檢測出耐藥位點陽性共35例， 分析其病毒變異耐藥與初始使用NAs種類、耐藥后加藥或換藥方案的相關性進行分析， 現報告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選取2013年6月～2015年6月在本院就診的NAs治療中出現病毒學反彈的符合入組條件的37例患者中， 檢測出耐藥位點的共35例為研究對象， 其中男26例， 女9例， 年齡24～69歲。入選標準：①年齡≥18歲， 乙肝表面抗原（HBsAg）陽性>6個月；②抗病毒治療指征符合《2010年中國慢性乙型肝炎防治指南》[3]；③連續(xù)使用NAs治療至少6個月， 并于入組時仍在使用；④血清HBV DNA水平≥3log 10 copies/ml；⑤無NAs應用的禁忌證。排除標準：①入組前6個月內應用過干擾素或其他免疫調節(jié)劑；②其他病毒重疊感染；③器官移植術后；④同時合并其他嚴重疾病， 包括合并其他肝病；⑤同時感染丙型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒；⑥酒精或其他成癮物質濫用；⑦妊娠和（或）哺乳期。

1. 2 方法

1. 2. 1 分組 按服藥不同分為：①單藥治療組：拉米夫定（LAM）、阿德福韋酯（ADV）、替比夫定（LdT）、恩替卡韋（ETV）組； ②序貫治療組；按突變位點數分為：單個位點突變組、兩個位點突變組、三個位點突變組。各組患者均為首次單藥治療， 耐藥后序貫治療， 按藥品說明書按時服藥。

1. 2. 2 檢測方法 HBV-DNA采用美國MX3000P核酸擴增實時熒光PCR檢測系統(tǒng)， 試劑由上海復星長征醫(yī)學科學有限公司提供， 結果以<500 copies/ml為陰性。

血清HBV RT區(qū)擴增及測序：采用美國生物應用公司ABI3500XL基因測序儀及ABI原裝試劑進行擴增及測序。序列的生物信息學分析：采用Chromas 2和 Sequence Scanner v1.0軟件進行RT區(qū)序列分析。

2 結果

2. 1 按照使用藥物分組情況 ①單藥治療組26例：單用LAM 16例， 檢測到M204I 7例， M204V 1例， L180M+M204I

3例， V173L+L180M+M204I/V 1例， L180M+M204V 2例， A181T+ N236T 1例， T184I+M204I 1例；單用LdT 5例， 檢測到M204I 3例， A181T+M204I 1例， L180M+M204I 1例；單用ADV 4例， 檢測到A181T 1例， A181T+M204V 1例， A181T/V+N236T 1例， N236T 1例；單用ETV 1例， 為L180M+T184L+M204V。②序貫治療組9例：LAM序貫ETV 1例， 為V173L+M204I；LAM序貫ADV 3例， 檢測到V173L+L180M+M204I/V 1例，

A181T+N236T 1例， A181T/V/S 1例；ADV序貫ETV 1例， 為L180M+T184L+M204V；ADV序貫LAM 2例， 檢測到V173L+ L180M+M204I 1例， L180M+M204V 1例；LAM、ADV、ETV三藥序貫1例， 為L180M+M204V；LAM、LdT、ETV三藥序貫1例， 為A181T。

2. 2 按照耐藥基因變異位點分組情況 ①單個位點突變14例， 分別為：M204VI 10例， 7例與LAM相關， 3例與LdT相關；M204V 1例， 與LAM相關；A181T 2例， 1例與ADV有關， 1例為LAM、LdT、ETV三藥序貫；N236T 1例， 與ADV有關。② 兩個位點突變16例， 分別為：L180M+M204I 4例， 3例與LAM有關， 1例與LdT有關；L180M+M204V 4例， 2例與LAM有關， 1例為ADV序貫LAM， 1例為LAM、ADV、ETV三藥序貫；A181T+M204I 1例， 與LdT有關；A181T+M204V 1例， 與ADV有關：A181T+N236T 2例， 其中1例與LAM有關， 1例為LAM序貫ADV；A181T/V+N236T 1例， 與ADV有關；A181T/V/S 1例， 為LAM序貫ADV；T184I+M204I 1例， 與LAM有關；V173L+M204I 1例， 為LAM序貫ETV。③三個位點突變5例， 分別為：V173L+L180M+M204I 1例， 為ADV序貫LAM；V173L+L180M+M204I/V 2例， 其中1例為單用LAM， 1例為LAM序貫ADV；L180M+T184L+M204V 2例， 其中1例為單用ETV， 1例為ADV序貫ETV。

3 討論

NAs主要通過抑制HBV 聚合酶區(qū)（P區(qū)）活性， 阻止HBV復制過程中以HBV 的前基因組RNA為模板， 逆轉錄生成新的病毒DNA， 從而發(fā)揮抑制病毒復制的作用。由于抑制HBV 復制需要一個長期的治療過程， 在抗病毒藥物的作用下， 野生病毒株由于選擇性壓力被抑制， 生存下來的突變株占優(yōu)勢， 最終導致病毒對藥物的敏感性下降， 病毒復制能力恢復[4]。在CHB患者體內HBV 復制效率高， 每天可產生1012～1013個病毒顆粒；HBV 聚合酶是一種逆轉錄酶， 缺乏校正功能， 且錯配率極高[5]。

目前用于治療CHB的NAs主要有5種：LAM、ADV、LdT、ETV和替諾福韋酯（TDF）。這些藥物耐受性良好， 能有效地抑制病毒復制， 主要缺點是停藥后病毒學復發(fā)率高， 長期治療又有可能致耐藥突變。

本研究選取的符合入組條件的病例37例中35例檢出不同位點變異， 檢出的耐藥突變可以明確與藥物使用有關。其中單用LAM 16例（45.7%）， 與LAM使用時間長、耐藥屏障低相符， LdT、ADV亦有相關的耐藥病例， 與ETV相關的耐藥有5例， 其中初始治療單用ETV耐藥僅1例， 其余4例為LAM、LdT、ADV耐藥后序貫ETV后發(fā)生。以上研究結果說明， 在本市CHB患者中已出現對NAs多種類型耐藥， 在NAs治療過程中出現病毒學突破的病例進行P區(qū)耐藥位點檢測陽性率較高， 可檢出與用藥相關的多種類型的突變。必須重視NAs規(guī)范化使用， 及時發(fā)現耐藥， 避免不必要的治療， 從而可以更好的指導下一步治療方案的調整， 讓患者能夠得到更好的遠期病毒學結局。

參考文獻

[1]Zoulim F， Locarnini S. Hepatitis B virus resistance to nucleos（t）ide analogues. Gastroenterology， 2009， 137（5）：1-2.

[2]參加乙型肝炎耐藥討論會. 核苷和核苷酸類藥物治療慢性乙型肝炎的耐藥及其管理.中國病原生物學雜志， 2012， 6（6）：1-10.

[3]中華醫(yī)學會肝病學分會中華醫(yī)學會感染病學分會. 慢性乙型肝炎防治指南（2010年版）.中華流行病學雜志， 2011， 16（9）： 405-415.

[4]Locarnini S. Primary resistance， multidrug resistance， and cross-resistance pathways in HBV as a consequence of treatment failure// Bioinformatics and Biomedical Engineering， 2008. ICBBE 2008. The 2nd International Conference on. IEEE， 2014：3490-3494.

[5]Kurokawa M， Hiramatsu N， Oze T， et al. Long-term effect of lamivudine treatment on the incidence of hepatocellular carcinoma in patients with hepatitis B virus infection. Journal of Gastroenterology， 2012， 47（5）：577-585.

[收稿日期：2016-01-29]