黃戎娟　劉洋　張聰

400038　中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心

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建立大鼠原位肝移植模型的手術(shù)技巧

黃戎娟劉洋張聰

400038中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心

【摘要】目的采用“二袖套法”建立穩(wěn)定的大鼠原位肝移植模型，為臨床試驗(yàn)提供依據(jù)，并探討手術(shù)技巧。方法在Kamada的“二袖套法”基礎(chǔ)上進(jìn)一步改進(jìn)，供體經(jīng)腹主動(dòng)脈行肝臟冷灌注，用縫合法吻合肝上下腔靜脈, 用袖套法吻合門(mén)靜脈與肝下腔靜脈, 膽道采用支架法重建。對(duì)200只SD大鼠進(jìn)行原位肝移植，記錄各項(xiàng)操作時(shí)間以及術(shù)后存活率、并發(fā)癥情況，專(zhuān)人對(duì)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果共對(duì)200只大鼠采用改良的“二袖套法”行原位肝移植。手術(shù)成功率為90.00%(180/200)。部分大鼠死亡原因包括出血、肝下腔靜脈血栓、肝上下腔靜脈回流不暢、袖套扭轉(zhuǎn)、脫落、膽瘺、膽道梗阻、肝功能衰竭以及肝膿腫。結(jié)論能熟練進(jìn)行顯微外科操作，并且手術(shù)精確是縮短操作過(guò)程以及減少術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生的前提。而受體大鼠的術(shù)后存活情況又與無(wú)肝期時(shí)間密切相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】肝移植；模型；并發(fā)癥；顯微外科術(shù)

近年，醫(yī)治終末期肝病的唯一辦法就是進(jìn)行肝移植手術(shù)。隨著需要行肝移植患者數(shù)目的持續(xù)增長(zhǎng)與供肝數(shù)量缺少越加明顯的沖突，霹裂式肝移植與活體肝移植的產(chǎn)生成功地緩解了這一沖突[1]。但是此類(lèi)肝移植,尤其是活體肝移植,出于對(duì)供體的安全性考慮,被移植的供肝可能與受體會(huì)出現(xiàn)重量或體積不匹配的情況,從而導(dǎo)致小體積綜合征(SFSS)[2]。大鼠原位肝移植模型作為深入研究小體積綜合征的重要模型，可用在研究肝臟的缺血再灌注損傷、移植排斥反應(yīng)、原位肝臟移植中器官的保存和免疫耐受機(jī)制等各個(gè)方面的問(wèn)題，已經(jīng)被國(guó)內(nèi)外移植中心廣泛接納并進(jìn)行大量改進(jìn)。在建立模型的初期，動(dòng)物存活的概率極低，直至使用了Kamada等[3]創(chuàng)建的“二袖套法”，才大大提高了大鼠術(shù)后的存活率。但是，就手術(shù)本身操作來(lái)說(shuō)，難度較大。本研究通過(guò)采用“二袖套法”對(duì) 200只大鼠進(jìn)行原位肝移植，對(duì)肝移植術(shù)操作的方法以及預(yù)防并發(fā)癥的發(fā)生等問(wèn)題進(jìn)行分析討論，希望能構(gòu)建穩(wěn)定、可靠的大鼠原位肝移植模型。

資料和方法

一、材料

200只六周齡的雄性清潔級(jí)SD大鼠(購(gòu)于第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。大鼠于清潔級(jí)飼養(yǎng)室喂養(yǎng)2周,飼養(yǎng)條件符合SPF標(biāo)準(zhǔn)。待體質(zhì)量增至200～300 g時(shí)配為供受體。受體(相差約為10 g)的體質(zhì)量稍稍比供體的重些，手術(shù)前一晚禁食不禁水。單人操作MC-M900型手術(shù)顯微鏡進(jìn)行操作，并采用乙醚持續(xù)開(kāi)放麻醉以及相對(duì)無(wú)菌技術(shù)。

二、手術(shù)方法

(一)獲取供肝吸進(jìn)乙醚持續(xù)麻醉之后，取大鼠仰臥位，腹部正中切口,逐層進(jìn)行分離，隨后進(jìn)入腹腔。棉簽浸濕后鈍性分離，用鹽水小紗布輔助暴露，注意操作輕柔謹(jǐn)慎。按逆時(shí)針的方向?qū)⒏闻K周?chē)g帶逐一分離,先后斷開(kāi)左三角韌帶和肝鐮狀韌帶,將左膈靜脈以及肝和食管之間血管交通支結(jié)扎并斷開(kāi)。隨后暴露肝門(mén),游離出膽總管,把前壁剪開(kāi), 把硬膜外導(dǎo)管制成的膽囊內(nèi)支撐管從切口向近端插入,再用5-0絲線把膽總管固定于支架管的淺槽里。將門(mén)靜脈游離。將幽門(mén)靜脈斷離。一般情況下，不需要結(jié)扎脾靜脈,以防止吻合的時(shí)候過(guò)長(zhǎng)或者扭曲。把250 IU肝素的生理鹽水通過(guò)陰莖背靜脈注入,肝素化供體大鼠的血液。在近腔靜脈處把右腎上腺靜脈進(jìn)行結(jié)扎并切斷。向左側(cè)移動(dòng)腸管,暴露左腎靜脈水平以下的腹主動(dòng)脈，并向近心端穿刺其前壁,置入導(dǎo)管以灌注。之后剪開(kāi)膈肌,把胸主動(dòng)脈用鉗夾剪斷。將0℃～4℃的10 mL乳酸林格氏液通過(guò)腹主動(dòng)脈導(dǎo)管注入,同時(shí)迅速把膈上下腔靜脈切斷,引流出灌注液,并不斷地用4℃的乳酸林格氏液澆淋供肝表面,讓供肝均勻降溫。最后貼住膈肌環(huán)將肝上下腔靜脈斷開(kāi)。把肝動(dòng)脈結(jié)扎、切斷,于門(mén)靜脈與脾靜脈匯合處將門(mén)靜脈斷離,在左腎靜脈的上方把肝下腔靜脈斷離。獲取供肝，保存在4℃保存液里。

(二)修整供體肝操作在4℃乳酸林格氏液中進(jìn)行。由14號(hào)與16號(hào)聚乙烯靜脈穿刺套管針的套管制作而成的門(mén)靜脈與肝下腔靜脈套管。把外翻的門(mén)靜脈與肝下腔靜脈套于血管套管后并固定。配備血管袖口時(shí)，一定要確保套管安裝在正確的位置上。在修正的時(shí)候，要不斷修剪肝上、下腔靜脈旁的膈肌，并剪去其腔靜脈環(huán)水平多余的下腔靜脈。

(三)受體肝切除手術(shù)之前，受體肌肉注射0.03 mg的阿托品和抗生素。麻醉的方法、手術(shù)的體位、切口與供體一致。但是在固定四肢時(shí)，為防止針頭刺傷肢體，需借助橡皮筋。按逆時(shí)針?lè)较蛑饌€(gè)游離肝周韌帶。結(jié)扎肝固有動(dòng)脈的起始部，并從近肝端將肝固有動(dòng)脈切斷。斜形剪開(kāi)膽總管在左右肝管匯合之處，在遠(yuǎn)端放入臨時(shí)使用的膽管內(nèi)支撐管，擴(kuò)張備用，并用絲線結(jié)環(huán)扎固定。把后腹膜剪開(kāi)，腎血管的平面上的肝下腔靜脈后面使用顯微鑷游離,同時(shí)結(jié)扎右腎上腺靜脈。注意保護(hù)被結(jié)扎的右腎上腺靜脈不被斷離，以作為受體即將要切斷的肝下腔靜脈固定的支撐點(diǎn)。使用血管夾按照肝下腔靜脈(臨近右腎靜脈)、門(mén)靜脈(臨近幽門(mén)靜脈)依次夾閉，確保受體進(jìn)入無(wú)肝期。降低吸入麻醉的劑量。在門(mén)靜脈的分叉處用5號(hào)針頭穿刺，隨后注入2 mL的生理鹽水，待肝臟轉(zhuǎn)為土黃色。使用膈肌鉗和小兒Satinsky鉗將肝上下腔靜脈鉗夾，并緊貼著肝臟斷離。再在門(mén)靜脈分叉處剪斷門(mén)靜脈。最后上提肝臟，將肝下腔靜脈斷離，并且注意留少量肝組織以確保下腔靜脈斷端保持張開(kāi)狀態(tài)。移出受體肝臟。

(四)原位肝移植把供肝放在原來(lái)的位置，將小紗布?jí)|置在肝后，調(diào)整紗布，把供肝與受體的相應(yīng)血管調(diào)整到最吻合的位置。用彎頭顯微持針鉗和8-0血管縫線連續(xù)縫合供肝與受體的肝上下腔靜脈。把門(mén)靜脈上的套管柄用顯微止血鉗鉗夾,并用膠泥固定后者。將膠泥位置和血管鉗方向謹(jǐn)慎調(diào)整后，確保供肝門(mén)靜脈套管與受體的門(mén)靜脈距離最小，將后者套于套管，采用絲線固定。隨后松開(kāi)受體的靜脈阻斷夾，待肝臟迅速變紅后，松開(kāi)Satinsky鉗，結(jié)束無(wú)肝期。用膠泥輔助固定,采用相同方法吻合肝下腔靜脈。可見(jiàn)右腎的外觀很快變?yōu)檎?，否則，則提示下腔靜脈可能回流受阻。將用于固定受體膽總管支撐管插管的絲線活結(jié)打開(kāi)，拔出膽總管內(nèi)的支撐管，清洗其切口處的血凝塊，并把供肝的膽總管里支撐管外側(cè)的1/2插進(jìn)受體的膽總管。因?yàn)樾枰匦陆⒛懝苎┎⒈苊饽懧?，?yīng)把大網(wǎng)膜圍繞在吻合口。最后逐一關(guān)腹。

三、術(shù)后護(hù)理

手術(shù)后緩慢注射2 mL乳酸林格氏液于陰莖背靜脈以補(bǔ)充血容量，糾正酸中毒。把大鼠放在保溫?zé)粝逻M(jìn)行照射并讓其連續(xù)吸入氧氣，等其完整清醒并可以照?；顒?dòng)后，置入單籠喂養(yǎng)1 d，當(dāng)日飲用10%葡萄糖。次日標(biāo)記后與其它動(dòng)物合籠，正常飲食。若要采血檢查，則需進(jìn)行采血后補(bǔ)液。

結(jié)果

一、各項(xiàng)操作時(shí)間統(tǒng)計(jì)

本研究采取改良后的“二袖套法”行手術(shù)200次。其中獲取供肝的手術(shù)時(shí)間(29.52±5.34) min；修整供肝時(shí)間(11.31±3.37) min；受體操作時(shí)間(包括肝切除和原位肝移植)共(44.24±5.54) min，無(wú)肝期(18.45±2.59) min。

二、并發(fā)癥情況與存活率

術(shù)后2 d內(nèi)共死亡20例，其中8例因出血，6例因肝下腔靜脈血栓，4例因肝上下腔靜脈回流不暢，2例因袖套扭轉(zhuǎn)、脫落。手術(shù)成功率(術(shù)后2 d存活率)為90.00%(180/200)。術(shù)后1周內(nèi)共死亡41例，除去前2 d內(nèi)死亡者，1例因肝下腔靜脈血栓，1例因肝上、下腔靜脈回流不暢，4例因膽漏,6例因膽道梗阻，8例因肝功能衰竭，1例因肝膿腫。1周存活率為79.50%(159/200)。3個(gè)月內(nèi)共死亡56例，除去前1周內(nèi)死亡者，11例因膽道梗阻，3例因肝功能衰竭，1例因肝膿腫。3個(gè)月存活率為72.00%(144/200)。至發(fā)文時(shí)，術(shù)后存活時(shí)間最長(zhǎng)的大鼠已超過(guò)16個(gè)月。詳見(jiàn)表1。

表1　各階段大鼠死亡原因及存活率情況

討論

一、手術(shù)操作技巧

供體與受體在手術(shù)前1晚不需禁食,不過(guò)，在手術(shù)前受體需要肌注0.03 mg的阿托品，用于減少呼吸道產(chǎn)生過(guò)多分泌物以及預(yù)防窒息等。

供體與受體都采取在腹部正中切口的方法，可以防止在操作橫切口的時(shí)候出血過(guò)多，另外還有手術(shù)創(chuàng)傷小、恢復(fù)得快等優(yōu)點(diǎn)[4]。在供體與受體肝臟游離時(shí)，都按逆時(shí)針?lè)较蛑鸩椒蛛x，可避免因多次翻動(dòng)肝臟而造成刺激，同時(shí)規(guī)范了操作的步驟也節(jié)省了時(shí)間。在受體進(jìn)行分離肝臟手術(shù)時(shí)，肝上、下腔靜脈的后方要預(yù)留牽引線，便于鉗夾與分離肝上、下腔靜脈的時(shí)候?qū)⒏闻K牽引向下。

供體經(jīng)腹主動(dòng)脈行肝臟冷灌注。游離供肝后，通過(guò)用乳酸林格氏液(含肝素100 U)10 mL經(jīng)腹主動(dòng)脈進(jìn)行肝臟冷灌注，外加4℃的乳酸林格氏液澆淋供肝表面，以使供肝盡快進(jìn)入冷缺血狀態(tài)。進(jìn)入腹主動(dòng)脈之后的灌注液，大多數(shù)通過(guò)各器官循環(huán)進(jìn)到門(mén)靜脈，最后灌注肝臟，小部分則通過(guò)肝動(dòng)脈立刻灌注到肝臟,既使肝臟有了雙重灌注，也能確保門(mén)靜脈適當(dāng)壓力，保證得到的供肝熱缺血時(shí)間靠近零，且質(zhì)量較好[5]。 Kashfi A等[6]研究發(fā)現(xiàn)，跟以往的經(jīng)門(mén)靜脈灌注后行肝臟冷灌注相比，經(jīng)腹主動(dòng)脈灌洗具有更均勻和徹底等諸多優(yōu)點(diǎn)。此外，研究發(fā)現(xiàn)肝素化供體血液比單純經(jīng)陰莖背靜脈注射純肝素250 IU的效果好，且便于移植肝在復(fù)流后的微循環(huán)恢復(fù)。

修整供肝時(shí)，要使用溫度處在4℃的保存液。進(jìn)行套血管袖口時(shí)，右腎靜脈結(jié)扎線與門(mén)靜脈屬支的結(jié)扎線可用作辨別血管方向的標(biāo)記，確保套管柄在肝下腔靜脈與門(mén)靜脈前方[5]。把套管體部里血管的旁邊清除整潔，防止留在脂肪組織或者結(jié)扎線頭。部分研究提出在修剪肝上、下腔靜脈的時(shí)候留下少許膈肌，防止縫合血管時(shí)產(chǎn)生撕裂現(xiàn)象[7]。但我們發(fā)現(xiàn)，在手中修剪肝所有膈肌后，由于無(wú)膈肌的存在，血管的可塑性會(huì)變得更好，還確保吻合口的大小足夠，只要小心操作，就不會(huì)造成血管撕裂。

在血管重新建立的過(guò)程中，本研究全部采用“二袖套法”吻合血管，即將肝下腔靜脈與門(mén)靜脈以袖套法吻合，而肝臟上、下腔靜脈則以縫合法吻合，結(jié)果令人滿(mǎn)意。同時(shí)，還可通過(guò)移動(dòng)膠泥的位置與使用輔助小紗布來(lái)調(diào)整供體與受體之間的血管處于最佳吻合位置。研究人員發(fā)現(xiàn)[8]，受體的無(wú)肝期不應(yīng)該超過(guò)26 min。而本組無(wú)肝期為(18.45±2.59) min，雖然有6例大鼠的無(wú)肝期長(zhǎng)達(dá)30 min,術(shù)后3個(gè)月內(nèi)仍有4例移植成活。但我們也認(rèn)為受體大鼠的無(wú)肝期長(zhǎng)短是手術(shù)是否成功的關(guān)鍵。另外，在吻合肝上、下腔靜脈時(shí)，因?yàn)槠浔诒?操作應(yīng)輕柔細(xì)致,爭(zhēng)取一次成功。

二、術(shù)后并發(fā)癥的預(yù)防

出血：本組共有8例動(dòng)物由于術(shù)后出血死亡，通過(guò)尸檢發(fā)現(xiàn)部分是因兩拐角處縫合不牢靠造成,部分則因?yàn)榭p合時(shí)進(jìn)針緣距過(guò)大，導(dǎo)致靜脈壁因受力不均而撕裂。因此，熟練地運(yùn)用顯微縫合技術(shù)，縫合過(guò)程中小心謹(jǐn)慎，并確保吻合口無(wú)張力是預(yù)防術(shù)后出血的重要之處。而靜脈縫合后不需要再檢查吻合口，以免撕裂靜脈[9]。

血栓形成：本組共發(fā)生肝下腔靜脈血栓7例。研究表明，肝下腔靜脈血栓常發(fā)生于術(shù)后早期，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，在進(jìn)行血管重建時(shí)，應(yīng)僅用顯微鑷夾血管外膜，而盡可能避免損傷血管內(nèi)皮。在吻合之前，放出部分受體大鼠血管里近心端淤阻的高凝血液與血凝塊。此外，盡可能縮短受體操作的手術(shù)時(shí)間也是預(yù)防本并發(fā)癥的關(guān)鍵。

膽道梗阻：與血栓不同，膽道梗阻多發(fā)生在術(shù)后晚期,且對(duì)受體大鼠肝原位肝移植后長(zhǎng)期存活的影響很大。本組共發(fā)生膽道梗阻17例，尸檢可見(jiàn)，膽道插管被泥沙樣的結(jié)石堵塞，管長(zhǎng)多長(zhǎng)于5 mm。這提示可能因插管過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致膽汁流出不暢，加上插管時(shí)容易損傷膽管內(nèi)壁引發(fā)炎癥，最終形成結(jié)石堵塞膽管。因此管長(zhǎng)不應(yīng)過(guò)長(zhǎng)，直徑要和膽總管的直徑相匹配，同時(shí)還要防止因鉗夾使膽管變形，并在插入膽管前沖洗管內(nèi)血液。

綜上所述，許多因素都能夠?qū)υ桓我浦材Ｐ痛婊町a(chǎn)生影響，因此，必須重視操作中所有細(xì)節(jié)。能熟練進(jìn)行顯微外科操作，并且手術(shù)精確是縮短操作過(guò)程以及減少術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生的前提。而受體大鼠的術(shù)后存活情況又與無(wú)肝期時(shí)間密切相關(guān)。細(xì)致耐心的操作與反復(fù)訓(xùn)練則是肝移植成功的關(guān)鍵所在。而良好的麻醉控制，穩(wěn)定的血液動(dòng)力學(xué)，以及移植后立刻恢復(fù)體溫、保持呼吸道通暢等也能夠讓手術(shù)成功率大大提高。

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(本文編輯：易玲)

(收稿日期：2015-08-10)