龔 青，王 茜，陳浩宇，鄭唯強，陳 潔

1. 第二軍醫(yī)大學附屬長海醫(yī)院消化內科，上海 200433； 2. 徐匯區(qū)中心醫(yī)院老年病科； 3. 第二軍醫(yī)大學附屬長海醫(yī)院病理科

結直腸癌組織中PTEN、PI3K的表達與其病理特點及預后的相關性研究

龔 青1,2，王 茜1，陳浩宇1，鄭唯強3，陳 潔1

1. 第二軍醫(yī)大學附屬長海醫(yī)院消化內科，上海 200433； 2. 徐匯區(qū)中心醫(yī)院老年病科； 3. 第二軍醫(yī)大學附屬長海醫(yī)院病理科

目的 研究結直腸癌組織中PTEN/PI3K/Akt信號通路上PTEN、PI3K的表達與結直腸癌病理特點及預后的關系，探討PTEN、PI3K在結直腸癌發(fā)生、發(fā)展及預后中的作用。方法 選取2013年1月-2014年12月第二軍醫(yī)大學附屬長海醫(yī)院術后病理證實的結直腸癌石蠟標本且臨床資料齊全者67例作為研究組。另選擇30例距腫瘤邊緣5 cm以外的正常結腸黏膜組織作為對照組。應用免疫組織化學染色方法檢測結直腸癌及癌旁組織中PTEN、PI3K和CD34的表達水平，并對其在結直腸癌組織中的表達與年齡、臨床分期、腫瘤直徑、病理類型及淋巴結轉移等病理特點的關系進行分析。結果 結直腸癌組織中PTEN、PI3K蛋白的陽性表達率分別為50.7%、67.2%，癌旁正常組織中的陽性表達率為93.3%、13.3%，兩組比較,差異均有統(tǒng)計學意義(χ2=16.30、24.01，P<0.05)。結直腸癌組織中的MVD值明顯高于癌旁組織,差異有統(tǒng)計學意義(t=7.52，P<0.05)。結直腸癌組織中PTEN蛋白表達與腫瘤直徑、浸潤深度、Dukes分期、淋巴結轉移具有相關性(P<0.05)，而與性別、年齡、腫瘤部位、分化程度無明顯相關(P>0.05)；PI3K蛋白表達與Dukes分期和淋巴結轉移具有相關性(P<0.05)，而與性別、年齡、腫瘤部位、分化程度、浸潤深度、腫瘤直徑無相關性(P>0.05)。結直腸癌組織PTEN與PI3K的表達呈顯著負相關(r=-0.617，P<0.05)，PTEN與MVD值呈顯著負相關(r=-0.594，P<0.05)，而PI3K與MVD值呈顯著正相關(r=0.425，P<0.05)。Kaplan-Meier生存分析法顯示結腸癌患者的中位TTP為18.2個月(95%CI：15.9～20.4)，其中PTEN陽性者中位TTP為19.7個月(95%CI：15.5～23.8)，PTEN陰性者中位TTP為16.5個月(95%CI：12.0～20.9)，PTEN陽性者的中位TTP顯著高于陰性者，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=3.57，P<0.05)。PI3K陽性者中位TTP為16.8個月(95%CI：13.0～20.0)，PI3K陰性者中位TTP為18.2個月(95%CI：16.8～21.1)，PI3K陰性者與陽性者的中位TTP比較，差異無統(tǒng)計學意義(χ2=1.37，P>0.05)。 結論 結直腸癌組織中PTEN呈低表達或缺失，而PI3K的陽性表達水平明顯高于癌旁組織，PTEN、PI3K參與了結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展。檢測PTEN、PI3K的表達對于判斷結直腸癌的惡性程度具有重要參考價值。

結直腸癌；PTEN；PI3K；信號通路；病理特點；預后

隨著腫瘤發(fā)病機制研究的深入，尤其是在基因分子水平的進一步認識，越來越多研究著眼于與腫瘤細胞增殖分化等有關的信號傳導通路及其相關產物對腫瘤的影響，其中PTEN/PI3K/Akt信號傳導通路作為細胞增殖和凋亡最為密切的通路之一而備受關注。同時，以該通路為靶點治療腫瘤的小分子特異性抑制劑也逐漸成為該領域研究的熱點。目前，PTEN/P13K/Akt傳導通路相關基因的表達已被證實與肺癌、乳腺癌、腎癌等惡性腫瘤的發(fā)病及預后密切相關[1]，但對于結直腸癌的相關研究仍相對較少。因此，通過對該通路相關基因在癌組織中的表達及相互作用，將助于我們進一步揭示結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展的機制，為其個體化治療及與預后預測發(fā)揮重要作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年1月-2014年12月長海醫(yī)院術后病理證實的結直腸癌石蠟標本，且臨床資料齊全者67例。所有患者均經手術及組織病理學確診，術前均未接受任何放射治療或化學治療。男38例，女29例；年齡41～78歲，平均年齡(56.2±5.2)歲；Dukes分期：A期16例，B期21例，C期19例，D期11例；手術方式：右半結腸切除術24例，左半結腸切除術20例，乙狀結腸切除術16例，橫結腸切除術7例；腫瘤部位：結腸癌36例，直腸癌31例；腫瘤直徑：<2 cm 40例，≥2 cm 27例；分化程度：高分化23例，中分化19例，低分化25例；轉移狀況：有淋巴結轉移36例，無淋巴結轉移31例。另外，選擇30例距腫瘤邊緣5 cm以外的正常結腸黏膜組織作為對照組。術后立即取材，采用10%中性甲醛固定，石蠟包埋，制作成厚度為3 μm的連續(xù)組織切片4張，1張行常規(guī)HE染色用于病理形態(tài)觀察，其余行免疫組化染色。

1.2 納入與排除標準 納入標準：(1)符合結直腸癌的診斷標準[2]，并經手術及組織病理學確診；(2)術前均未進行任何放射治療、化學治療及其他抗腫瘤治療；(3)術后石蠟標本保存完好，待測組織充足；(4)患者或家屬簽署知情同意書。排除標準：(1)臨床、病理資料不齊全者；(2)妊娠期、哺乳期婦女；(3)術前已經接受放療、化療或其他免疫治療者；(4)在外院接受結直腸癌手術切除術者；(5)免疫性疾病，嚴重心、肝腎功能障礙及其他內外科疾病患者。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化法步驟(SP法)：(1)載玻片的清洗：實驗前置入10%硝酸溶液浸泡12 h后，流水清洗10遍以上，烘干后置于無水酒精內浸泡2 h，室溫下晾干備用。(2)防脫片處理：按照1∶50的比例用丙酮稀釋APES(3-氨丙基三乙氧硅烷)配成工作液，將載玻片置于其中，20 s后取出，再置于純丙酮中洗去未結合的APES，2～3次，通風廚中晾干備用。(3)標本處理：將石蠟塊連續(xù)切成4張3 μm切片，放入70 ℃烘片機中烘烤1 h；(4)常規(guī)切片脫蠟水化：將烘干后的石蠟切片置于二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各脫蠟10 min，再置于無水乙醇Ⅰ、Ⅱ各脫蠟3 min，浸入梯度酒精(95%、85%、75%、65%)各3 min，置于流水沖洗5 min。(5)將切片置于PBS中，再放震蕩儀中震蕩3次，每次2 min。(6)抗原熱修復：將切片放在耐高溫的切片架子上，加入適量0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液，移至微波爐加熱至沸騰，然后冷卻至室溫，如此反復操作1～2次。(7)取出切片，用PBS沖洗3次，每次2 min。(8)吸干組織外的水分，每張切片加入50 μl試劑A，室溫孵育15 min，滅活內源性過氧化物酶。PBS沖洗3次，每次2 min。(9)每張切片加入試劑B封閉，室溫孵育20 min。(10)每張切片滴加一滴特異性一抗(PTEN、PI3K)，4 ℃過夜。次日早晨，PBS沖洗3次，每次2 min。(11)每張切片加入1滴試劑C，37 ℃恒溫箱中孵育30 min。PBS沖洗3次，每次2 min。(12)每張切片滴入50 μl試劑D，37 ℃溫箱中孵育30 min。孵育完成后，PBS震蕩洗滌4次，每次5 min。(13)DAB顯色：在石蠟切片上滴加DAB顯色劑，顯微鏡下控制反應時間，PTEN、PI3K各顯色3～5 min，顯色結束后，流水沖洗10 min。(14)復染：將切片浸泡在蘇木素溶液中35 min，進行堿性核染色。酸酒精分色，自來水反藍15 min。(15)常規(guī)脫水、透明及封固：酒精70%→80%→95%→無水乙醇Ⅲ-Ⅳ→二甲苯Ⅱ-Ⅰ各脫水10 min，透明、甩干。(16)中性樹膠封片，顯微鏡觀片，照相。

三種抗體均采用試劑盒已知陽性組織作為陽性對照，以PBS 0.01 mol/L(pH 7.2～7.4)代替一抗體作為陰性對照，在相同條件下進行染色。至少由2位富有經驗的病理醫(yī)師對切片進行獨立觀察。

1.4 免疫組化染色結果判定

1.4.1 PTEN、PI3K的判定標準：參考許良中等[3]的半定量分級計分方法，判斷標準如表1所示。

1.4.2 CD34的判定標準：血管內皮細胞單位面積腫瘤內微血管密度(microvessel density,MVD)計數(shù)值以CD34抗原標記，由此評價腫瘤血管生成的活躍程度，CD34存在于血管內皮細胞胞膜，呈棕黃色，胞漿可見棕黃色顆粒。

表1 免疫組化染色的積分標準

1.4.3 MVD計數(shù)方法：按照文獻[4]的方法，首先在低倍鏡(100×)下定位5個視野密度最高的腫瘤中血管，然后在高倍鏡(400×)下統(tǒng)計5個視野的MVD值，取其平均值作為最終MVD值。若呈棕色的內皮細胞或細胞簇，且與腫瘤組織的背景有明顯差異則均視為一個血管計數(shù)；若血管腔超過8個紅細胞直徑，且有較厚肌層的血管及硬化區(qū)域的血管，均不納入統(tǒng)計。

2 結果

2.1 結直腸癌組織與癌旁正常組織PTEN、PI3K蛋白表達水平比較 在結直腸癌組織中，PTEN多呈弱陽性或不表達狀態(tài)。結直腸癌組織中PTEN、PI3K蛋白的陽性表達率分別為50.7%、67.2%，癌旁組織中的陽性表達率分別為93.3%、13.3%，兩組比較，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=16.30、24.01，P<0.05)(見表2～3、圖1～4)。

表2 結直腸癌組織與癌旁組織中PTEN蛋白表達水平比較

表3 結直腸癌組織與癌旁組織中PI3K蛋白表達水平比較

圖1 PTEN在結直腸癌組織中的表達(SP 400×)；圖2 PTEN在癌旁正常組織中的表達(SP 400×)；圖3 PI3K在結直腸癌組織中的表達(SP 400×)；圖4 PI3K在癌旁正常組織中的表達(SP 400×)；圖5 CD34在結直腸癌組織中的表達(SP 400×)；圖6 CD34在癌旁正常組織中的表達(SP 400×)

2.2 結直腸癌組織與癌旁組織MVD(CD34標記)表達水平比較 CD34特異表達于血管內皮細胞胞漿內，呈棕黃色細顆粒狀，結直腸癌組織分布不均，呈簇狀或發(fā)芽狀，癌灶浸潤邊緣及腫瘤間質最為密集，而癌旁正常組織分布較少且相對均勻。結直腸癌組織中的MVD值為30.31±8.73，明顯高于癌旁組織MVD值(17.41±5.15)，差異有統(tǒng)計學意義(t=7.52，P<0.05，見圖5～6)。

表4 PTEN在結直腸癌組織中的表達與病理特點的相關性

2.3 PTEN、PI3K在結直腸癌組織中的表達與病理特點的相關性 結直腸癌組織中PTEN蛋白表達與浸潤深度、Dukes分期、腫瘤直徑和淋巴結轉移具有相關性(P<0.05)，而與年齡、性別、腫瘤部位、分化程度無明顯相關(P>0.05)；PI3K蛋白表達與Dukes分期和淋巴結轉移具有相關性(P<0.05)，而與年齡、性別、腫瘤部位、分化程度、浸潤深度、腫瘤直徑無相關性(P>0.05，見表4～5)。

表5 PI3K在結直腸癌組織中的表達與病理特點的相關性

2.4 結直腸癌組織中PTEN、PI3K表達的相關性分析 Spearman秩相關分析發(fā)現(xiàn)，結直腸癌組織中PTEN和PI3K的表達具有顯著負相關性(r=-0.617，P<0.05，見表6)。

表6 結直腸癌組織中PTEN和PI3K的相關性分析

2.5 結直腸癌組織中PTEN、PI3K蛋白表達與MVD值的相關性 經Spearman秩相關分析，結直腸癌組織中PTEN與MVD值呈顯著負相關，而PI3K與MVD值呈顯著正相關(r=-0.594、0.425，P<0.05)。

2.6 PTEN、PI3K的表達與TTP的相關性 以手術時間至復發(fā)時間作為TTP。通過Kaplan-Meier法對結直腸癌患者進行生存分析。67例結直腸癌患者的中位TTP為18.2個月(95%CI: 15.9～20.4)，其中PTEN陽性者中位TTP為19.7個月(95%CI: 15.5～23.8)，PTEN陰性者中位TTP為16.8個月(95%CI: 12.0～20.9)。經Log-rank檢驗，PTEN陽性者的中位TTP顯著高于陰性者，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=3.57，P<0.05，見圖7)。

圖7 結直腸癌患者PTEN蛋白表達水平與TTP的關系

PI3K陽性者中位TTP為16.5個月(95%CI: 13.0～20.0)，PI3K陰性者中位TTP為18.2個月(95%CI: 16.8～21.1)。經Log-rank檢驗，PI3K陰性者與陽性者的中位TTP比較，差異無統(tǒng)計學意義(χ2=1.37，P>0.05，見圖8)。

圖8 結直腸癌患者PI3K蛋白表達水平與TTP的關系

3 討論

3.1 結直腸癌患者PTEN、PI3K蛋白表達水平 PTEN蛋白為多功能蛋白質，同時具有脂質磷酸酶與蛋白磷酸酶活性。一方面，PTEN可脫磷酸化PIP3，形成的PIP2缺乏信號傳導功能，進而阻斷PI3K信號通路拮抗Akt的活性，抑制細胞增殖同時促進細胞凋亡。PTEN在其中正是扮演“分子開關”的角色。另一方面，PTEN通過蛋白磷酸酶活性磷酸化Shc(Src homology2 domain containing)和局灶黏附激酶(focal adhesion kinase, FAK)，并調節(jié)黏著途徑(FAK途徑)、絲裂原活化蛋白激酶途徑(MAPK途徑)，從而抑制細胞的侵襲與轉移[4]。動物實驗[6]發(fā)現(xiàn)，條件性敲除PTEN進而誘發(fā)腫瘤的發(fā)生，且PTEN缺失在散發(fā)性結直腸癌中具有重要作用。另有研究[7]表明，PTEN基因在調節(jié)細胞的極性、細胞與細胞連接、旁滲透、遷移和致瘤中具有重要作用。

PI3K作為一種磷脂酰肌醇激酶, 是新近發(fā)現(xiàn)的磷脂激酶家族中的一個重要成員。PI3K的過度活化造成Akt的過度激活，從而破壞PTEN/PI3K/Akt信號通路，使細胞過度增殖，影響其下游靶蛋白參與調節(jié)細胞的增殖、侵襲及轉移等多種生命活動，發(fā)生癌變[8]。同時，許多研究證實，PI3K在腫瘤生物學發(fā)展中具有重要的抗凋亡作用，而凋亡則是化療發(fā)揮作用的主要模式，這也正是惡性腫瘤細胞對化療藥物出現(xiàn)耐藥性的重要機制之一[9]。在結直腸癌組織中，PTEN陽性表達主要位于腫瘤細胞胞質包膜內，主要呈棕黃色顆粒，呈均質狀，正常結直腸癌組織黏膜以強陽性表達為主，結直腸癌則表現(xiàn)為弱陽性或陰性。PI3K主要定位于結直腸癌細胞胞質包膜中，呈棕黃色、黃色、淡黃色，癌旁組織呈相對低表達或不表達。研究結果顯示，結直腸癌組織中PTEN、PI3K蛋白的陽性表達率與癌旁正常組織中的陽性率比較，差異均有統(tǒng)計學意義，說明PTEN、PI3K在結直腸癌的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。而在表達陽性強度方面，PTEN趨向于癌強度越強，著色越淺，而PI3K則反之。Takei等[10]報道稱，通過轉染PTEN基因可對前列腺癌、卵巢癌等腫瘤的發(fā)生及其惡變起到有效抑制作用，且過表達的PTEN有助于改善預后。此外，PI3K的過度活化也可導致結腸癌的發(fā)生。

3.2 結直腸癌患者PTEN、PI3K的表達與MVD值的關系 許多腫瘤中PTEN 缺失或突變、PI3K的表達上調所致PI3K持續(xù)性激活與腫瘤的侵襲力高度相關，而PTEN、PI3K激活也可能通過刺激腫瘤血管形成而促進腫瘤侵襲與轉移[11]。本研究結果顯示，CD34特異表達于血管內皮細胞胞漿內，呈棕黃色細顆粒狀，結直腸癌組織分布不均，呈簇狀或發(fā)芽狀，癌灶浸潤邊緣及腫瘤間質最為密集，而癌旁組織分布較少且相對均勻，進一步說明CD34參與了結直腸癌新生血管的形成。此外，結直腸癌組織中的MVD值明顯高于癌旁組織。相關分析顯示，結直腸癌患者組織PTEN與MVD值呈顯著負相關，而PI3K與MVD值呈顯著正相關。以上數(shù)據(jù)均說明 PTEN 及PI3K可能作為調控因子在腫瘤血管生成中發(fā)揮重要作用。

3.3 結直腸癌患者PTEN、PI3K的表達與臨床病理參數(shù)間的關系 結直腸癌組織中PTEN表達與腫瘤直徑、浸潤深度、Dukes分期、淋巴結轉移具有相關性，而與性別、年齡、腫瘤部位、分化程度無明顯相關，與張偉等[12]研究結果一致，說明PTEN的表達與結直腸癌的侵襲力呈反比，推測其可能原因是低表達PTEN基因上調血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、基質金屬蛋白酶9(matrix metallo-proteinase-9,MMP-9)等因子表達，促進了腫瘤血管形成，從而增強了腫瘤細胞的侵襲與遷移能力[13]。結直腸癌組織中PI3K表達與Dukes分期、淋巴結轉移具有相關性，而與性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤部位、浸潤深度、分化程度無明顯相關性，表明PI3K參與了結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展及轉移，其主要通過下游的Akt分子實現(xiàn)對結直腸癌侵襲轉移等方面的影響。本研究67例結直腸癌中，PTEN和PI3K的表達具有顯著負相關性，表明PI3K的過度表達可能與PTEN的低表達或缺失有關，揭示了PI3K、PTEN在結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中可能互相拮抗，PTEN的缺失可能引起PI3K/Akt信號通路的激活并發(fā)揮負調控作用，二者共同促進了結直腸癌的惡性進展，也提示了PI3K和PTEN有望成為結直腸癌治療的兩個靶點。

3.4 PTEN、PI3K的表達與預后的相關性 本文經Log-rank檢驗，PTEN陽性者的中位TTP顯著高于陰性者，差異有統(tǒng)計學意義,表明PTEN表達水平是結直腸癌的一種獨立預后因素，PTEN的表達缺失預示著不良預后。Jang等[14]研究發(fā)現(xiàn)，PTEN陰性表達的結直腸癌患者無病生存和總生存時間較短，且其3年生存率明顯低于陽性表達者,其可能原因是PTEN作為一種抑癌基因，其缺失后機體將通過多種機制誘發(fā)結直腸癌較低的分化程度及較高的侵襲能力，從而縮短患者的生存時間。本文經Log-rank檢驗，PI3K陰性者與陽性者的中位TTP比較，差異無統(tǒng)計學意義，提示PI3K無法作為結直腸癌預后的獨立預測指標，但由于本研究樣本量有限，同時影響結直腸癌患者的預后較多，如確診時間、手術方式及術后輔助治療等，同時還涉及其他基因參與組成的龐大網(wǎng)絡系統(tǒng)，均發(fā)揮一定的作用，故尚無法排除PI3K在結直腸癌預后中的潛在作用。

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(責任編輯：王豪勛)

Study on the expressions of PTEN, PI3K and the correlation with pathological characteristics and prognosis in colorectal carcinoma

GONG Qing1,2, WANG Qian1, CHEN Haoyu1, ZHENG Weiqiang3, CHEN Jie1

1. Department of Gastroenterology, Changhai Hospital， the Second Military Medical University, Shanghai 200433; 2. Department of Geriatrics, the Central Hospital of Xuhui District; 3. Department of Pathology, Changhai Hospital, the Second Military Medical University, China

Objective To study the expressions of PTEN and PI3K of PTEN/PI3K/Akt signal transduction pathway in the colorectal carcinoma tissue, and to analyze the correlation with the clinic pathological factors and prognosis of colorectal carcinoma, and to discuss the role of expressions of PTEN and PI3K in the occurrence of colorectal carcinoma. Methods Sixty-seven patients with complete clinical data who were colorectal carcinoma pathologically confirmed after operation from Jan.2013 to Dec.2014 in Changhai Hospital were selected． Thirty cases of normal colonic mucosa tissues at 5 cm outside the tumor edge were also selected as control group. The expressions of PTEN, PI3K and CD34 in the colorectal carcinoma tissue and para-carcinoma tissue were detected by immunohistochemical staining, the correlation between three indicators above and pathological features such as age, clinical stage, tumor diameter, pathological types and lymph node metastasis were analyzed. Results The expressions of PTEN and PI3K in colorectal carcinoma tissue were 50.7%, 67.2%, and 93.3%, 13.3% in para-carcinoma tissue, there was statistically significant (χ2=16.30, 24.01,P<0.05).The count of MVD in colorectal carcinoma was significantly higher than that in para-carcinoma tissue (t=7.52,P<0.05). The expression of PTEN in colorectal carcinoma was related with tumor diameter, depth of invasion, Dukes clinical stages and lymphatic metastasis (P<0.05), not related with age, sex, tumor site, differentiated degree (P>0.05). The expression of PI3K in colorectal carcinoma was related with Dukes clinical stages and lymphatic metastasis (P<0.05), not related with age, sex, tumor site, differentiated degree, tumor diameter, depth of invasion (P>0.05). The expression of PTEN was negatively correlated with the expression of PI3K in colorectal carcinoma (r=-0.617,P<0.05). The count of MVD in colorectal carcinoma was negatively correlated with the expression of PTEN(r=-0.594,P<0.05), positive correlated with the expression of PI3K (r=0.425,P<0.05). Kaplan-Meier survival analysis showed that median TTP of all patients was 18.2 months (95%CI: 15.9～20.4). The median TTP of positive PTEN expression group was 19.7 months (95%CI: 15.5～23.8), and negative PTEN expression group was 16.5 months (95%CI: 12.0～20.9). Log-rank test showed that median TTP in positive PTEN expression group was significantly longer than that in negative PTEN expression group (χ2=3.57,P<0.05). The median TTP of positive PI3K expression group was 16.8 months (95%CI: 13.0～20.0), and negative PI3K expression group was 18.2 months (95%CI: 16.8～21.1). Log-rank test showed that median TTP between positive and negative PI3K expression groups was not statistically significant (χ2=1.37,P>0.05). Conclusion PTEN in colorectal carcinoma tissue is in low or missing expression, and the positive expression of PI3K is obviously higher than that of para-carcinoma tissue, PTEN and PI3K participate in the occurrence and development of colorectal carcinoma. The expressions of PTEN and PI3K have important reference value in the diagnosis of malignant degree of colorectal carcinoma.

Colorectal carcinoma; PTEN; PI3K; Signal pathway; Pathological characteristics; Prognosis

龔青，主治醫(yī)師，研究方向：消化道疾病及消化腫瘤的診斷與治療。E-mail: 13501733993@163.com

陳潔，博士，副主任醫(yī)師,研究方向：慢性胰腺炎的機制、消化道病變的內鏡診治。E-mail: jiechen0115@sohu.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.05.017

R735.3

A

1006-5709(2016)05-0547-07

2016-01-02