蓋曲倞，董凌月，安 威

首都醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)系 肝臟保護(hù)與再生調(diào)節(jié)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100069

非酒精性脂肪性肝炎及肝纖維化動(dòng)物模型的建立

蓋曲倞，董凌月，安 威

首都醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)系 肝臟保護(hù)與再生調(diào)節(jié)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100069

目的 通過(guò)膽堿缺乏飲食及乙硫氨酸的聯(lián)合作用構(gòu)建非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis, NASH)及肝纖維化動(dòng)物模型。方法 選擇雄性C57BL/6J小鼠給予含60%高脂的膽堿缺乏飼料，并在第1周的飲水中輔以0.165%的乙硫氨酸加重打擊。于第4周、第8周和第16周各隨機(jī)處死5只小鼠。分離血清，取肝臟組織分別進(jìn)行HE染色、油紅O染色及天狼猩紅染色，應(yīng)用圖像分析法對(duì)天狼猩紅染色結(jié)果進(jìn)行膠原含量半定量分析。結(jié)果 造模第4周，血清中ALT、AST及TG的含量明顯上升，油紅O染色顯示肝臟組織已經(jīng)出現(xiàn)大量的脂滴堆積，HE染色可見(jiàn)大量空泡，但無(wú)病理性纖維化發(fā)生。造模第8周，肝臟組織除可見(jiàn)大量脂滴，天狼猩紅染色觀察肝組織中央靜脈及匯管區(qū)周?chē)z原纖維少量增生。造模第16周，天狼猩紅染色在竇周隙內(nèi)可見(jiàn)成細(xì)絲狀乃至索狀的膠原纖維分布。結(jié)論 經(jīng)改良方法后，成功建立小鼠NASH及肝纖維化的模型。

動(dòng)物模型；非酒精性脂肪性肝炎；肝纖維化；膽堿缺乏飲食；乙硫氨酸

近年來(lái)，隨著生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的改變，非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)已成為發(fā)病率最高的肝臟疾病之一，并愈加趨于年輕化[1-3]。依據(jù)病程，NAFLD可分為單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis, NASH)及NASH相關(guān)肝硬化，其中NASH是NAFLD疾病進(jìn)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，是單純性脂肪肝發(fā)展至肝纖維化和肝硬化的必經(jīng)階段[4]。一旦進(jìn)展到NASH階段，病程則很難逆轉(zhuǎn)。建立NASH動(dòng)物模型是研究NASH疾病進(jìn)展、分子機(jī)制及預(yù)防治療的有效手段。目前蛋氨酸膽堿缺乏飲食和高脂高糖飲食所致NASH的動(dòng)物模型多有報(bào)道，而表現(xiàn)NASH肝纖維化模型卻少見(jiàn)報(bào)道[5]。本實(shí)驗(yàn)采用改進(jìn)膽堿缺乏飲食的方法建立小鼠NASH肝纖維化模型，并進(jìn)行相關(guān)的檢測(cè)評(píng)價(jià)，為臨床研究NASH向肝纖維化轉(zhuǎn)變過(guò)程提供理想的動(dòng)物模型。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與飼料配置 選用體質(zhì)量約20 g的雄性C57BL/6J小鼠30只(購(gòu)買(mǎi)于北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院)造模。60%高脂的膽堿缺乏飼料購(gòu)自北京華阜康生物科技有限公司。乙硫氨酸購(gòu)自Tokyo Chemical Industry。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物模型制備方法：小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，隨機(jī)分為對(duì)照組(n=5)給予普通飼料，自由飲水；造模組(n=25)給予膽堿缺乏飲食，在第1 周的飲水中添加乙硫氨酸(終濃度0.165%)，自由飲用，第2 周即恢復(fù)正常飲水。其中模型組(n=15)用來(lái)觀察各項(xiàng)指標(biāo)，觀察組(n=10)用來(lái)觀察造模所引起的死亡率。

1.2.2 生活狀態(tài)、體質(zhì)量變化及肝指數(shù)檢測(cè)：造模期間觀察小鼠的生活狀態(tài)、食欲變化及毛發(fā)狀態(tài)等情況。每周稱(chēng)量體質(zhì)量，分別于第4周、第8周及第16周隨機(jī)處死模型組小鼠各5只，并于第16周處死對(duì)照組小鼠5只。動(dòng)物隔夜禁食，處死前稱(chēng)量體質(zhì)量。取血后迅速取出肝臟稱(chēng)重，計(jì)算肝指數(shù)(肝指數(shù)=肝重/體質(zhì)量)。

1.2.3 血清指標(biāo)：取血后分離血清，利用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)的含量。

1.2.4 肝臟組織病理學(xué)觀察：分離肝臟后留取部分組織4%多聚甲醛固定，分別進(jìn)行石蠟包埋和OCT包埋。石蠟切片后分別進(jìn)行HE染色和天狼星紅染色；冰凍切片后進(jìn)行油紅O染色。HE染色和油紅O染色后切片在普通光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟形態(tài)學(xué)變化及脂肪堆積情況，天狼星紅染色后切片在偏振光顯微鏡下觀察肝臟膠原沉積情況。

1.2.5 膠原含量半定量分析：天狼星紅染色后，在偏振光顯微鏡下，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野采集圖像，將采集圖像輸入Image Pro Plus 6.0系統(tǒng)，進(jìn)行單位視野內(nèi)組織膠原堆積面積的測(cè)量。

2 結(jié)果

2.1 造模后小鼠的一般狀態(tài) 在造模過(guò)程中，對(duì)照組小鼠體質(zhì)量逐漸增加并趨于穩(wěn)定，生活狀態(tài)良好，毛發(fā)光澤；而造模組小鼠體質(zhì)量在第1周急劇下降，后緩慢回升，再平緩上升，在第16周與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見(jiàn)表1)。隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，造模組小鼠的皮毛日漸疏松且油膩，精神萎靡。

2.2 造模后小鼠的肝臟變化及肝指數(shù)情況 造模16周后處死的小鼠，分離肝臟，可見(jiàn)對(duì)照組小鼠肝臟表面光滑，色澤粉紅，無(wú)結(jié)節(jié)，無(wú)脂肪變性；而模型組小鼠肝臟表面光澤差，顏色偏黃白，有明顯脂肪變性，個(gè)別有米粒大小的結(jié)節(jié)(見(jiàn)圖1)。稱(chēng)量肝重后計(jì)算肝指數(shù)，結(jié)果顯示造模4周后肝指數(shù)即明顯增加，8周后上升更為明顯，到16周后肝指數(shù)與第8周相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)表1)。

表1 各組小鼠體質(zhì)量與肝指數(shù)±s)

注：與對(duì)照組相比，*P<0.0001。

圖1 小鼠肝臟照片 A：對(duì)照組； B：模型組(造模16周后)

2.3 造模后小鼠的血清學(xué)指標(biāo)變化 小鼠取血后分離血清，分別檢測(cè)血清中ALT、AST、TG及TC的含量。結(jié)果顯示，造模4周后，血清中ALT和AST的含量明顯增高，而造模第8周和第16 周與第4周相比并無(wú)明顯差異，但造模后各組與對(duì)照組相比，均明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0001)。造模4 周后血清中TG含量增加，此后保持穩(wěn)定，但造模后各組與對(duì)照組相比均明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0001)；而血清中TC的含量在各組間相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見(jiàn)表2)。

表2 各組血清生化指標(biāo)比較±s)

注：與對(duì)照組相比，*P<0.0001。

2.4 HE染色與油紅O染色結(jié)果 石蠟切片后進(jìn)行HE染色，顯微鏡下可觀察到對(duì)照組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞無(wú)變性壞死及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，圍繞中央靜脈呈放射狀排列。造模4周后即可見(jiàn)肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞胞漿內(nèi)以小泡性脂肪病變?yōu)橹?，脂肪病變的肝?xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的比值>1/3，但無(wú)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。造模8 周后小鼠肝細(xì)胞仍有嚴(yán)重的脂肪病變，且可見(jiàn)不同數(shù)量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。造模16 周后小鼠肝細(xì)胞可見(jiàn)氣球性樣變和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(見(jiàn)圖2)。冰凍切片后油紅O染色結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞胞漿基本沒(méi)有紅色脂滴，造模后肝細(xì)胞胞漿內(nèi)均可見(jiàn)大量紅色脂滴，但各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)圖3)。

2.5 天狼星紅染色結(jié)果 石蠟切片后進(jìn)行天狼星紅染色，偏振光顯微鏡下觀察可見(jiàn)，造模8周后，除匯管區(qū)內(nèi)有膠原纖維染色外，竇周隙內(nèi)可見(jiàn)少量膠原纖維增生。至造模第16周，膠原沉積明顯增加，竇周隙內(nèi)可見(jiàn)膠原纖維形成細(xì)絲狀甚至粗索狀分布，肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，也可見(jiàn)纖維組織增生。利用Image Pro Plus 6.0分析膠原面積，結(jié)果顯示，造模第16周肝組織的膠原面積明顯大于造模第8周，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)圖4)。

圖4 天狼星紅染色與膠原面積分析 A：造模8周組；B：造模16周組；C：膠原面積分析

3 討論

近年來(lái)，NAFLD的發(fā)病率不斷攀升，我國(guó)的發(fā)病率為10%～20%[6-8]。NAFLD在臨床病理上分為三個(gè)階段：?jiǎn)渭冃灾靖?、NASH，進(jìn)一步惡化為肝纖維化和肝硬化，甚至發(fā)展為原發(fā)性肝癌[9-10]。NAFLD在病程最初階段具有自限性，可以通過(guò)控制飲食和改變生活方式來(lái)逆轉(zhuǎn)疾病[11]。而NASH是NAFLD疾病進(jìn)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，是單純性脂肪肝發(fā)展為肝纖維化和肝硬化的必經(jīng)階段[4，12-13]。一旦進(jìn)展到NASH階段，病程就很難逆轉(zhuǎn)[14]。構(gòu)建一個(gè)能夠完整反映NAFLD所包括的三個(gè)階段的有效模型對(duì)研究NAFLD疾病進(jìn)程及分子機(jī)制顯得尤為重要[15]。

目前關(guān)于NAFLD動(dòng)物模型構(gòu)建的報(bào)道中，單純性脂肪肝動(dòng)物模型已經(jīng)較為成熟，主要有轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)和飲食誘導(dǎo)3種方法[16-18]。其中以高糖高脂飲食誘導(dǎo)喂養(yǎng)最為常用[19-20]。但是構(gòu)建由單純性脂肪肝過(guò)渡到NASH再到肝纖維化肝硬化這樣反應(yīng)NAFLD全病程的動(dòng)物模型的方法并不多見(jiàn)。其中最為常用的是利用膽堿缺乏并添加乙硫氨酸飲食(choline-deficient, ethionine-supplemented)，即CDE飲食構(gòu)建動(dòng)物模型。此模型的優(yōu)點(diǎn)是短期喂食可使動(dòng)物肝臟發(fā)生脂肪變性、炎癥；長(zhǎng)期喂食則可使動(dòng)物肝臟發(fā)生纖維化、硬化甚至肝癌，可模擬NAFLD的病程。但此方法的缺點(diǎn)是動(dòng)物體質(zhì)量下降超過(guò)20%，死亡率非常高導(dǎo)致難以在實(shí)驗(yàn)初期估算動(dòng)物例數(shù)，增加實(shí)驗(yàn)的難度并降低了可重復(fù)性。因此，本實(shí)驗(yàn)改良了CDE方法，構(gòu)建一個(gè)時(shí)間相對(duì)較短、死亡率低、成功率高、可重復(fù)性好的動(dòng)物模型，同樣使動(dòng)物模型能夠完整表達(dá)NAFLD所經(jīng)歷的三個(gè)階段。

本實(shí)驗(yàn)除在膽堿缺乏飼料添加60%高脂以避免體質(zhì)量下降過(guò)快外，最主要的改良在于僅在第1周的飲用水中添加乙硫氨酸，而后恢復(fù)正常飲水。實(shí)驗(yàn)中小鼠體質(zhì)量下降僅發(fā)生在第1周，且下降程度不超過(guò)10%，而后體質(zhì)量穩(wěn)步回升直至正常。這些結(jié)果說(shuō)明改良后的飲食首先解決了體質(zhì)量下降過(guò)快的問(wèn)題。小鼠造模第16 周時(shí)，30只小鼠除處死20只外，僅有1只耐受能力較差死亡，剩余9只小鼠繼續(xù)喂食含有60%高脂膽堿缺乏飼料，至52周仍沒(méi)有死亡，說(shuō)明改良后的方法明顯降低了小鼠的死亡率。且使用改良后的方法并沒(méi)有延長(zhǎng)傳統(tǒng)CDE飲食的造模時(shí)間，造模第4周時(shí)，小鼠肝組織已出現(xiàn)明顯的脂肪堆積，但并無(wú)較明顯炎癥的發(fā)生；造模第8周時(shí)，小鼠肝細(xì)胞仍然出現(xiàn)嚴(yán)重的脂肪病變，且可看到不同程度的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；造模第16周時(shí)，小鼠炎性細(xì)胞浸潤(rùn)嚴(yán)重，且可以在竇周隙內(nèi)看到成細(xì)絲狀甚至少量粗索狀的膠原纖維分布。

綜上所述，用該方法構(gòu)建NAFLD模型，與人類(lèi)NAFLD的自然發(fā)病過(guò)程極為接近，且死亡率低、操作簡(jiǎn)單，是研究NAFLD的發(fā)病機(jī)制、疾病進(jìn)程及預(yù)防治療的一個(gè)實(shí)用的研究工具。

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(責(zé)任編輯：王全楚)

Establishment of non-alcoholic steatohepatitis/liver fibrosis model

GAI Qujing, DONG Lingyue, AN Wei

Department of Cell Biology and Municipal Laboratory of Liver Protection and Regeneration Regulation, Capital Medical University, Beijing 100069, China

Objective To establish non-alcoholic steatohepatitis (NASH)/liver fibrosis model by the combination of choline-deficient diet and ethionine.Methods Thirty male C57BL/6J mice were randomly divided into control group (n=5) and model group (n=15). Model mice were placed on choline-deficient diet (60% kcal fat) and drinking water containing 0.165% DL-ethionine at the first week. Five mice in model group were killed at 4th, 8th and 16th weeks, respectively. The serums were collected. The histological analysis was conducted by HE staining, Oil Red O staining and Sirius Red staining. The Sirius Red staining was analyzed by image analysis system to semi-quantify the collagen area.Results Compared with control group, liver tissue in model group mice showed markedly increased lipid accumulation but no fibrosis after 4 weeks. Observation of liver tissue revealed a small increasein collagen fiber hyperplasia around the central vein and portal area after 8 weeks. Sirius Red staining revealed filamentous collagen fiber distribution in perisinusoidal space after 16 weeks.Conclusion The mice model of NASH/liver fibrosis can be established successfully by the combination of choline-deficient diet and ethionine.

Animal model; Non-alcoholic steatohepatitis; Liver fibrosis; Choline-deficient diet; Ethionine

國(guó)家自然科學(xué)基金(31371169)

蓋曲倞，碩士研究生，研究方向：肝刺激因子與非酒精性脂肪肝。E-mail:gaiqujing@yeah.net

安威，教授，研究方向：肝刺激因子。E-mail：anwei@ccmu.edu.cn

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.05.020

R575

A

1006-5709(2016)05-0562-04

2016-03-10