席海秀 艾可筠 佟少明

（遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 遼寧省植物生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大連 116081）

普通小麥幼苗葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體分離方法的優(yōu)化

席海秀 艾可筠 佟少明

（遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 遼寧省植物生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大連 116081）

以7日齡小麥幼苗的葉肉細(xì)胞為材料，采用正交試驗(yàn)分析了纖維素酶濃度、離析酶濃度、酶解時(shí)間、甘露醇濃度對(duì)原生質(zhì)體分離時(shí)的產(chǎn)量和活力的影響；采用瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)通過PEG-Ca2+介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化小麥的原生質(zhì)體，分析了PEG濃度對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響。結(jié)果表明，小麥葉片原生質(zhì)體分離的最佳條件為纖維素酶1.5%，離析酶 0.75%，甘露醇0.4 mol/L，酶解時(shí)間3 h，得到的原生質(zhì)體的產(chǎn)量可達(dá)到7.2×106個(gè)/g·FW，活力超過95%；瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在25% PEG濃度下，小麥原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化效率最高。

普通小麥；原生質(zhì)體；分離；瞬時(shí)表達(dá)

原生質(zhì)體是指去除細(xì)胞壁的植物細(xì)胞，可以同整株植物一樣進(jìn)行正常的生理反應(yīng)和細(xì)胞活動(dòng)［1］，是多功能的植物遺傳改良的重要實(shí)驗(yàn)體系之一，在研究細(xì)胞生理過程和活動(dòng)中發(fā)揮著重要的作用，如細(xì)胞壁的合成，細(xì)胞分裂、分化［1］，光合作用［2］，鈣離子信號(hào)調(diào)控［3］，蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位［4］和完整細(xì)胞器的分離［5］。應(yīng)用原生質(zhì)體為受體進(jìn)行的遺傳操作必須建立在其有效分離的技術(shù)基礎(chǔ)之上。原生質(zhì)體分離的方法主要有機(jī)械法和酶解法兩種，機(jī)械法分離原生質(zhì)體的過程非常復(fù)雜且產(chǎn)量低，而酶解法可以在短時(shí)間內(nèi)非常容易地分離出大量的原生質(zhì)體，因此目前常用酶解法分離原生質(zhì)體。從Cocking等［6］首次采用酶解法成功地分離原生質(zhì)體至今，已經(jīng)成功應(yīng)用此法分離到了多種植物的原生質(zhì)體，如擬南芥［1］、煙草［7］、水稻［8］、一品紅［9］及番茄［10］等。

普通小麥（T.aestivum. L）是世界上種植面積最大的糧食作物，由于其具有遺傳上的高度雜合性、染色體的多種倍性和來源廣泛等特點(diǎn)，使其原生質(zhì)體培養(yǎng)一直受到重視，成為小麥育種的重要手段之一，通常小麥的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞和愈傷組織常用來作為分離原生質(zhì)體的材料［11］，但應(yīng)用這兩種材料分離原生質(zhì)體耗時(shí)長，操作繁瑣，且經(jīng)酶解后仍有很多未酶解的組織，細(xì)胞和已破碎的物質(zhì)對(duì)原生質(zhì)培養(yǎng)和進(jìn)一步的遺傳轉(zhuǎn)化等極為不利［12］。目前，僅有少數(shù)的報(bào)道對(duì)小麥葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體的分離方法進(jìn)行了研究。本研究以7日齡小麥的葉肉細(xì)胞為材料，對(duì)分離原生質(zhì)體過程中使用的酶濃度、酶解時(shí)間及酶解液中甘露醇濃度等因素進(jìn)行研究，建立了最佳的小麥葉肉細(xì)胞的原生質(zhì)體制備體系，旨為進(jìn)一步的細(xì)胞培養(yǎng)和融合及以原生質(zhì)體為受體材料而進(jìn)行的各種遺傳操作提供參考。

圖1 用于制備原生質(zhì)體的麥苗及酶解液中的麥苗切段

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)材料為普通小麥（T. aestivum L）品系CAU981，用5%的次氯酸鈉對(duì)種子進(jìn)行表面消毒處理10 min，蒸餾水沖洗3遍，置于4℃冰箱中黑暗培養(yǎng)3 d后，將種子分散放置在盛有水的托盤里，水分以沒過種子為準(zhǔn)，置于培養(yǎng)室（溫度25℃，相對(duì)濕度60%，16 h光照/8 h黑暗，光強(qiáng)250 μmol· m-2·s-1）中培養(yǎng)。取播種后生長至第7天的麥苗的葉片及葉鞘部分作為實(shí)驗(yàn)材料（圖1-A）。

實(shí)驗(yàn)所用載體是在pBI221基礎(chǔ)上改造而成，由煙草花葉病毒35S啟動(dòng)子、螢火蟲熒光素酶基因和NOS終止子構(gòu)成。

1.2 方法

1.2.1 小麥葉肉原生質(zhì)體分離 取2 g（約50-60株）麥苗，用新的手術(shù)刀片切成0.5-1 mm細(xì)條；立即將切好的材料浸沒在0.4 mol/L甘露醇中，黑暗處理10 min；棄掉甘露醇后，將細(xì)條培養(yǎng)在裝有20 mL酶解液的三角瓶中；用錫紙將三角瓶包好，黑暗條件下用真空干燥器抽真空30 min，使細(xì)條完全浸沒在酶解液中（圖1-B）；將三角瓶置于搖床中，在室溫黑暗條件下以60-80 r/min轉(zhuǎn)速振蕩酶解；當(dāng)酶解液變綠后2 h在顯微鏡下觀察原生質(zhì)體分離情況，每隔0.5 h檢測一次，約3 h原生質(zhì)體可充分釋放（圖2）。

1.2.2 小麥葉肉原生質(zhì)體純化 酶解結(jié)束后，用等體積的W5洗液［2 mmol/L MES（pH5.7）；154 mmol/L NaCl；125 mmol/L CaCl2；5 mmol/L KCl］，稀釋酶解液；將原生質(zhì)體懸浮液經(jīng)200目（0.75 μm）的尼龍過濾網(wǎng)（提前用W5洗液潤洗）過濾到50 mL的離心管中去除未酶解的組織，每次用5 mL W5洗液沖洗3-5次；取濾液室溫下100 g離心5 min，去除上清液；用15 mL的W5洗液將原生質(zhì)體重新懸浮起來，100 g離心5 min，重復(fù)操作3次洗滌純化原生質(zhì)體；最后用15 mL W5溶液懸浮原生質(zhì)體，60 g離心5 min收集原生質(zhì)體。

1.2.3 小麥原生質(zhì)體分離條件的優(yōu)化 依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果及已報(bào)道的文獻(xiàn)資料，選取纖維素酶濃度、離析酶濃度、甘露醇濃度及酶解時(shí)間4個(gè)因素中較優(yōu)的3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，通過正交試驗(yàn)確定小麥原生質(zhì)體分離的最優(yōu)條件，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平，見表1。

表1 小麥原生質(zhì)體分離正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表

1.2.4 原生質(zhì)體產(chǎn)量測定 用5-10倍的W5溶液稀釋收集到的原生質(zhì)體，取少量原生質(zhì)體懸浮液滴加在0.1 mm 血球計(jì)數(shù)板上，蓋上蓋玻片，在光學(xué)顯微鏡下（10×100）觀測，計(jì)算4個(gè)角上大格及中央大格（共5個(gè)大格）內(nèi)的原生質(zhì)體數(shù)目，然后按公式計(jì)算原生質(zhì)體總數(shù)，每個(gè)樣品重復(fù)3次，最后計(jì)算出每克材料分離得到的原生質(zhì)體產(chǎn)量（個(gè)/g·FW）。

原生質(zhì)體數(shù)（個(gè)/mL）=5個(gè)大格內(nèi)原生質(zhì)體總數(shù)×5×1 000×稀釋倍數(shù)

原生質(zhì)體產(chǎn)量（個(gè)/g）=［原生質(zhì)體數(shù)（個(gè)/mL）×稀釋后體積（mL）］/葉片質(zhì)量（g）

1.2.5 原生質(zhì)體活力測定 采用FDA（Sigma）染色法檢測原生質(zhì)體活力。取100 μL原生質(zhì)體懸浮液，加入 2 μL 5 mg/mL FDA（丙酮溶解），2-5 min 后在熒光顯微鏡下觀察［13］，統(tǒng)計(jì)發(fā)綠色熒光的原生質(zhì)體數(shù)和原生質(zhì)體總數(shù)。原生質(zhì)體活力以一個(gè)視野中有活力的原生質(zhì)體占該視野中原生質(zhì)體總數(shù)的百分?jǐn)?shù)來表示，隨機(jī)選取3個(gè)視野進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

原生質(zhì)體活力=（發(fā)綠色熒光的原生質(zhì)體數(shù)/原生質(zhì)體總數(shù)）×100%

1.2.6 小麥原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化 將原生質(zhì)體懸浮液200 g離心5 min，棄上清收集原生質(zhì)體；用MMG溶液（4 mmol/L MES；0.4 mol/L甘露醇；15 mmol/L MgCl2）稀釋原生質(zhì)體至1×106個(gè)/mL；取100 μL原生質(zhì)體加入到2 mL tube 管中，每管加入10 μL質(zhì)粒（15-20 μg）混勻；加入110 μL不同濃度的PEG-Ca2+轉(zhuǎn)化液（0.2 mol/L甘露醇；100 mmol/L CaCl2；10%、20%、 25%、30%和40% PEG-4000）；23℃暗培養(yǎng)20 min；加入440 μL的W5溶液終止反應(yīng)，200×g離心5 min；棄上清，加入260 μL的WI溶液（4 mmol/L MES；0.5 mol/L 甘露醇；5 mmol/L KCl），混勻后加入到24孔板（BSA洗液潤洗），23℃暗培養(yǎng)24 h。

1.2.7 熒光素酶基因瞬時(shí)表達(dá)檢測 熒光素酶基因瞬時(shí)表達(dá)檢測采用熒光素酶檢測試劑盒（Promega，USA）在發(fā)光儀（Berthold，Germany）上檢測所發(fā)熒光的強(qiáng)度，檢測過程參照說明書，略加修改。

將用液氮快速冷凍轉(zhuǎn)化后過夜培養(yǎng)的原生質(zhì)體，充分研磨；加入100 μL CCLR（試劑盒中試劑）重新懸浮并勻漿；平衡至室溫后1 000×g離心2 min；取上清，棄碎片，加入200 μL裂解液和100 μL檢測試劑；混勻后，于發(fā)光儀上檢測熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 小麥原生質(zhì)體最佳分離條件的確定

在設(shè)定的水平范圍內(nèi)，根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)小麥原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活性進(jìn)行極差分析，確定纖維素酶、離析酶、甘露醇濃度及酶解時(shí)間4個(gè)因素對(duì)小麥原生質(zhì)體產(chǎn)量及活性的影響（表2）。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析

從表2中的極差分析可知，纖維素酶濃度的R值最大，說明這幾個(gè)因素中纖維素酶濃度對(duì)小麥葉片原生質(zhì)體分離影響最大；其次是離析酶濃度。在本研究中，選用播種后生長至第7天小麥幼苗的葉片和葉鞘制備原生質(zhì)體時(shí)，酶液組合為1.5%纖維素酶及0.75%離析酶，解離3 h后分離到的原生質(zhì)體的產(chǎn)量可以達(dá)到7.2×106個(gè)/g·FW。

2.2 小麥原生質(zhì)體活力測定

原生質(zhì)體活力高低是代表原生質(zhì)體分離質(zhì)量好壞的重要指標(biāo)之一，本研究中采用FDA染色法對(duì)小麥原生質(zhì)體進(jìn)行染色，染色后發(fā)綠色熒光的原生質(zhì)體為有活力的原生質(zhì)體。熒光顯微鏡下觀察大部分小麥原生質(zhì)體發(fā)出綠光，染色清晰（圖2-D、E、F），最佳酶解條件下原生質(zhì)體活力可高達(dá)98%。

圖2 顯微鏡下觀察分離到原生質(zhì)體及原生質(zhì)體活力檢測

2.3 瞬時(shí)表達(dá)轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體

本研究將含有改造過的螢火蟲熒光素酶的載體pBI221通過PEG-Ca2+法轉(zhuǎn)化進(jìn)入小麥的原生質(zhì)體，探討了不同PEG濃度對(duì)小麥原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化效率的影響。結(jié)果（圖3）發(fā)現(xiàn)，25% PEG濃度下小麥原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化效率顯著的高于其他濃度（P<0.01）最高，其次是30%和20%的PEG濃度，10%及 40%的PEG濃度的相對(duì)較低，其中在10%的PEG濃度下，小麥原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化效率最低。

圖3 不同濃度PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化小麥原生質(zhì)體的瞬時(shí)表達(dá)熒光強(qiáng)度

3 討論

原生質(zhì)體可以從植物葉片、葉鞘、葉柄、莖等組織器官中分離出來，由于葉片來源廣泛，葉肉細(xì)胞排列松散等特點(diǎn)，是植物原生質(zhì)體分離的常用材料［14］。本研究在分別取用播種后水培養(yǎng)7 d的小麥幼苗的葉片和葉鞘分離原生質(zhì)體時(shí)，發(fā)現(xiàn)葉片與葉鞘分離出的原生質(zhì)體的產(chǎn)量幾乎相差無幾，但取用幼莖作材料時(shí)，產(chǎn)量顯著低于葉片和葉鞘。最適宜的培養(yǎng)時(shí)間為5-7 d，最佳為7 d，若低于5 d由于材料過于幼嫩不容易控制酶解時(shí)間，同時(shí)分離到的碎片太多不利于后期遺傳轉(zhuǎn)化，即使調(diào)節(jié)酶解液濃度效果也不明顯；超過7 d后，相應(yīng)要增加酶解時(shí)間，可能是葉片幼嫩程度不一致，隨著酶解時(shí)間的延長，先分離出的原生質(zhì)體就會(huì)破碎，產(chǎn)生的碎片也不利于后期遺傳轉(zhuǎn)化。因此，在本研究中，我們選用播種后生長7 d左右的小麥幼苗的葉片和葉鞘作為分離材料時(shí)，得到的原生質(zhì)體的產(chǎn)量最高，質(zhì)量最佳。

酶解法是目前植物原生質(zhì)體分離的主要方法，酶解材料時(shí)，酶液的組成、濃度、滲透壓及酶解時(shí)間等因素對(duì)原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力會(huì)產(chǎn)生顯著的影響。酶液的組合和濃度要隨酶解材料的不同略有差異［15，16］，孫鶴等［17］以10日齡小麥葉片為材料分離原生質(zhì)體，最佳酶液組合為1.5%纖維素酶及0.5%離析酶，酶解5 h后產(chǎn)量達(dá)6×106個(gè)/g·FW。在本研究中，選用7日齡小麥幼苗葉片和葉鞘制備原生質(zhì)體，發(fā)現(xiàn)酶液組合為1.5%纖維素酶及0.75%離析酶，解離3 h后產(chǎn)量就可達(dá)7.2×106個(gè)/g·FW，采用此酶液的組合在縮短了酶解時(shí)間的同時(shí)，增加了原生質(zhì)體的產(chǎn)量；酶解液中滲透壓的調(diào)節(jié)是依賴于不同濃度的甘露醇來實(shí)現(xiàn)的，不適宜的滲透壓會(huì)造成原生質(zhì)體的脹裂或皺縮。在酶液和洗滌液中，廣泛使用的滲透壓調(diào)節(jié)劑濃度約在0.2-0.8 mol/L［18］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用0.4 mol/L甘露醇作為滲透劑有利于小麥葉肉原生質(zhì)體滲透壓的穩(wěn)定，分離的原生質(zhì)體呈飽滿球形，活力較高（圖2-A、C）；酶解時(shí)間是影響原生質(zhì)體分離的另一重要因素，酶解時(shí)間過短，原生質(zhì)體釋放不充分產(chǎn)量太低，時(shí)間過長則導(dǎo)致較早游離出來的原生質(zhì)體破裂。本實(shí)驗(yàn)中酶解2 h后僅有少量原生質(zhì)體游離出來，超過3 h的酶解時(shí)間雖然會(huì)使原生質(zhì)體的產(chǎn)量增加，但細(xì)胞碎片增多，影響原生質(zhì)體活力，不利于后續(xù)融合、轉(zhuǎn)化等實(shí)驗(yàn)。經(jīng)過綜合分析，確定小麥原生質(zhì)體分離最佳的酶解時(shí)間為3 h，此時(shí)分離的原生質(zhì)體產(chǎn)量高、碎片少且均具有較高活性。

除此之外，原生質(zhì)體分離的過程中還需要考慮其他的因素，如酶解液的pH值、離心力、酶解溫度等。酶解液的pH值過低或過高時(shí)，產(chǎn)量都不高，原因是受到酶的活力的影響，纖維素酶的最適pH是5.5-6.0［19］；離析酶有效作用的pH是3.0-7.0［20］，因此，酶解液的pH要同時(shí)使兩種酶的活性達(dá)到最佳。此外，pH值還對(duì)細(xì)胞膜及細(xì)胞保護(hù)系統(tǒng)有較大的影響［18］。本研究從上述兩方面考慮，確定酶液的最適pH值為5.6。離心收集原生質(zhì)體時(shí)所用離心力為100×g（brake為3），離心時(shí)間為5 min較合適，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)離心力低于100 g無法將原生質(zhì)體完全沉淀下來，過大時(shí)會(huì)使沉淀下來的原生質(zhì)體壓實(shí)，后續(xù)無法充分洗滌干凈，且會(huì)造成原生質(zhì)體破碎降低原生質(zhì)體產(chǎn)量。

活性染色法是測定原生質(zhì)體活力的方法之一，其中最常用的是FDA和臺(tái)盼藍(lán)染色。FDA染色，即熒光素雙醋酸酯染色法，因?yàn)镕DA本身不產(chǎn)生熒光，且能自由出入完整的細(xì)胞膜，當(dāng)FDA進(jìn)入活細(xì)胞后，被細(xì)胞內(nèi)的酯酶分解生成熒光素，因此有活力的原生質(zhì)體能夠產(chǎn)生熒光；臺(tái)盼藍(lán)染液可以通過死亡原生質(zhì)體的細(xì)胞膜而使死亡細(xì)胞染成藍(lán)色，但由于染料無法透過活細(xì)胞，因此活細(xì)胞不被著色，另外由于葉綠體的存在，在顯微鏡下看到的是深藍(lán)色，不容易同活細(xì)胞區(qū)分［21］。因此，F(xiàn)DA比臺(tái)盼藍(lán)染色更清晰，且不會(huì)受到葉綠體等內(nèi)含物的干擾，并且適用于不同來源的原生質(zhì)體。

影響原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率的因素有許多，如原生質(zhì)體純度和活力、質(zhì)粒DNA大小和純度、DNA與原生質(zhì)體的比例、孵育時(shí)間及PEG濃度等［17，22］。PEG濃度是影響轉(zhuǎn)化率的最重要因素，不同植物，甚至同種植物不同的供試組織分離到的原生質(zhì)體，其轉(zhuǎn)化所需的PEG濃度都是存在差異的［23］。據(jù)報(bào)道，終濃度為10%-20%的PEG濃度可使擬南芥原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率達(dá)到最佳［3］。有報(bào)道表明，25%的PEG濃度對(duì)于10日齡麥苗分離到的原生質(zhì)轉(zhuǎn)化率是最高的［17］，在本研究中，也發(fā)現(xiàn)25% 的PEG濃度對(duì)于7日齡麥苗分離到的原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化率最高。

4 結(jié)論

綜合原生質(zhì)體產(chǎn)量、活力及轉(zhuǎn)化效率等多方面考慮，確定7日齡小麥麥葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體分離的最佳條件為：酶解液組合為纖維素酶1.5%及離析酶0.75%，酶液中甘露醇濃度為0.4 mol/L，酶解時(shí)間為3 h，原生質(zhì)體的產(chǎn)量可達(dá)7.2×106個(gè)/g·FW，且分離到的原生質(zhì)體呈飽滿球形，淡綠色葉綠體多，清晰均勻分布在原生質(zhì)體中，并含有顆粒狀內(nèi)含物，活力較強(qiáng)，均超過95%。在PEG濃度為25%時(shí)，小麥原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化率是最高的。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

The Optimization of Isolation Method for Mesophyll Protoplast from Common Wheat（Triticum aestivum）Seedlings

XI Hai-xiu AI Ke-jun TONG Shao-ming
（School of Life Sciences，Liaoning Normal University，The Key Laboratory of Plant Biotechnology of Liaoning Province，Dalian 116081）

By orthogonal test，we analyzed the effects of concentrations of cellulose，macerozyme，and mannitiol as well as the time of enzyme digestion on the productivity and vitality during the isolation of protoplast from 7 days of wheat seedling mesophyll. Further，the transient expression technology was employed to analyze the effects of PEG concentration on the transformation efficiency by PEG-Ca2+-mediated transformation of mesophyll. The results showed that the optimal condition for isolating the mesophyll from wheat leaves was：1.5% of cellulase，0.75% of macerozyme，0.4 mol/L mannitol，and 3 h of enzyme digestion；the protoplast yield was 7.2×106cells/g·FW，the vitality was more than 95%. The results from the transient expression technology revealed that transformation efficiency was the highest under 25% PEG.

common wheat；protoplast；isolation；transient expression

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.008

2015-06-28

席海秀，女，碩士研究生，研究方向：植物分子生物學(xué)；E-mail：haixiuxi@yeah.net

佟少明，男，副教授，研究方向：植物分子生物學(xué)；E-mail：tongsm@163.com