莫偉嘉，李　佳，陸會平，馮振博

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，南寧 530021)

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轉(zhuǎn)錄因子Sp3在肝細胞癌中的表達意義*

莫偉嘉，李佳，陸會平，馮振博△

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，南寧 530021)

[摘要]目的研究轉(zhuǎn)錄因子Sp3(Sp3)在肝細胞癌(HCC)發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后中的作用。方法采用Western blot法和RT-PCR法檢測該院49例HCC組織及其癌旁肝組織中Sp3和β-Catenin的表達情況，分析二者在HCC和癌旁肝組織中的表達差異、二者的表達與HCC臨床病理特征的關(guān)系，以及Sp3與預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果Western blot和RT-PCR法的結(jié)果均顯示：(1)Sp3在HCC中的表達高于癌旁肝組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；(2)β-Catenin在HCC中的表達高于癌旁肝組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；(3)Sp3和β-Catenin在HCC中的表達與腫瘤直徑和分級相關(guān)；(4)Sp3和β-Catenin在HCC中的表達呈正相關(guān)(Western blot：r=0.681、P=0.000；RT-PCR：r=0.641，P=0.000)，均與腫瘤大小和分化程度有關(guān)；(5)Sp3高表達的病例預(yù)后較低表達的病例差 (P<0.05)。結(jié)論Sp3在HCC發(fā)生中起促進作用且與腫瘤惡性程度相關(guān)； Wnt通路可能是其參與HCC發(fā)生、發(fā)展的途徑。

[關(guān)鍵詞]癌，肝細胞；肝腫瘤；轉(zhuǎn)錄因子Sp3；β-Catenin

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是我國，尤其是廣西地區(qū)最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)生、發(fā)展是一個多因素、多階段積累的過程，多種基因參與其中。轉(zhuǎn)錄因子Sp3(transcription factor Sp3，Sp3)參與多種基因轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)節(jié)，目前已發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中均存在Sp3的異常表達[1]，部分非腫瘤疾病如腎小球硬化也與Sp3相關(guān)[2]。對于Sp3與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，已有若干研究成果，但關(guān)于Sp3在HCC中的作用目前相關(guān)的研究尚較少。β-Catenin是Wnt信號通路中的關(guān)鍵因子，在通路的關(guān)鍵環(huán)節(jié)調(diào)控c-myc和Cyclin D1等癌基因的表達。研究顯示，Wnt通路參與HCC的發(fā)生[3]，β-Catenin與HCC的高度惡性和浸潤轉(zhuǎn)移有關(guān)。目前，對于Sp3與β-Catenin在HCC中的關(guān)系、Sp3是否通過Wnt通路參與HCC發(fā)生、發(fā)展等問題未見相關(guān)報道。本試驗對Sp3在HCC發(fā)生、發(fā)展中的作用，及其與β-Catenin的關(guān)系進行研究，現(xiàn)報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料選取本院2009年1月至2011年1月新鮮凍存的肝細胞癌及其癌旁肝組織標本49例(梁索型20例，透明細胞型9例，混合細胞型13例，腺樣型7例)；患者年齡25～73歲，中位年齡45歲；男43例，女6例；按分化程度分高分化(1～2級)和低分化(3～4級)兩組(分級標準參照2010版《WHO腫瘤分類與診斷標準》)。并收集腫瘤體積、甲胎蛋白及乙型肝炎表面抗原檢測情況、TNM分期、隨訪情況等資料。所有患者均未進行放療及化療，以確保結(jié)果無其他影響因素。

1.2方法

1.2.1試驗試劑Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Mixer、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)蛋白上樣緩沖液購自美國Thermo公司；兔抗人Sp3多克隆抗體購自美國Bio-Legend公司；兔抗人β-Catenin抗體購自美國Cell Signal Technology公司；羊抗兔IgG(H+L)HRP連接二抗購自美國Santa cruz公司；Western-Blot GAPDH內(nèi)參購自上海康成公司；RIPA裂解液(強)、BCA蛋白濃度測定試劑盒工作盒、發(fā)光劑、苯甲基磺酰氟(PMSF)等購自北京碧云天生物技術(shù)研究所。引物由上海捷瑞公司設(shè)計及合成目的基因Sp3：上游5′-GCT TGC ACC TGT CCC AAC TGT A-3′，下游5′-CTC CAG AAT GCC AAC GCA GA-3′；目的基因β-Catenin：上游5′-GAG TGC TGA AGG TGC TAT CTG TC-3′，下游5′-CTG AAC AAG AGT CCC AAG GAG A-3′；內(nèi)參基因β-actin：上游5′-GCA CCA CAC CTT CTA CAA TGA GC-3′；下游5′-GGA TAG CAC AGC CTG GAT AGC AAC-3′。

1.2.2Western blot法提取總蛋白、加入上樣緩沖液煮沸5 min變性后上樣電泳，100 mA恒流條件下轉(zhuǎn)膜(Sp3 90 min、β-Catenin 120 min、內(nèi)參 60 min)，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，4 ℃孵育一抗(Sp3工作濃度為1.33 μL/mL、β-Catenin工作濃度為1 μL/mL)12 h，TBST洗膜5 min×2次，室溫孵育二抗(二抗工作濃度0.1 μL/mL)1 h，TBST洗膜5 min×2次，滴加發(fā)光劑，柯達膠片曝光顯影，膠片拍照后用Quantity one軟件分析圖像及數(shù)據(jù)。

1.2.3RT-PCR法Trizol提取總RNA后逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以β-actin為內(nèi)參按以下程序進行PCR反應(yīng)：95 ℃預(yù)變性5 min。以95 ℃變性1 min、退火(Sp3和內(nèi)參54 ℃、β-Catenin 56 ℃)30 s、72 ℃延伸1 min為一個循環(huán)，Sp3和β-Catenin分別35、37個循環(huán)；內(nèi)參25個循環(huán)。之后均72 ℃再延伸10 min、4 ℃暫保存。所得產(chǎn)物以18 g/L瓊脂糖凝膠電泳、核酸染料染色，應(yīng)用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)采圖后用Quantity one軟件分析圖像及數(shù)據(jù)。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件處理，對Sp3、β-Catenin在HCC及其癌旁肝組織中表達的差異性、二者表達與HCC臨床病理特征的關(guān)系用χ2檢驗或Fisher′s確切概率法分析；對Sp3和β-Catenin在HCC中表達相關(guān)性用Spearmen等級相關(guān)分析；對Sp3與HCC預(yù)后的關(guān)系用Log-Rank法分析。檢驗水準α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1Sp3表達結(jié)果經(jīng)Western blot法檢測，HCC組織中Sp3的高表達率高于癌旁肝組織[59.18%(29/49)vs.28.57%(14/49),χ2=4.732，P=0.03]，見圖1。Sp3在HCC中的表達與腫瘤直徑和分級相關(guān)(P<0.05)，而與年齡、性別、TNM分期、甲胎蛋白及乙型肝炎表面抗原情況無關(guān)(P>0.05)，見表1、圖2～3。

1:HCC；2：癌旁肝組織。

圖1Sp3在HCC與癌旁肝組織中的表達(Western blot)

經(jīng)RT-PCR法檢測，HCC組織中Sp3的高表達率高于癌旁肝組織[63.27%(31/49)vs.26.53%(13/49)，χ2=13.364，P=0.000]，見圖4。Sp3在HCC中的表達與腫瘤直徑和分級相關(guān)(P<0.05)，而與年齡、性別、TNM分期、甲胎蛋白及乙肝表面抗原情況無關(guān)(P>0.05)，見表2、圖5～6。

1：小體積HCC；2：泳道1對應(yīng)的癌旁肝組織；3：大體積HCC；4：泳道3對應(yīng)的癌旁肝組織。

圖2Sp3在不同體積HCC中的表達(Western blot)

1：低分化HCC；2：泳道1對應(yīng)的癌旁肝組織；3：泳道4對應(yīng)的癌旁肝組織；4：高分化HCC。

圖3　Sp3在不同分化HCC中的表達(Western blot)

AFP：甲胎蛋白；HBsAg：乙型肝炎表面抗原。

兩種方法均顯示Sp3在有肝硬化的癌旁肝組織中的表達高于無明顯病變的癌旁肝組織[Western blot:52.17%(12/23)vs.7.69%(2/26)，χ2=11.832，P=0.001;RT-PCR:47.83%(11/23)vs.7.69%(2/26)，χ2=10.085，P=0.001]，見圖7～8。

1、2：泳道4、5的內(nèi)參；3：Marker；4：癌旁肝組織；5：HCC。

圖4Sp3在HCC與癌旁肝組織中的表達(RT-PCR)

1～4：泳道6～9的內(nèi)參；5：Marker；6：小體積HCC；7：泳道6對應(yīng)的癌旁肝組織；8：大體積HCC；9：泳道8對應(yīng)的癌旁肝組織。

圖5Sp3在不同體積HCC中的表達(RT-PCR)

1～4：泳道6～9的內(nèi)參；5：Marker；6：高分化HCC；7：泳道6對應(yīng)的癌旁肝組織；8：低分化HCC；9：泳道8對應(yīng)的癌旁肝組織。

圖6　Sp3在不同分化HCC中的表達(RT-PCR)

1：HCC；2：硬化癌旁肝組織；3：無硬化癌旁肝組織。

圖7Sp3在無硬化癌旁肝組織與硬化癌旁肝組織中的表達(Western blot)

1～3：泳道5～7內(nèi)參;4：Marker；5：硬化癌旁肝組織；6：無硬化癌旁肝組織；7：HCC組織。

圖8Sp3在無硬化癌旁肝組織與硬化癌旁肝組織中的表達(RT-PCR)

2.2兩種方法檢測Sp3結(jié)果的一致性經(jīng)Spearman等級相關(guān)分析兩種方法檢測Sp3結(jié)果的一致性顯示：兩種方法的檢測結(jié)果呈正相關(guān)(r=0.789，P<0.01)。

2.3β-Catenin表達經(jīng)Western blot法檢測,HCC組織中β-Catenin的高表達率高于癌旁肝組織[51.02%(25/49)vs. 24.49%(12/49)，χ2=7.338，P=0.007]，見圖9。β-Catenin在HCC組織中的表達與腫瘤直徑和分級相關(guān)(P<0.05)，而與年齡、性別、TNM分期、甲胎蛋白及乙肝表面抗原情況無關(guān)(P>0.05)，見表3、圖10～11。

1：HCC；2：癌旁肝組織。

圖9β-Catenin在HCC與癌旁肝組織中的

表達(Western blot)

1：小體積HCC；2：泳道1對應(yīng)的癌旁肝組織；3：大體積HCC；4：泳道3對應(yīng)的癌旁肝組織。

圖10β-Catenin在不同體積HCC中的

表達(Western blot)

1：泳道2對應(yīng)的癌旁肝組織；2：高分化HCC；3：低分化HCC；4：泳道3對應(yīng)的癌旁肝組織。

圖11　β-Catenin在不同分化HCC中的

1～2：泳道4～5的內(nèi)參;3：Marker；4：HCC；5：癌旁肝組織。

圖12β-Catenin在HCC與癌旁肝組織中的

表達(RT-PCR)

經(jīng)RT-PCR法檢測,HCC組織中β-Catenin的高表達率高于癌旁肝組織[53.06%(26/49)vs.14.29%(7/49)，χ2=16.493，P=0.000]，見圖12。β-Catenin在HCC組織中的表達與腫瘤直徑和分級相關(guān)(P<0.05)，而與年齡、性別、TNM分期、甲胎蛋白及乙肝表面抗原情況無關(guān)(P>0.05)，見表4、圖13～14。

1～4：泳道6～9的內(nèi)參；5：Marker；6：小體積HCC；7：泳道6對應(yīng)的癌旁肝組織；8：大體積HCC；9：泳道8對應(yīng)的癌旁肝組織。

圖13β-Catenin在不同體積HCC中的表達

(RT-PCR)

1～4：泳道6～9的內(nèi)參；5：Marker；6：高分化HCC；7：泳道6對應(yīng)的癌旁肝組織；8：低分化HCC；9：泳道8對應(yīng)的癌旁肝組織。

圖14　β-Catenin在不同分化HCC中的

2.4Sp3與β-Catenin相關(guān)性分析兩種方法均顯示：多數(shù)Sp3高表達的病例β-Catenin也高表達。經(jīng)相關(guān)性分析，在HCC組織中二者的表達呈正相關(guān)(Western blot：r=0.681，P=0.000；RT-PCR：r=0.641，P=0.000)。

2.5Sp3與HCC預(yù)后的關(guān)系隨訪時間為28個月，死亡及復(fù)發(fā)均判為終止事件。經(jīng)Western blot法檢測，20例Sp3低表達的病例無病生存時間平均為23.4個月，預(yù)后明顯好于Sp3高表達的病例(此類病例無病生存時間平均為18.4個月)。生存分析顯示預(yù)后差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001)，見圖15。經(jīng)RT-PCR法檢測，18例Sp3低表達的病例無病生存時間平均為23.6個月，預(yù)后明顯好于Sp3高表達的病例(此類病例無病生存時間平均為18.6個月)，生存分析顯示預(yù)后差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001)，見圖16。

1：Sp3高表達的HCC病例；2：Sp3低表達的HCC病例。

圖15生存曲線(Western blot)

1：Sp3高表達的HCC病例；2：Sp3低表達的HCC病例。

圖16生存曲線(RT-PCR)

3討論

Sp3與Sp1均為Sp家族成員，并有最為相似的細胞分布和DNA識別序列，Sp3對Sp1的結(jié)合位點均有較強的結(jié)合能力。Sp1與HCC發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系已被研究證實[4-6]，但對與其同家族的Sp3在HCC發(fā)生、發(fā)展過程中作用的研究則鮮有報道。

本試驗研究以Western blot及RT-PCR兩種方法檢測Sp3在HCC及其癌旁肝組織中的表達情況，發(fā)現(xiàn)Sp3在HCC中的表達高于癌旁肝組織，提示Sp3在HCC的發(fā)生過程中是一促進因子。此外，在大體積、低分化的HCC組織中，Sp3的高表達率增加，因而推測Sp3還能反映腫瘤的惡性程度，Sp3高表達的HCC具有較高的惡性程度。這一推論符合生存分析的結(jié)果：Sp3高表達的HCC病例，預(yù)后較低表達的病例差，出現(xiàn)了更短的平均生存時間和更高的病死/復(fù)發(fā)率。因此，Sp3高表達或許可作為HCC的危險信號，提示高度惡性、預(yù)后不佳。以往有研究報道Sp3高表達與頭頸部腫瘤預(yù)后不良相關(guān)[7]，本研究結(jié)果與以往文獻報道相符。

HCC的發(fā)生是一個多種基因參與、多階段、多因素積累的過程，Shiraha等[8]的研究表明至少有4類基因的變異及其所引起的生物學(xué)變化參與了HCC的發(fā)生，其中之一是促腫瘤生成通路的激活。在各種促腫瘤形成通路中，Wnt是最主要的通路，其在HCC發(fā)生過程中所起的關(guān)鍵作用已被較多研究證實[9-10]。β-Catenin作為Wnt通路參與眾多基因表達調(diào)節(jié)的中心環(huán)節(jié)[11]，是Wnt通路促進HCC發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵因子[12]。因此，β-Catenin及其所在的Wnt通路與HCC的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。本試驗研究以Western blot和RT-PCR兩種方法檢測β-Catenin在HCC及其癌旁肝組織中的表達情況，所得結(jié)果相似，即β-Catenin在HCC組織中的表達高于癌旁肝組織，且在大體積、低分化的HCC組織中，β-Catenin表達進一步增強，再次證實了β-Catenin在HCC發(fā)生中的促進作用，及其與HCC惡性程度相關(guān)。

β-Catenin富含GC序列[13]，而Sp3可以特異地識別和調(diào)控富含GC序列的基因，故Sp3與β-Catenin之間極有可能存在調(diào)控機制。相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，在HCC組織中Sp3與β-Catenin呈正相關(guān)，且二者的表達與HCC臨床病理特征的關(guān)系也一致，提示W(wǎng)nt通路可能是Sp3促進HCC發(fā)生、發(fā)展的機制之一。目前，有少量關(guān)于Sp家族蛋白與Wnt通路關(guān)系的研究，如Pathi等[14]的研究認為，在大腸癌中Sp家族蛋白Sp1、Sp3及Sp4對β-Catenin有調(diào)控作用。而另有研究報道，Sp家族蛋白在Wnt/β-Catenin通路中是一關(guān)鍵作用因子[15]。本試驗所顯示出的Sp3與β-Catenin在HCC組織中的相關(guān)性，可作為Sp3參與HCC發(fā)生、發(fā)展機制及Sp3與Wnt/β-Catenin通路關(guān)系的初步探討。

HCC進展較快，且起病隱匿難以早期發(fā)現(xiàn)，手術(shù)治療效果普遍不理想[16]。據(jù)文獻報道HCC根治性切除后5年復(fù)發(fā)率仍高達70%，且復(fù)發(fā)時多數(shù)患者已發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移[16]。因此，應(yīng)用更多的早期診斷手段、確立更多的早期診斷指標以盡可能的早診早治是提高HCC療效的關(guān)鍵。本試驗發(fā)現(xiàn)，在存在硬化病變的癌旁肝組織中，Sp3表達高于無明顯病變的癌旁肝組織，鑒于肝硬化是HCC公認的高危因素和癌前病變[17]，可將Sp3視為一個潛在的HCC早期診斷指標進行相關(guān)研究。

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Expression of transcription factor Sp3 in hepatocellular carcinoma*

MoWeijia,LiJia,LuHuiping,FengZhenbo△

(DepartmentofPathology,theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning,GuangxiZhuangAutonomousRegion530021，China)

[Abstract]ObjectiveTo research the expression of Sp3 and β-Catenin in HCC and study the assessable factors of them for prognosis in patients with hepatocellular carcinoma.MethodsWestern blot and RT-PCR methods were used to detect the expression of Sp3 and β-Catenin in HCC and the liver tissue beside tumor among 49 cases.We analyzed the difference of these two indexes expressed in HCC and the liver tissue beside tumor.Then we detected the correlation between these two indexes and the character of clinic pathology,and researched the correlation between Sp3 and the prognosis of HCC.ResultsThe high expression rate of Sp3 in HCC was higher than that of liver tissue beside tumor(P<0.05) according to Western blot and RT-PCR,the same to β-Catenin(P<0.05).Expression of Sp3 and β-Catenin were both related with size of tumor and degree of differentiation.Positive correlation existed between these two indexes according to Western blot method(r=0.681，P=0.000) and RT-PCR method(r=0.641,P=0.000).The prognosis of cases with high expression of Sp3 was poorer than the low expression cases(P<0.05).ConclusionSp3 plays a promoter role in occurrence of HCC,which is correlated with the grade malignancy of HCC.Sp3 might participated in occurrence and development of HCC via the Wnt pathway.

[Key words]carcinoma,hepato cellular;liver neoplasms;transcription factor Sp3;β-Catenin

doi:論著·臨床研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.03.022

*基金項目：廣西區(qū)域性高發(fā)惡性腫瘤規(guī)范化診治關(guān)鍵技術(shù)研究及應(yīng)用示范(桂科攻1298003-2-5)。

作者簡介：莫偉嘉(1985-)，住院醫(yī)師，碩士，主要從事肝細胞癌發(fā)生、發(fā)展機制的研究?！魍ㄓ嵶髡?，E-mail:zhenbofeng@yahoo.com.cn。

[中圖分類號]R735.7

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)03-0356-05

(收稿日期：2015-08-08修回日期：2015-10-16)