鄧旭鋒,鄭　鴻,周　東,劉權(quán)興,丁　艷,徐文岳▲,戴紀(jì)剛△

(1.第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院胸外科,重慶 400037;2.第三軍醫(yī)大學(xué)病原生物教研室,重慶 400038)

?

瘧原蟲遺傳減毒子孢子誘導(dǎo)抗肺癌免疫的初步研究*

鄧旭鋒1,鄭鴻2,周東1,劉權(quán)興1,丁艷2,徐文岳2▲,戴紀(jì)剛1△

(1.第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院胸外科,重慶 400037;2.第三軍醫(yī)大學(xué)病原生物教研室,重慶 400038)

[摘要]目的初步探討瘧原蟲遺傳減毒子孢子能否誘導(dǎo)抗肺癌免疫作用，為肺癌疫苗的研究提供新的思路。方法實(shí)驗(yàn)分為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組尾靜脈注射遺傳減毒子孢子進(jìn)行免疫C57BL/6J小鼠，對(duì)照組注射磷酸緩沖鹽溶液(PBS)；14 d后用Lewis肺癌細(xì)胞(LLC)皮下接種，待腫瘤長(zhǎng)出后用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤大小；腫瘤組織免疫組化對(duì)比腫瘤增殖、凋亡、血管生成情況。結(jié)果兩組小鼠的腫瘤生長(zhǎng)有差異，瘧原蟲遺傳減毒子孢子能抑制腫瘤的增殖、血管生成、促進(jìn)凋亡。結(jié)論遺傳減毒子孢子可能是一種新的治療策略或能成為一種有效的載體介導(dǎo)肺癌的免疫治療。

[關(guān)鍵詞]肺腫瘤；瘧原蟲；遺傳減毒子孢子；Lewis肺癌細(xì)胞

肺癌仍然是癌癥相關(guān)死亡的首要原因，在2012年全球肺癌死亡人數(shù)占癌癥相關(guān)死亡人數(shù)的19.4%[1]。肺癌的治療方法主要有手術(shù)、化療、放療等，但近年來(lái)興起的免疫療法則主要通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答抗腫瘤，具有敏感性、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，被認(rèn)為最有希望的肺癌治療策略[2-4]。盡管目前的治療方法已經(jīng)得到了提高，但是肺癌的預(yù)后還是不理想，所以探索新的治療方法是非常有必要的。大量的研究證實(shí)，CD8+T淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答機(jī)體的免疫系統(tǒng)監(jiān)視和抑制腫瘤的最主要效應(yīng)機(jī)制[5-6]。與抗腫瘤和抗病毒感染相一致，機(jī)體也是通過(guò)誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答清除胞內(nèi)寄生的原蟲。另外，有些抗寄生蟲的藥物也具有抗腫瘤作用，提示抗腫瘤的研究有可能從抗寄生蟲研究中得到啟發(fā)。目前已有文獻(xiàn)證實(shí)了寄生蟲抗腫瘤[7-10]的研究。

遺傳減毒子孢子fabb/f-/- 265BY是一種經(jīng)遺傳操縱方式特異敲除瘧原蟲肝期發(fā)育的必要基因fabb/f，得到能入侵肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，但發(fā)育停滯在晚期的子孢子[11]。遺傳減毒子孢子能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈CD8+T淋巴細(xì)胞反應(yīng)，有效地抵御子孢子的感染和清除感染肝細(xì)胞的瘧原蟲。紅內(nèi)期瘧原蟲對(duì)肺腫瘤的生長(zhǎng)存在著一定的抑制作用[12]，此外在對(duì)弓形蟲及錐蟲的抗腫瘤研究中發(fā)現(xiàn)這類寄生蟲可能與腫瘤存在著交叉抗原[13]，而寄生蟲的感染誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答也可能對(duì)腫瘤產(chǎn)生非特異性殺傷。因此本研究意在探討遺傳減毒子孢子fabb/f-/- 265BY的免疫能否誘導(dǎo)小鼠的抗腫瘤免疫作用。

1材料與方法

1.1小鼠及蟲株C57BL/6J小鼠購(gòu)于第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，LLC細(xì)胞株購(gòu)于上海中科院細(xì)胞庫(kù)，約氏瘧原蟲fabb/f-/-265BY株的遺傳減毒子孢子由第三軍醫(yī)大學(xué)病原生物學(xué)教研室提供。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1遺傳減毒子孢子免疫小鼠20只C57BL/6J小鼠分為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組，將實(shí)驗(yàn)室提供的遺傳減毒子孢子稀釋為每毫升150 000條的濃度，實(shí)驗(yàn)組小鼠尾靜脈注射上述濃度的遺傳減毒子孢子每只200 μL，理論上使每只小鼠被30 000條遺傳減毒子孢子免疫；對(duì)照組用相同的方法尾靜脈注射PBS溶液200 μL/只。為了驗(yàn)證遺傳減毒子孢子是否減毒成功，實(shí)驗(yàn)組小鼠每隔2天尾靜脈血涂片觀察，記錄原蟲血癥。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2流式監(jiān)測(cè)外周血CD8+T細(xì)胞兩組小鼠從免疫開(kāi)始每隔2天眼球取血做流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)，每組用去4只小鼠。取500 μL外周血加入到含有1 mL PBS的EP管中，12 000 r/min離心10 s,去上清液。沉淀加入1 mL紅細(xì)胞裂解液重懸，冰上作用2 min后加入到盛有2 mL PBS的5 mL EP管中1 600 r/min離心5 min，用100 μL FACS流式洗液重懸(收集PBMC,計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量需要達(dá)到1 ×106個(gè))。加入1.25 μL(0.25 μg/test anti-mouseCD8a PreCP-Cy5.5)和2 μL(1 μg/test anti-mouseCD11a FITC M/17/4)混勻，避光4 ℃孵育35 min。加入1 mL 4 ℃ FACS流式洗液 1 600 r/min離心5 min 棄上清液，加入200 μL的FACS流式緩沖液重懸沉淀，進(jìn)行FACS檢測(cè)。

1.2.3LLC的培養(yǎng)及接種取出凍存細(xì)胞，快速在37 ℃水浴鍋中解凍。超凈臺(tái)內(nèi)將其轉(zhuǎn)移到10 mL的玻璃離心管中，加入3 mL含血清的DMEM，輕柔吹打混勻，1 000 r/min離心5 min洗滌1次，棄上清液。加入1 mL培養(yǎng)基重懸，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)。待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底部，吸去培養(yǎng)基，加入3 mL PBS輕輕搖動(dòng)進(jìn)行洗滌，然后吸去PBS，加入3 mL胰酶進(jìn)行消化。當(dāng)瓶底出現(xiàn)毛玻璃樣結(jié)構(gòu)時(shí)，吸去胰酶液，加入PBS，輕柔吹打成單個(gè)細(xì)胞后，顯微鏡下計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。將細(xì)胞濃度調(diào)整為5×105/mL 的細(xì)胞懸液,分別以每只200 μL的計(jì)量皮下接種實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組小鼠右側(cè)腹股溝。

1.2.4腫瘤大小測(cè)量接種LLC細(xì)胞后每天觀察每只小鼠皮下成瘤情況。發(fā)現(xiàn)腫瘤每隔2天用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的最大直徑a及最短橫徑b(單位為mm)，用公式a*b2/2計(jì)算腫瘤體積。

1.2.5組化檢測(cè)凋亡用10 mL 4%的多聚甲醛固定小鼠腫瘤標(biāo)本，送第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室做石蠟切片。Ki-67、CD31、Tunel凋亡檢測(cè)的具體操作步驟參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

2結(jié)果

2.1血涂片檢查瘧原蟲遺傳減毒子孢子免疫小鼠是安全可靠的。見(jiàn)圖1、2。

圖1　小鼠尾靜脈血涂片

圖2　免疫后每隔2天記錄的原蟲血癥

2.2腫瘤體積、生存曲線皮下接種第7天發(fā)現(xiàn)對(duì)照組小鼠出現(xiàn)腫瘤，第11天實(shí)驗(yàn)組小鼠出現(xiàn)腫瘤，兩組小鼠的腫瘤體積在第15、17、19、21、23天差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.020、0.006、0.004、0.010、0.050)，見(jiàn)圖3。第35天對(duì)照組小鼠出現(xiàn)死亡，第60天6只小鼠全部死亡；而實(shí)驗(yàn)組小鼠第60天死亡2只存活4只，兩組小鼠的生存時(shí)間有差異(P=0.041)，見(jiàn)圖4。小鼠的腫瘤稱質(zhì)量發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.001)，見(jiàn)圖5。

圖3　小鼠腫瘤體積生長(zhǎng)情況

圖4　生存曲線

圖5　小鼠腫瘤質(zhì)量

2.3流式檢測(cè)外周血CD8+T實(shí)驗(yàn)組CD8+T淋巴細(xì)胞為0.640±0.170多于對(duì)照組的0.289±0.150(P=0.004)。見(jiàn)圖6。

圖6　流式檢測(cè)外周血

2.4腫瘤組織免疫組化本研究對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠皮下腫瘤組織的凋亡情況及血管生成進(jìn)行了監(jiān)測(cè)。Tunel染色電鏡下發(fā)現(xiàn)染色質(zhì)濃縮、邊緣化，核膜裂解，染色質(zhì)分割成塊狀著色比對(duì)照組深；Ki-67提示對(duì)照組染色較實(shí)驗(yàn)組深，說(shuō)明對(duì)照組細(xì)胞增殖比實(shí)驗(yàn)組強(qiáng)；CD31顯示對(duì)照組有較多的血管生成。見(jiàn)圖7。

圖7　腫瘤組織免疫組化(×200)

3討論

瘧疾是世界上危害最為嚴(yán)重的三大傳染病之一，其病原體是瘧原蟲。瘧原蟲是由按蚊叮咬傳播的，其生活史包括在蚊體內(nèi)的發(fā)育(蚊期)及在人體肝細(xì)胞內(nèi)的發(fā)育(紅外期)和在紅細(xì)胞內(nèi)的發(fā)育(紅內(nèi)期)。遺傳減毒子孢子是一種經(jīng)遺傳操縱特異敲除瘧原蟲肝期發(fā)育成熟的必要基因的子孢子[11]，具備特異入侵肝細(xì)胞的能力，但不能在肝細(xì)胞內(nèi)進(jìn)一步發(fā)育。遺傳減毒子孢子免疫后，能在入侵肝細(xì)胞的為數(shù)非常少，但卻誘導(dǎo)肝臟產(chǎn)生持久、強(qiáng)烈的抗子孢子表面主要蛋白環(huán)子孢子蛋白細(xì)胞反應(yīng)，能有效地抵御子孢子的感染和清除感染肝細(xì)胞的瘧原蟲[14]；且遺傳減毒子孢子不會(huì)引起瘧原蟲的潛在感染，安全性好。

腫瘤會(huì)干預(yù)人體的免疫功能和妨礙其發(fā)展[15]。但文獻(xiàn)報(bào)道寄生蟲感染可以抑制腫瘤生長(zhǎng)已經(jīng)被很好地證實(shí)了[16]。在這個(gè)研究中，作者想驗(yàn)證用遺傳減毒子孢子免疫后，再皮下接種LLC這個(gè)模型是否可以抗腫瘤。結(jié)果發(fā)現(xiàn)瘧原蟲遺傳減毒子孢子可以抑制LLC的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)小鼠的生存率。免疫組化進(jìn)一步分析腫瘤組織來(lái)自用遺傳減毒子孢子免疫組小鼠提示腫瘤組織的血管生成受到抑制、細(xì)胞增殖數(shù)量是減少、細(xì)胞凋亡比例增加。另外瘧原蟲遺傳減毒子孢子免疫的小鼠外周血CD8+T細(xì)胞比例明顯增高。這說(shuō)明瘧原蟲遺傳減毒子孢子誘導(dǎo)免疫組小鼠的適應(yīng)性免疫，從而誘導(dǎo)抗腫瘤效果。

肺癌是重要的引起癌癥相關(guān)死亡的腫瘤。免疫治療是近年來(lái)興起的治療腫瘤的方法，被認(rèn)為是一種有效治療肺癌的新的策略。免疫治療就是用特異的或者非特異的免疫原刺激宿主以達(dá)到放大宿主低下的免疫力從而殺傷腫瘤細(xì)胞。傳統(tǒng)免疫輔助療法，如卡介苗(BCG)、白喉毒素等可以誘導(dǎo)大量免疫炎癥細(xì)胞，有效治療一些腫瘤[17]。然而誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)是弱的、短暫的、不會(huì)形成免疫記憶。因此，非特異免疫治療的優(yōu)點(diǎn)在肺癌的治療中是不清楚的，無(wú)論是在臨床前還是臨床中。遺傳減毒子孢子誘導(dǎo)大量的CD8+T細(xì)胞抗腫瘤細(xì)胞。很明顯，遺傳減毒子孢子不僅誘導(dǎo)一個(gè)非特異性的免疫，而且還能誘導(dǎo)一個(gè)腫瘤特異性的免疫應(yīng)答。另外遺傳減毒子孢子還能產(chǎn)生有效的、長(zhǎng)久的系統(tǒng)抗腫瘤免疫。

遺傳減毒子孢子免疫后可以激發(fā)宿主的免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞的多克隆活化、大量增殖、分化，通過(guò)接觸寄生蟲相關(guān)抗原或者宿主自身釋放的抗原在免疫遺傳減毒子孢子后[18]?；蛟S就是通過(guò)這樣的機(jī)制加強(qiáng)了宿主的免疫監(jiān)視從而抗肺癌作用。

此研究有兩個(gè)優(yōu)點(diǎn)，一是遺傳減毒子孢子雖然具備特異入侵肝細(xì)胞的能力，但不能在肝細(xì)胞內(nèi)進(jìn)一步發(fā)育，不會(huì)導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)原蟲血癥。二是由于敲除約氏瘧原蟲By265株的Fabb/f基因，所以瘧原蟲肝期子孢子的發(fā)育就會(huì)停止在晚期，此期的子孢子能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生大量的CD8+T細(xì)胞。作者報(bào)道瘧原蟲遺傳減毒子孢子抑制LLC細(xì)胞生長(zhǎng)通過(guò)誘導(dǎo)機(jī)體的適應(yīng)性免疫反應(yīng)，主要是想提供一個(gè)可為有效肺癌亞單位疫苗的設(shè)計(jì)新思路。

已經(jīng)有許多關(guān)于寄生蟲抗腫瘤在人或者動(dòng)物模型中的科學(xué)證據(jù)，也有證據(jù)表明寄生蟲抗腫瘤效應(yīng)是其增強(qiáng)了宿主免疫力。因此，寄生蟲抗原或許可以作為腫瘤免疫療法的候選者在將來(lái)的研究中。盡管如此，寄生蟲與腫瘤的關(guān)系還是存在爭(zhēng)議。但是相信寄生蟲的研究將會(huì)成為一個(gè)新的領(lǐng)域在以后的腫瘤研究中。在接下來(lái)的研究中作者將重點(diǎn)研究遺傳減毒子孢子抗腫瘤的機(jī)制。

參考文獻(xiàn)

[1]Ferlay J,Soerjomataram I,Dikshit R,et al.Cancer incidence and mortality worldwide:Sources,methods and major patterns in GLOBOCAN 2012[J].Int J Cancer,2015,136(5):E359-386.

[2]Gridelli C,Rossi A,Maione P,et al.Vaccines for the treatment of non-small cell lung cancer:a renewed anticancer strategy[J].Oncologist,2009,14(9):909-920.

[3]Kakimi K,Nakajima J,Wada H.Active specific immunotherapy and cell-transfer therapy for the treatment of non-small cell lung cancer[J].Lung Cancer J Iaslc,2009,65(1):1-8.

[4]Kelly RJ,Gulley JL,Giaccone G.Targeting the immune system in non-small-cell lung cancer:bridging the gap between promising concept and therapeutic reality[J].Clin Lung Cancer,2010,11(4):228-237.

[5]Senovilla L,Vitale I,Martins I,et al.An immunosurveillance mechanism controls cancer cell ploidy[J].Science,2012,337(6102):1678-1684.

[6]MatsushitaH,VeselyMD,KoboldtDC,etal.CancerexomeanalysisrevealsaT-cell-dependent

mechanism of cancer immunoediting[J].Nature,2012,482(7385):400-404.

[7]Kallinikova VD,Borisova EN,Pakhorukova LV,et al.Immunization against Trypanosoma cruzi and tumor growth in mice[J].Med Parazitol (Mosk),2006,30(4):9-12.

[8]Darani HY,Shirzad H,Mansoori F,et al.Effects of Toxoplasma gondii and Toxocara canis antigens on WEHI-164 fibrosarcoma growth in a mouse model[J].Korean J Parasitol,2009,47(2):175-177.

[9]Miyahara K,Yokoo N,Sakurai H,et al.Antitumor activity of Toxoplasma lysate antigen against methylcholanthrene-induced tumor-bearing rats[J].J Vet Med Sci,1992,54(2):221-228.

[10]Chen L,He Z,Qin L,et al.Antitumor effect of malaria parasite infection in a murine Lewis lung cancer model through induction of innate and adaptive immunity[J].PLoS One,2011,6(9):e24407.

[11]Vaughan AM,Wang R,Kappe SH.Genetically engineered,attenuated whole-cell vaccine approaches for malaria[J].Hum Vaccin,2010,6(1):107-113.

[12]Chen L,He Z,Qin L,et al.Antitumor effect of malaria parasite infection in a murine Lewis lung cancer model through induction of innate and adaptive immunity[J].PLoS One,2011,6(9):e24407.

[13]Zenina AV,Kravtsov EG,Tsetsegsaikhan B,et al.The study of immunological component in antitumor effect of Trypanosoma cruzi[J].Bull Exp Biol Med,2008,145(3):352-354.

[14]Seder RA,Chang LJ,Enama ME,et al.Protection against malaria by intravenous immunization with a nonreplicating sporozoite vaccine[J].Science,2013,341(6152):1359-1365.

[15]Blattman JN,Greenberg PD.Cancer immunotherapy:a treatment for the masses[J].Science,2004,305(5681):200-205.

[16]Hibbs JJ,Lambert LJ,Remington JS.Resistance to murine tumors conferred by chronic infection with intracellular protozoa,Toxoplasma gondii and Besnoitia jellisoni[J].J Infect Dis,1971,124(6):587-592.

[17]Van den Heuvel MM,Burgers SA,van Zandwijk N.Immunotherapy in non-small-cell lung carcinoma:from inflammation to vaccination[J].Clin Lung Cancer,2009,10(2):99-105.

[18]Cockburn IA,Zavala F.T cell memory in malaria[J].Curr Opin Immunol,2007,19(4):424-429.

Antitumor effect of malaria genetically attenuated sporozoites infection in a murine lewis lung cancer model*

Deng Xufeng1,Zheng Hong2,Zhou Dong1,Liu Quanxing1,Ding Yan2,Xu Wenyue2▲,Dai Jigang1△

(1.Department of Thoracic Surgery,Xinqiao Hospital,Third Military Medical University,Chongqing 400037,China;2.Department of Pathogenic Biology,Third Military Medical University,Chongqing 400038,China)

[Abstract]ObjectiveTo learn whether plasmodium genetic attenuated sporozoites (GAS) can induce immunity against lung cancer,in order to provide new ideas for the study of lung cancer vaccine.MethodsTher study was divided into two groups respectively,experimental group received intravenous injection of genetically attenuated sporozoites to immunize C57BL/6J mice and control group injection of phosphate buffer solution (PBS);after 14 days,we subcutaneously inoculated lewis lung cancer (LLC) cells,calipers was used to measure tumor size.Immunohistochemical staining was detected tumor proliferation,apoptosis,and angiogenesis.ResultsThere was statistically significant in tumor size.Immunohistochemical staining revealed that attenuated sporozoites infection inhibited LLC eslls proliferation,angiogenesis,apoptosis.ConclusionThe malaria attenuated sporozoites may provide a novel strategy or therapeutic vaccine vector for anti-lung cancer immune-based therapy.

[Key words]lung neoplasms;malaria;genetically attenuated sporozoites;lewis lung cancer

doi:·論著·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.11.001

* 基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81172238,81472188)。

作者簡(jiǎn)介：鄧旭鋒(1988-)，碩士，主要從事抗肺癌基礎(chǔ)研究?！ㄓ嵶髡?，E-mail:xuwenyue@gmail.com?！魍ㄓ嵶髡?，E-mail:691057831@qq.com。

[中圖分類號(hào)]R734.2

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1671-8348(2016)11-1441-03

(收稿日期：2015-10-28修回日期：2016-01-03)