不同劑量rhEPO對新型支氣管肺發(fā)育不良大鼠肺eNOS和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響*

王冰冰，張　華

(桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院新生兒科，廣西桂林 541004)

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不同劑量rhEPO對新型支氣管肺發(fā)育不良大鼠肺eNOS和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響*

王冰冰，張華△

(桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院新生兒科，廣西桂林 541004)

[摘要]目的觀察使用不同治療劑量的重組人促紅細(xì)胞生成素(rhEPO)對SD新生幼鼠的新型支氣管肺發(fā)育不良(BPD)模型中內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)、Bcl-2在肺組織的表達(dá)水平變化的影響，并找出合適的給藥時間及使用劑量，旨在探討其對新型BPD的保護(hù)作用。方法利用脂多糖(LPS)和持續(xù)高氧制備新型BPD模型。選取未作任何處理的正常新生幼鼠18只作為空氣對照組，然后將90只新生BPD模型幼鼠分為生理鹽水對照組(A組)、rhEPO800組(B組)、rhEPO1000組(C組)、rhEPO1200組(D組)、rhEPO1400組(E組)，各18只，在給藥后第1、7、14天從各組抽取6只處死并取下肺組織于液氮保存。采用RT-PCR及Western blot 法檢測SD新生幼鼠肺組織中eNOS、Bcl-2蛋白及mRNA水平的表達(dá)情況。結(jié)果A組中Bcl-2蛋白及mRNA表達(dá)水平比空氣對照組明顯降低，而eNOS的表達(dá)水平明顯升高；B、C、D、E組與A組相比，隨著rhEPO濃度的升高，Bcl-2蛋白和mRNA的表達(dá)水平逐漸升高，而eNOS的表達(dá)量逐漸降低，E組中的表達(dá)變化最為明顯，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論rhEPO對新型BPD具有一定的治療作用，而且連續(xù)使用1 400 IU/kg rhEPO 14 d，治療效果最好。

[關(guān)鍵詞]重組人促紅細(xì)胞生成素；支氣管肺發(fā)育不良；Bcl-2；內(nèi)皮型一氧化氮合酶；療效；劑量

在早產(chǎn)兒呼吸系統(tǒng)疾病中，支氣管肺發(fā)育不良(bronchopulmonary dysplasia,BDP)是常見病之一，有研究發(fā)現(xiàn)其與宮內(nèi)炎性感染[1-3]及生后高氧輔助通氣等原因有關(guān)，存活患兒常會出現(xiàn)反復(fù)的呼吸道感染，嚴(yán)重影響患兒的生存質(zhì)量。促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin,EPO)被認(rèn)為是與促進(jìn)骨髓組織造血功能有關(guān)，同時還具有抑制凋亡、促進(jìn)損傷組織的修復(fù)等作用[4]。本實(shí)驗(yàn)擬探討在不同濃度rhEPO的干預(yù)下，生前宮內(nèi)炎性感染，生后又高氧暴露的新生SD幼鼠肺組織中內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)和Bcl-2蛋白和mRNA表達(dá)的影響。并找出合適的給藥時間及劑量，為能夠在臨床上應(yīng)用rhEPO防治BPD提供理論及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，進(jìn)一步為BPD臨床防治開辟新思路。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料Spraque-Dawley(SD)雌鼠60只(200～250 g),雄鼠30只(250～300 g)，購自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心(合格證號:SCXK桂2009-0002)；rhEPO購自協(xié)和發(fā)酵麒麟株式會社，脂多糖(LPS)購自美國Sigma公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天公司，WIP裂解液購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(碧云天公司)，eNOS一抗兔抗(Affinity公司)，Bcl-2一抗兔抗、β-actin一抗鼠抗(博士德生物工程有限公司)，二抗兔抗及鼠抗購自中杉金橋，β-actin、Bcl-2、eNOS引物購自生工生物工程(上海)股份有限公司，總RNA提取試劑盒、RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、cDNA擴(kuò)增試劑盒均購自康為世紀(jì)公司，微量加樣器，鈉石灰，無水氯化鈣。引物序列如下：β-actin上游引物5′-GTC CCT GTA TGC CTC TGG TC-3′，下游引物5′-ACC GCT CAT TGC CGA TAG T-3′(344 bp)；Bcl-2上游引物5′-TTT CTC CTG GCT GTC TCT GAA-3′，下游引物5′-TGT GTG TGT GTG TGT TCT GCT-3′(217 bp)；eNOS上游引物5′-AGA CGG ACC CAA GTT TCC TC-3′，下游引物5′-TCC CGA GCA TCA AAT ACC TG-3′(411 bp)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1模型制備使用隨機(jī)數(shù)字表法將雌雄鼠按2∶1合籠交配，第2天早晨觀察雌鼠陰道口處的陰栓或用棉棒蘸取雌鼠陰道分泌物涂片，鏡檢觀察。如觀察到精子，把該日記為妊娠第1天。在孕鼠懷孕的70%胎齡時，即第15天，注射10%水合氯醛(0.3 mL/kg)麻醉，沿腹中線處切開，將5 μL/孕囊的LPS(30 ng/mL)注射到每1個孕囊內(nèi)。待新生幼鼠產(chǎn)出后，將其隨機(jī)分為以下5組，每組18只。生理鹽水對照組(A組)、rhEPO800組(B組)、rhEPO1000組(C組)、rhEPO1200組(D組)、rhEPO1400組(E組)；將新生幼鼠置于氧濃度維持在60%的高氧艙中，并放置無水氯化鈣和鈉石灰吸收CO2及H2O，以高氧暴露為第1天，按隨機(jī)數(shù)字表法分組后，隔天分別由背部皮下注射相應(yīng)的rhEPO或生理鹽水。每天開箱2 h，每日更換墊料及與正常組調(diào)換母鼠，保持環(huán)境干燥清潔，減少幼鼠死亡率。空氣對照組18只，從未做任何處理母鼠所產(chǎn)的新生幼鼠中隨機(jī)抽取。本實(shí)驗(yàn)的造模方法參考的是本課題組前期的實(shí)驗(yàn)方法[5]。

1.2.2標(biāo)本采集分別在實(shí)驗(yàn)的第1、7、14天末每組選取6只，水合氯醛麻醉后，迅速開胸取下肺組織置于2 mL組織管里，液氮速凍后放入-80 ℃冰箱保存，已備下一步實(shí)驗(yàn)使用。

1.2.3RT-PCR檢測Bcl-2、eNOS mRNA的表達(dá)使用180 ℃高溫干烤6 h后冷卻至室溫的研缽，在液氮低溫環(huán)境下將肺組織研磨為淡粉色粉末，轉(zhuǎn)移至提前備好的含有1 mL RNA裂解液的1.5 mL EP管中，根據(jù)所購買的提取RNA試劑盒說明書步驟操作提出總RNA。觀察RNA 28 s、18 s的表達(dá)，檢測總RNA的完整性，根據(jù)生物分光光度計(jì)測的總RNA濃度，配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，獲取cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)(eNOS條件：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s,60.1℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,35個循環(huán)，上樣量10 μL；Bcl-2條件：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s,57.2 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,32個循環(huán)，上樣量5 μL。使用launch SensiAnsys軟件測定條帶的光密度，重復(fù)以上操作3次。

1.2.4Bcl-2和eNOS蛋白Western blot半定量檢測用研缽把肺組織在液氮低溫下磨碎， 加入含有WIP裂解液和PMSF的EP管中，充分裂解離心后，提取含蛋白的上清液，于-80 ℃保存，分裝少量用于測定蛋白濃度。根據(jù)所得的數(shù)據(jù)配制等體積、等質(zhì)量、等密度的上樣品，根據(jù)Bcl-2和eNOS蛋白的分子量配制相應(yīng)的聚丙烯酰胺凝膠，分別使用半干式和濕式電轉(zhuǎn)，將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上，室溫下封閉液(含5%脫脂奶粉的TBST)封閉90 min，孵相對應(yīng)的Bcl-2一抗(1∶200稀釋)和eNOS一抗(1∶250稀釋)，4 ℃搖床過夜，TBST漂洗3次，每次10 min，然后孵兔抗按1∶5 000稀釋,90 min后漂洗3次后，滴加發(fā)光液，使用BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)拍照，曝光時間10～30 s，拍攝圖片，使用launch SensiAnsys軟件測取灰度值分析，每份組織至少重復(fù)4次，用β-actin作內(nèi)參以示比較。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)使用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。該實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為計(jì)量資料，組間數(shù)據(jù)采用單因素ANOVA方差分析，使用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行組內(nèi)兩兩比較，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1RT-PCR檢測Bcl-2、eNOS mRNA的表達(dá)新生幼鼠肺組織中β-actin 、Bcl-2和eNOS PCR引物擴(kuò)增產(chǎn)物長度分別為344、217和411 bp，與引物設(shè)計(jì)相符，見圖1、2。在第1、7、14天A組與空氣對照組比較，Bcl-2的mRNA表達(dá)量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；D、E組與A組比較，Bcl-2的mRNA表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在第7天，C組Bcl-2的mRNA表達(dá)量高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在第1、7、14天，A組與其他組相比，eNOS的mRNA表達(dá)量均上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在第1、7天，E組與B、C、D組相比，eNOS的mRNA表達(dá)量均低于其他組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在第7天，B組與C、D兩組相比，eNOS的mRNA表達(dá)量均高于其他組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3、4。

1：DNA Marker；2：A組；3：空氣對照組；4：B組；5：C組；6：D組；7：E組。

圖1各組肺組織eNOS mRNA的表達(dá)

1：DNA Marker；2：A組；3：空氣對照組；4：B組；5：C組；6：D組；7：E組。

圖2各組肺組織Bcl-2 mRNA的表達(dá)

2.2Bcl-2和eNOS蛋白表達(dá)新生幼鼠肺組織中Bcl-2、eNOS、β-actin蛋白相對分子質(zhì)量為26×103、140×103、43×103，見圖5。在第1、7、14天，A組與空氣對照組比較，Bcl-2的表達(dá)明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在第7天，E組Bcl-2的蛋白表達(dá)量均高于B、C、D組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；D組與B組相比，Bcl-2的蛋白表達(dá)量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在第14天E組Bcl-2的蛋白表達(dá)量均高于A、B、C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在第1、7、14天，A組與空氣對照組比較，eNOS的蛋白表達(dá)量明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在第1天，E組與A組相比，eNOS的蛋白表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在第7天，E組與A、B、C組相比，eNOS的蛋白表達(dá)均低于其他兩組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；D組與A組、B組相比，C組與A組、B組相比，eNOS的蛋白表達(dá)量均低于其他2組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)；在第14天，A組與B、C、D、E組相比，eNOS的蛋白表達(dá)水平均高于其他4組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而E組和B組相比，eNOS的蛋白表達(dá)量低于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖6、7。

*：P<0.05，與A組比較。

圖3各組肺組織中Bcl-2 mRNA的表達(dá)

*：P<0.05，與A組比較；▲：P<0.05，與B組比較；△：P<0.05，與E組比較。

圖4各組肺組織中eNOS mRNA的表達(dá)

1：A組；2：空氣對照組；3：B組；4：C組；5：D組；6：E組。

圖5各組肺組織eNOS和Bcl-2的蛋白表達(dá)

*：P<0.05，與A組比較；▲：P<0.05，與B組比較；△：P<0.05，與E組比較。

圖6各組肺組織中Bcl-2蛋白的表達(dá)

*：P<0.05，與A組比較；▲：P<0.05，與B組比較；△：P<0.05，與E組比較。

圖7各組肺組織中eNOS蛋白的表達(dá)

3討論

出生體質(zhì)量小于1 kg,胎齡不足28周的極不成熟兒或超低出生體質(zhì)量兒被稱作新型BPD患兒，它的主要特征是肺部的微血管發(fā)育不良，細(xì)微結(jié)構(gòu)發(fā)育異常。Klinger等[6]報(bào)道胎齡24～25周BPD發(fā)生率為50.1%，而隨著胎齡的增加，發(fā)病率逐漸降低。有研究表明宮內(nèi)感染造成的絨毛膜羊膜炎[2-3]及患兒出生后由于肺功能發(fā)育不全，需輔助吸入高氧，可引起肺組織的炎癥性瀑布式反應(yīng)，產(chǎn)生過多的氧自由基，從而導(dǎo)致肺泡呼吸膜破壞，和炎癥因子過度浸潤，最終導(dǎo)致肺組織結(jié)構(gòu)異常。因此，可認(rèn)為這兩種因素是新型 BPD發(fā)生的機(jī)制之一。而在具體因子方面有學(xué)者則發(fā)現(xiàn)高氧環(huán)境下內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ZGU) 相關(guān)蛋白GRP78、caspase-12，Smo 和Glil蛋白的表達(dá)增加[7-8]也恰恰證明了這一點(diǎn)。

Bcl-2和eNOS是Ang/Tie 通路[9-10]下游的PI3K/AKT信號傳導(dǎo)通路被激活后的效應(yīng)因子。目前Bcl-2在眾多文獻(xiàn)被廣泛認(rèn)為是PI3K/AKT信號傳導(dǎo)通路激活的標(biāo)志分子，在眾多器官中都有表達(dá)。它被激活后能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移，抑制凋亡，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞與其他細(xì)胞之間的相互作用，最終促進(jìn)新生血管生成。而eNOS在正常情況下表達(dá)可產(chǎn)生少量具有信號傳導(dǎo)作用的NO,在對抗肺損傷中有保護(hù)內(nèi)皮的屏障功能、減少黏附分子(VCAM)的表達(dá)和阻止中性粒細(xì)胞遷移的作用。

查看國內(nèi)外的研究發(fā)現(xiàn)，糖蛋白EPO對于動物及人體的多處組織器官如腎、腦、眼等，具有延緩感染、延緩氧化、對抗凋亡，促進(jìn)損傷的血管生成，促進(jìn)損傷組織的修復(fù)等作用[3,11-12]。由此推論rhEPO能夠在一定程度上減輕感染加高氧對肺組織的損傷。而本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：注射rhEPO后，肺組織Bcl-2和eNOS的表達(dá)隨著用藥時間的推移，出現(xiàn)了相應(yīng)的變化，用藥14d后各自表達(dá)量接近在正常肺組織中的表達(dá)，結(jié)合課題組前期的研究[5，13-14]，通過肺部切片的HE染色觀察，使用rhEPO能夠減輕肺損傷的病理改變。而國外研究也表明，EPO對于肺部的炎癥在治療與正常組相比，能夠顯著減少肺泡出血，減少中性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞的浸潤,降低肺泡壁厚度。由此說明rhEPO能夠?qū)π滦虰PD的發(fā)展進(jìn)行干預(yù)，促進(jìn)損傷肺組織的修復(fù)。而且在本實(shí)驗(yàn)過程中通過比較發(fā)現(xiàn)Bcl-2與eNOS在肺組織中整體表達(dá)水平，eNOS的表達(dá)量要比Bcl-2低很多，由此推測Bcl-2修復(fù)肺細(xì)胞的作用更重要一些。而且根據(jù)第1、7、14天不同用藥時間及用藥劑量的比較，間隔使用1400IU的rhEPO14d，對在肺組織的修復(fù)

作用最明顯。結(jié)合與Rayjada等[15]在臨床方面使用rhEPO對治療早產(chǎn)兒BPD研究結(jié)果，在推測rhEPO作用Ang/Tie 通路下游的PI3K/AKT信號傳導(dǎo)通路，可以有效地減輕新型BPD的肺組織的損傷程度，提前預(yù)防和治療對提高患兒今后的生活質(zhì)量具有重要的意義。

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The influence of different doses of rhEPO to the expression of new BPD rat lung eNOS and the Bcl-2 protein*

Wang Bingbing,Zhang Hua△

(Department of Pediatrics，the Affiliated Hospital of Guilin Medical University,Guilin，Guangxi 541004,China)

[Abstract]ObjectiveTo observe changes of the expression of Bcl-2 and endothelial nitric oxide synthase (eNOS) in lung tissue,which was used the indifferent treatment doses of recombinant human erythropoietin (rhEPO) of newborn SD model of a new type of bronchial pulmonary dysplasia.To explore its effect on the protection of the new type of bronchial pulmonary dysplasia(BPD),and find out the appropriate drug delivery time and dosage.MethodsWe used the things lipopolysaccharide (LPS) and continuous high oxygen preparation to make the new model of the BPD.We made random normal newborn mice 18 as normal air group,and then 90 newborn baby mice model of random points normal saline group (group A),rhEPO800 group (group B);rhEPO1000 group (group C),rhEPO1200 group (group D),rhEPO1400 group (group E),in experiment 1,7,and 14 days,we were randomly selected 6 executed only lung tissue under liquid nitrogen.Using RT-PCR and Western blot method to detect the Bcl-2 and eNOS protein and mRNA expression in lung tissue.ResultsCompared with the normal air group,the expression of protein and mRNA of Bcl-2 in group A was decreased,while the expression of eNOS was increased.Compared with group B,C,D,E,with the increase of rhEPO concentration,the expression of Bcl-2 protein and mRNA in group A gradually increased,while the expression of eNOS gradually decreased,and the expression of the group E was the most obvious,and the difference was statistically significant (P<0.05).ConclusionIt is prompted that rhEPO has some treatment function to the new BPD,while the dose of 1 400 IU/kg of 14 days have the best function.

[Key words]rhEPO;bronchial pulmonary dysplasia;Bcl-2;endothelial nitric oxide synthase,;treatment effect;dose

doi:論著·基礎(chǔ)研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.11.012

* 基金項(xiàng)目：廣西醫(yī)療衛(wèi)生重點(diǎn)科研課題(重2011011)。

作者簡介：王冰冰(1989-),醫(yī)師，碩士，主要從事圍產(chǎn)新生兒方向研究?！魍ㄓ嵶髡?， E-mail：zh4205@163.com。

[中圖分類號]R722.19

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)11-1481-03

(收稿日期：2015-11-20修回日期：2015-12-17)