谷祥任，張　雁

(湖南省張家界市人民醫(yī)院心血管內(nèi)科　427000)

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不同濃度的普伐他汀對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞極性的影響研究

谷祥任，張雁△

(湖南省張家界市人民醫(yī)院心血管內(nèi)科427000)

[摘要]目的探討不同濃度的普伐他汀對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞極性的影響。方法對(duì)小鼠骨髓來源的巨噬細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，以0 μmol/L普伐他汀鈉組作為對(duì)照組，分別給予10、25、50 μmol/L的普伐他汀鈉進(jìn)行藥物干預(yù)24 h，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)白細(xì)胞介素(IL)-10、IL-12的分泌，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞膜CD16/32、CD206的表達(dá)，熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)Toll樣受體4(TLR4)、髓樣分化因子88(MyD88)、干擾素調(diào)控因子5(IRF5) mRNA的表達(dá)。結(jié)果普伐他汀鈉干預(yù)后的巨噬細(xì)胞，隨著普伐他汀鈉的濃度升高，IL-12、CD16/32的表達(dá)下降，而IL-10、CD206的表達(dá)升高，并伴有TLR4、MyD88、IRF5 mRNA的表達(dá)下調(diào)，且呈劑量依賴性。結(jié)論普伐他汀鈉促進(jìn)巨噬細(xì)胞向抗炎性M2型極化，該效應(yīng)可能與普伐他汀鈉的抗炎作用有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]普伐他汀；炎癥；巨噬細(xì)胞極性；動(dòng)脈粥樣硬化

炎癥與動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)密切相關(guān)。AS更被認(rèn)為是一種慢性炎癥性疾病[1]。巨噬細(xì)胞作為AS發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵細(xì)胞，其可見于AS的各個(gè)階段。有研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞是一種兼具促炎與抗炎作用于一體的異質(zhì)性細(xì)胞，在不同的環(huán)境與條件下表現(xiàn)為不同的表型[2]：M1型(經(jīng)典激活型)與M2型(替代激活型)，前者表現(xiàn)為促炎性，能釋放炎癥介質(zhì)，參與炎性反應(yīng)，與人群中冠心病的患病率和病死率可能呈正相關(guān)；后者表現(xiàn)為抗炎性，分泌許多抗炎因子，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)參與組織修復(fù)，與動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病的發(fā)病率可能呈負(fù)相關(guān),有抗AS的作用。已有研究表明，二者能相互轉(zhuǎn)化，可成為防治AS的新策略[3]。研究發(fā)現(xiàn)，作為心血管疾病的常用藥物，他汀類除具有傳統(tǒng)的降脂效應(yīng)外，還具有抗炎的作用，具有逆轉(zhuǎn)斑塊的效應(yīng)，但具體機(jī)制尚不清楚。本研究以不同濃度的水溶性最高的他汀類代表藥普伐他汀鈉作用于體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞，觀察他汀類藥物濃度因素對(duì)巨噬細(xì)胞極性的影響，探討其抗炎、抗AS的細(xì)胞和分子機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料(1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)4～6周齡C57BL/6雌性小鼠，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。(2)儀器與試劑：重組小鼠γ-干擾素(IFN-γ，Peprotech公司)，普伐他汀鈉原料藥(浙江海正藥業(yè)有限公司)，脂多糖(LPS,Sigma公司)，異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記的大鼠抗小鼠F4/80抗體(Biolegend公司)，F(xiàn)ITC標(biāo)記的大鼠抗小鼠CD16/32抗體(Biolegend公司)，F(xiàn)ITC標(biāo)記的大鼠抗小鼠 CD206 抗體( AbD Serotec 公司)及對(duì)應(yīng)的同型抗體，小鼠白細(xì)胞介素(IL)-10，IL-12酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)試劑盒(達(dá)科為生物技術(shù)有限公司)，RNApure高純總RNA快速提取試劑盒(艾德萊生物科技有限公司)，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen公司)，熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒 Maxima SYBR Green qPCR Master Mix(Thermo Scientific公司)。FACSAria Ⅲ流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)，多功能酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)，7500 Fast實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)。

1.2方法

1.2.1M0型巨噬細(xì)胞模型的建立借鑒Pradel等[4]的方法，將C57BL/6小鼠頸椎脫臼處死，無菌分離出股骨和脛骨，截?cái)喙趋慷?，?.5 mL注射器吸取培養(yǎng)基(20%胎牛血清、100 μg/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素的DMEM培養(yǎng)液)沖洗骨髓，收集沖洗物， 2 000 r/min離心10 min后棄上清液，加入含L929成纖維細(xì)胞上清液的培養(yǎng)基(20%胎牛血清、100 μg/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素的DMEM培養(yǎng)液)，培養(yǎng)7 d后棄去未貼壁細(xì)胞，再在不含L929成纖維細(xì)胞上清液的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，1 d后獲得的貼壁細(xì)胞即為骨髓來源的巨噬細(xì)胞(M0型巨噬細(xì)胞組)。

1.2.2M1型巨噬細(xì)胞模型的建立去除懸浮的細(xì)胞及舊的細(xì)胞培養(yǎng)液，重新?lián)Q上不含L929成纖維細(xì)胞上清液的培養(yǎng)基與貼壁的細(xì)胞共培養(yǎng)，在Vats等[5]的方法基礎(chǔ)上濃度減半(預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示減半后的濃度效果較佳，細(xì)胞無成片死亡或狀態(tài)極差的情況)，即脂多糖(LPS)2.5 ng/mL和IFN-γ 50 U/mL，對(duì)骨髓來源的M0型巨噬細(xì)胞進(jìn)行12 h的刺激，使其形成M1型巨噬細(xì)胞。

1.2.3實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)分為4組。對(duì)照組：即M1型巨噬細(xì)胞組(0 μmol/L普伐他汀鈉組)；用藥組：分別給予10、25、50 μmol/L的普伐他汀鈉對(duì)M1型巨噬細(xì)胞進(jìn)行藥物干預(yù)24 h。

1.2.4ELISA測(cè)定細(xì)胞因子分泌收集各組巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按照試劑盒說明操作，檢測(cè)IL-10、IL-12的分泌。加入配好的標(biāo)準(zhǔn)品，設(shè)置對(duì)照，在450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度(OD值)。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞膜表面抗原表達(dá)0.25%胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞，PBS洗滌1次，離心，去除上清液后用100 μL PBS重懸細(xì)胞，再分別加入0.25 μg FITC標(biāo)記的大鼠抗小鼠F4/80抗體、0.5 μg FITC標(biāo)記的大鼠抗小鼠CD16/32抗體、0.5 μg FITC標(biāo)記的大鼠抗小鼠CD206抗體及對(duì)應(yīng)的同型抗體，4 ℃避光孵育30 min，2 000 r/min離心，PBS沖洗2次，300 μL PBS重懸后再用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.6RNA提取及熒光定量PCR檢測(cè)收集各組細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，然后-20 ℃保存。采用美國(guó)ABI 7500 Fast實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測(cè)。引物由Invitrogen公司設(shè)計(jì)合成，TLR4 上游：5′-AGA CCT CAG CTT CAA TGG TG-3′；下游：5′-GAG ACT GGT CAA GCC AAG AA-3′。MyD88上游：5′-TCC GGC AAC TAG AAC AGA CAG ACT-3′；下游：5′-GCG GCG ACA CCT TTT CTC AAT-3′。IRF5上游：5′-AAT ACC CCA CCA CCT TTT GA-3′；下游：5′-TTG AGA TCC GGG TTT GAG AT-3′。為保證各cDNA樣本量的均一性，采用β-actin作為內(nèi)參。β-actin上游：5′-TCC GTA AAG ACC TCT ATG CC-3′,下游：5′-TAC TCC TGC TTG CTG ATC C-3′。采用兩步法擴(kuò)增目的DNA片段，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，反復(fù)檢測(cè)3次，采用2-△△Ct法分析基因表達(dá)。定量PCR反應(yīng)體系配置見表1。

表1　定量PCR反應(yīng)體系的配置

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；多組間均數(shù)差異比較先采用方差分析，再用S-N-K檢驗(yàn)進(jìn)行兩均數(shù)間的兩兩比較；以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1M0型巨噬細(xì)胞模型的鑒定M0型巨噬細(xì)胞的鑒定主要有表型(F4/80)、形態(tài)及吞噬功能測(cè)定(如吞噬墨汁、雞紅細(xì)胞、中性紅細(xì)胞等)3種鑒定方法，其中，表型鑒定是最具可靠性的鑒定手段。本實(shí)驗(yàn)采集的骨髓細(xì)胞，經(jīng)L929成纖維細(xì)胞分泌的巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage-colony stimulating factor,M-CSF)的作用，在含L929成纖維細(xì)胞上清液的培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠巨噬細(xì)胞特異性標(biāo)記F4/80示巨噬細(xì)胞的純度高達(dá)96%(圖1)，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖1　M0型巨噬細(xì)胞F4/80的表達(dá)(96%)

2.2M1型巨噬細(xì)胞模型的鑒定將IFN-γ(50 U/mL)和LPS(2.5 ng/mL)聯(lián)合刺激M0型巨噬細(xì)胞后，通過檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，CD16/32陽性表達(dá)率為(78.15± 2.02)%，CD206陽性表達(dá)率為(6.74± 3.08)%(表2)。IL-12的分泌較高，IL-10的分泌較低(圖2)。與M1型巨噬細(xì)胞的表型特點(diǎn)相符。

M0：M0型巨噬細(xì)胞組；M1:M1型巨噬細(xì)胞組；10P：10 μmol/L普伐他汀鈉組；25P：25 μmol/L普伐他汀鈉組；50P：50 μmol/L普伐他汀鈉組。

圖2各組巨噬細(xì)胞IL-10、IL-12的分泌水平

2.3各組形成的巨噬細(xì)胞表型指標(biāo)檢測(cè)巨噬細(xì)胞分泌的IL-12、IL-10及膜表面抗原蛋白分子CD16/32、CD206是鑒定巨噬細(xì)胞表型的主要指標(biāo)。通過檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，普伐他汀鈉組炎癥因子IL-12的分泌和CD16/32的陽性表達(dá)率均低于M1型巨噬細(xì)胞組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而抗炎因子IL-10的分泌和CD206的陽性表達(dá)率較M1型巨噬細(xì)胞組升高明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

2.4熒光定量PCR檢測(cè)各組TLR4、MyD88、IRF5 mRNA的基因表達(dá)M1型巨噬細(xì)胞組TLR4、MyD88、IRF5 mRNA的表達(dá)最高，而經(jīng)不同濃度的普伐他汀鈉干預(yù)后，其TLR4、MyD88、IRF5 mRNA的表達(dá)下降明顯，呈劑量依賴性，與M1型巨噬細(xì)胞組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表2　各組巨噬細(xì)胞表型指標(biāo)檢測(cè)±s,n=4)

a:P<0.05，與M1型巨噬細(xì)胞組比較；b:P<0.05，與10 μmol/L普伐他汀鈉組比較；c:P<0.05，與25 μmol/L普伐他汀鈉組比較。

表3　各組TLR4、MyD88、IRF5 DNA的相對(duì)拷貝數(shù)檢測(cè)

a：P<0.05，與M1型巨噬細(xì)胞組比較;b:P<0.05，與10 μmol/L普伐他汀鈉組比較；c:P<0.05，與25 μmol/L普伐他汀鈉組比較。

3討論

炎癥是驅(qū)動(dòng)AS及其相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展的主要原因[6]。目前，對(duì)炎癥與AS的研究涉及多個(gè)方面，在細(xì)胞層面主要有T淋巴細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞等。研究表明，巨噬細(xì)胞在AS過程中發(fā)揮核心作用，因?yàn)樗侵惔x和炎癥免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)劑[7]。巨噬細(xì)胞是一種具有雙向調(diào)節(jié)作用的免疫細(xì)胞，具有促炎與抗炎兩種作用，而巨噬細(xì)胞極性就是這兩種極端性質(zhì)。M1型巨噬細(xì)胞分泌炎性因子IL-12,高表達(dá)膜抗原CD16/32,與炎性損傷有關(guān)；而M2型巨噬細(xì)胞分泌抗炎因子IL-10，高表達(dá)膜抗原CD206，有抑制炎癥的作用。研究發(fā)現(xiàn)，在特定條件下，AS斑塊中的M1與M2型巨噬細(xì)胞可相互轉(zhuǎn)化，根據(jù)數(shù)量?jī)?yōu)劣表現(xiàn)為促炎或抗炎的作用[8]。

作為調(diào)脂的常規(guī)用藥，他汀類藥物還具有其他的多效性作用，如穩(wěn)定粥樣斑塊，改善血管內(nèi)皮功能，保護(hù)神經(jīng)，抗凝防血栓和抗炎等作用，尤其需要特別關(guān)注的是抗炎作用。研究顯示其與斑塊的穩(wěn)定、血管壁的內(nèi)皮功能亦密切相關(guān)，在急性冠脈綜合征(ACS)早期患者中使用能夠抑制血管內(nèi)皮的炎性反應(yīng)，穩(wěn)定粥樣斑塊，改善血管內(nèi)皮功能[9-10]。

人類和小鼠AS病變顯示出增強(qiáng)的 TLR4 表達(dá)。觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)oxLDL刺激后，在AS區(qū)域TLR4 表達(dá)增加[11]。除了TLR3外，MyD88能傳遞所有TLR受體的信號(hào)，是一種非常關(guān)鍵的銜接蛋白。Bjorkbacka等[12]研究顯示MyD88 的缺失及滅活，能導(dǎo)致巨噬細(xì)胞招募到動(dòng)脈壁的減少，并引起AS的減少，與趨化因子相關(guān)聯(lián)。新的研究表明，IRF5可作為控件操縱巨噬細(xì)胞抗炎或促炎的特性[13]。Weiss等[14]為了弄清IRF5的表達(dá)在巨噬細(xì)胞中的作用是否與炎癥性巨噬細(xì)胞存在相關(guān)聯(lián)，采用活體小鼠實(shí)驗(yàn)性誘導(dǎo)成關(guān)節(jié)炎的做法來檢測(cè)IRF5的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)腔中的巨噬細(xì)胞IRF5的表達(dá)升高，其他相關(guān)檢測(cè)符合M1型巨噬細(xì)胞或炎癥性巨噬細(xì)胞的特征，提示IRF5與炎癥相關(guān)，其表達(dá)升高可作為炎癥性巨噬細(xì)胞或M1型巨噬細(xì)胞的一個(gè)標(biāo)志。

現(xiàn)有的研究資料顯示，炎性反應(yīng)與巨噬細(xì)胞上TLR4及其中下游的MyD88、IRF5傳導(dǎo)通路密切相關(guān)[15]。本實(shí)驗(yàn)從TLR4-MyD88-IRF5分子信號(hào)通路出發(fā)，用他汀類代表藥普伐他汀鈉，以10、25、50 μmol/L的濃度進(jìn)行藥物干預(yù)發(fā)現(xiàn)，與M1型巨噬細(xì)胞組比較，不同濃度的普伐他汀鈉干預(yù)組炎癥標(biāo)志物IL-12、CD16/32的表達(dá)均下降，而抗炎標(biāo)志物IL-10、CD206的表達(dá)均升高，并伴有TLR4、MyD88、IRF5 mRNA的表達(dá)下調(diào)，且呈劑量依賴性，推測(cè)他汀類藥物可能通過抑制TLR4-MyD88-IRF5分子信號(hào)通路來調(diào)控巨噬細(xì)胞的極性，使M1型巨噬細(xì)胞極化為M2型巨噬細(xì)胞，進(jìn)而發(fā)揮抗炎效應(yīng)，其具體機(jī)制尚需更進(jìn)一步研究。

綜上所述，在AS的發(fā)生發(fā)展過程中，機(jī)體始終存在著巨噬細(xì)胞促炎與抗炎的極性轉(zhuǎn)換，而他汀類代表藥普伐他汀鈉具有促進(jìn)M1型向M2型轉(zhuǎn)換而發(fā)揮抗炎的作用，這為他汀類藥物對(duì)AS的防治提供了理論支持。

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Effect of different concentrations of pravastatin treatment on macrophage polarity in micer

Gu Xiangren,Zhang Yan△

(Department of Cardiology,Zhangjiajie Municipal People′s Hospital,Zhangjiajie,Hunan 427000,China)

[Abstract]ObjectiveTo study the effect of different concentrations of pravastatin treatment on macrophage polarity in mice.MethodsThe mice bone marrow sources of macrophages were cultured in vitro,with the 0 μmol/L sodium pravastatin group as control,by giving 10,25,50 μmol/L sodium pravastatin to conduct the drug intervention for 24 h.The enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) was used to detect the secretion of interleukin 10 (IL-10) and IL-12;the flow cytometry instrument was used to detect cell membrane CD16/32,CD206 expression;real time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) was adopted to detect toll-like receptor 4 (TLR4),myeloid differentiation factor 88 (MyD88),interferon regulatory factor 5 (IRF5) mRNA expression.ResultsAfter the intervention of pravastatin sodium on macrophages,as the pravastatin sodium concentration increase,the expression of IL-12 and CD16/32 was decline,while the expression of IL-10 and CD206 was risen,which was accompanied by TLR4,MyD88,IRF5 mRNA expression down regulatyion,and a dose dependent manner.ConclusionSodium pravastatin promote the polarization of macrophages toward an anti-inflammatory macrophage phenotype (M2),this effect may be related with the anti-inflammatory effect of sodium pravastatin.

[Key words]pravastatin;inflammation;macrophage polarity;atherosclerosis

doi:論著·基礎(chǔ)研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.09.007

作者簡(jiǎn)介：谷祥任(1975-)，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事心血管疾病的研究及臨床、介入工作?！魍ㄓ嵶髡撸珽-mail:yz0369@163.com。

[中圖分類號(hào)]R363

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1671-8348(2016)09-1173-03

(收稿日期：2015-09-18修回日期：2015-12-10)