余天霧,龔建平,郭　丹,周　健

(1.重慶醫(yī)科大學附屬永川醫(yī)院普外3科　402160;2.重慶醫(yī)科大學附屬第二臨床學院肝膽外科　400010;3.重慶醫(yī)科大學附屬第二臨床學院三腺外科　400010)

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乳腺癌腫大腋窩淋巴結中BCSCs相關基因表達與腫瘤復發(fā)、轉(zhuǎn)移的關系

余天霧1,龔建平2△,郭丹3,周健1

(1.重慶醫(yī)科大學附屬永川醫(yī)院普外3科402160;2.重慶醫(yī)科大學附屬第二臨床學院肝膽外科400010;3.重慶醫(yī)科大學附屬第二臨床學院三腺外科400010)

[摘要]目的探索乳腺癌干細胞(BCSCs)相關基因 CD44、Twist1、OCT4在乳腺癌患者癌組織、腋窩腫大淋巴結中的表達與乳腺癌轉(zhuǎn)移及復發(fā)的關系。方法以免疫組化法和組織免疫熒光聚合酶鏈反應(RT-PCR)分別檢測乳腺癌患者癌組織、腋窩淋巴結中BCSCs相關因子CD44、CD24、Twist1和OCT4的基因和抗原表達。結果在術前和術中確診為乳腺癌的14例患者中均有癌細胞腋窩淋巴結轉(zhuǎn)移。免疫組化法測得乳腺癌癌組織、腋窩腫大淋巴結BCSCs相關因子CD44、Twist1和OCT4抗原陽性過表達，而CD24呈低表達；RT-PCR檢測乳腺癌組織、腋窩淋巴結中BCSCs相關因子CD44、Twist1和OCT4的基因表達增強(P<0.05)，CD24基因低表達(P>0.05)。結論乳腺癌伴腋窩淋巴結腫大者BCSCs相關因子CD44、Twist1和OCT4的基因、抗原表達明顯增高，可能表明BCSCs相關因子與乳腺癌細胞易早期轉(zhuǎn)移、復發(fā)有關。

[關鍵詞]乳腺腫瘤；干細胞；CD44；Twist1；OCT4

乳腺癌標本或乳腺腫瘤細胞系中乳腺癌干細胞(BCSCs)的鑒別主要是基于腫瘤細胞表面的分子表型如CD44+CD24-/low或ALDH+。除了CD44，與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和復發(fā)有關的因素還包括BCSCs 的其他相關基因的過表達，如OCT4和Twist1。在腫瘤細胞中或表達OCT4的細胞株中像腫瘤干細胞樣的細胞只是很少的一部分，它是轉(zhuǎn)錄因子POU家族中的一個，在胚胎干細胞中維持多能和增殖的作用。正常乳腺組織的OCT4的過度轉(zhuǎn)導作用導致?lián)碛姓T發(fā)腫瘤和腫瘤侵襲能力的細胞系產(chǎn)生。臨床研究表明，與低級別和OCT4低表達的腫瘤相比，腫瘤干細胞分子OCT4過表達的乳腺腫瘤與病情進一步惡化、遠處轉(zhuǎn)移和生存期更短密切相關[1]。具有螺旋-環(huán)-螺旋基礎結構的轉(zhuǎn)錄因子Twist1已被報道在腫瘤細胞血液播散、轉(zhuǎn)移方面有強大的促進作用，也為臨床的研究、有效的治療干預提供了理想的標靶。Twist1能促使細胞的表皮間質(zhì)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)，能使癌細胞之間失去細胞黏附和腫瘤細胞轉(zhuǎn)移[2]。對于上皮惡性腫瘤來說，EMT是癌細胞血液播散的關鍵事件[3]，同時認為它有助于腫瘤干細胞分子表型的形成[4]。尤其是EMT促進了癌細胞從原發(fā)灶脫離并且通過喪失細胞極性和黏附能力來促進癌細胞的遷徙[5]。進一步闡明Twist1促進腫瘤轉(zhuǎn)移的機制和Twist1功能調(diào)節(jié)子的識別有助于制訂出抑制EMT和腫瘤轉(zhuǎn)移的新策略。乳腺癌淋巴結轉(zhuǎn)移(lymph nodes metastasis,LNM)表明淋巴結內(nèi)含有侵襲力強的分子表型的癌細胞而且EMT調(diào)節(jié)子的水平表達上調(diào)[6]。試驗模型提供的證據(jù)進一步解釋了原發(fā)腫瘤具有發(fā)展到腫瘤細胞播散和促進生長因子表達增加的可能。因而，LNM可以作為原發(fā)性乳腺腫瘤侵襲和遠處轉(zhuǎn)移潛能的替代性分子標志[6]。目前BCSCs在乳腺癌患者腋窩淋巴結、血液循環(huán)和骨髓存在情況與乳腺癌轉(zhuǎn)移的關系所知甚少，而且缺乏有效的檢測方法。本課題擬以BCSCs為細胞平臺，CD44、Twist1、OCT4干細胞基因表達為BCSCs檢測依據(jù)，以免疫熒光聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測CD44、Twist1、OCT4干細胞基因的表達，初步探索BCSCs與乳腺癌復發(fā)和轉(zhuǎn)移的相關性。

1材料與方法

1.1材料本研究選取14例2013年乳腺癌術后患者，病理診斷明確。14例均為女性，年齡38～69歲，中位年齡53.5歲。本院乳腺癌患者術中切下的乳腺癌組織、腫大腋窩淋巴結(14例)均經(jīng)病理檢查結果證實；所有這些操作均遵守科學實驗倫理道德委員會管理章程。

1.2試劑抗體CD44、CD24、Twist1、OCT4購于Santa公司，RT-PCR試劑盒、CD44、CD24、Twist1及OCT4 primer購于TakaRa公司；免疫熒光二抗抗體(驢抗兔IgG-FITC和羊抗兔PE抗體購于SA (USA)公司；磷酸鹽緩沖液(PBS，0.01 mol/L，pH7.4)購于南京生物試劑公司。

1.3方法

1.3.1免疫熒光和激光共聚焦操作過程將手術中取下的乳腺癌灶組織、腋窩淋巴結、正常乳腺組織進行脫水、冰凍切片固后定于載玻片。PBS浸洗切片3 min后滴加3% H2O2及山羊血清封閉組織，在濕盒中37 ℃封閉15 min(室溫30 min也可)。再滴加CD44抗體(以0.01 mol/L，pH7.4的PBS稀釋1∶100)覆蓋標本切片。置濕盒中4 ℃孵育過夜(37 ℃ 1～2 h許)，再用PBS浸洗3 min，重復5次，洗去一抗后濾紙擦去標本液體。滴加熒光二抗置濕盒中，37 ℃避光孵育1 h，再以PBS浸洗3 min，反復5次洗去二抗。以50%甘油封片后立即在熒光顯微鏡下觀察。以同樣方法操作CD24、Twist1、OCT4免疫熒光激光共聚焦檢查。

1.3.2RT-PCR檢測乳腺癌灶組織、腋窩淋巴結、正常乳腺組織CD44、CD24、Twist1、OCT4的基因表達先以超聲波碎掉冰凍的乳腺組織、乳腺癌組織和腋窩淋巴結。再用Trizol提取總RNA，紫外分光光度計檢測質(zhì)量與含量。采用TaKaRa公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒，嚴格按照試劑盒操作說明反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。CD44:5′-GCC CAA TGC CTT TGA TGG ACC-3′ (Sense primer),3′-GCA GGG ATT CTG TCT GTG CTG-5′ (Anti-sense primer);CD24:5′-ATG GGC AGA GCA ATG GTG GCC A-3′(Sense primer),3′-TCA AGA GAA GCA CCA GAG TGA GA-5′ (Anti-sense primer);Twist1:5′-CAA GAA GTC TGC GGG CTG TG-3′(Sense primer),5′-TCG TTC AGC GAC TGG GTG C-3′(Anti-sense primer);OCT4:5′-CAA ACG ACC ATC TGC CGC T-3′(Sense primer),5′-CAG GTT GCC TCT CAC TCG GTT-3′(Anti-sense primer)。退火條件：56 ℃。常規(guī)PCR 操作，10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，Alpha Innotech Coporation凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。

2結果

2.1臨床病理資料本研究共收集了14例原發(fā)性侵襲性乳腺癌患者，每例腫瘤標本均經(jīng)有經(jīng)驗的病理醫(yī)生確認，每例患者均經(jīng)國際抗癌協(xié)會TNM標準分級。乳腺腫瘤小于或等于2 cm占42.8%(6例)，腫瘤大于2 cm占57.2% (8例)。根據(jù)Elston和 Ellis方法將腫瘤標本行組織學分級：1～2級占42.8%(6例)，3級占57.2%(8例)；在所有腫瘤標本中11例為侵襲性導管癌(IDC)，而其余的3例為髓樣癌或乳腺小葉癌。為了便于分析資料，筆者還收集了患者標本的部分免疫組化指標如孕激素受體(PR)、雌激素受體(ER)、人表皮生長因子受體-2(HER2)、CEA和BCA225。當10%的細胞核陽性表達時判定為PR或ER過表達。根據(jù)Herceptest評分系統(tǒng)使用單克隆抗體對HER2進行評分。0：無細胞膜反應或不足10%細胞有反應；1：超過10%細胞存在不全性細胞膜反應；2：超過10%細胞有弱至中等強度的完全包膜反應；3：超過10%細胞強烈的完全包膜反應。14例中有12例BCA225血清抗原高于75 μg/L，2例血清抗原低于75 μg/L。有11例患者CEA血清抗原高于7 ng/L，3例患者CEA血清抗原低于7 ng/L。

A：正常乳腺組織中的CD44抗原；B：乳腺癌組織中的CD44抗原；C：轉(zhuǎn)移淋巴結中的CD44抗原；D、E：RT-PCR檢測。

圖1CD44 在鄰近正常的乳腺組織、乳腺癌組織和轉(zhuǎn)移的腋窩淋巴結中的表達

A：正常乳腺組織中的CD24抗原；B：乳腺癌組織中的CD24抗原；C：轉(zhuǎn)移淋巴結中的CD24抗原；D、E：RT-PCR檢測。

圖2CD24在鄰近正常的乳腺組織、乳腺癌組織和轉(zhuǎn)移的腋窩淋巴結中的表達

A：正常乳腺組織中的OCT4；B：乳腺癌組織中的OCT4；C：轉(zhuǎn)移淋巴結中的OCT4；D、E：RT-PCR檢測。

圖3OCT4 在鄰近正常的乳腺組織、乳腺癌組織和轉(zhuǎn)移的腋窩淋巴結中的表達

2.2CD44、CD24抗體檢測遂行組織冰凍切片CD44和CD24抗體染色、激光共聚焦檢測。激光共聚焦掃描顯示：CD44抗原盡管也表達于正常乳腺組織(圖1A)，但主要存在于腫瘤細胞膜上，細胞間質(zhì)內(nèi)也有少量表達；乳腺癌組織(圖1B)和轉(zhuǎn)移淋巴結中(圖1C)CD44的表達要明顯強于鄰近正常的乳腺組織。RT-PCR檢測結果顯示:在乳腺癌組織和轉(zhuǎn)移淋巴結中CD44基因表達均明顯強于鄰近正常的乳腺組織(圖1D、E)，而CD44在腫瘤組織和轉(zhuǎn)移淋巴結中的過表達。RT-PCR結果顯示乳腺癌組織和轉(zhuǎn)移的腋窩淋巴結中的CD44 mRNA 表達明顯強于鄰近正常的乳腺組織(P<0.05)，在乳腺癌組織和轉(zhuǎn)移的腋窩淋巴結之間的表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。CD24在正常乳腺組織、原發(fā)癌灶內(nèi)和淋巴結中皆少量表達或不表達(圖2)，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.3OCT4檢測原發(fā)乳腺癌組織和轉(zhuǎn)移淋巴結中的OCT4具有自我更新和促使癌細胞增殖的功能，OCT4抗原主要表達于腫瘤細胞膜上和細胞基質(zhì)內(nèi)；它可表達于正常乳腺組織上皮細胞核內(nèi)(圖3A)，乳腺癌組織(圖3B)和轉(zhuǎn)移的腋窩淋巴結中(圖3C)，明顯強于鄰近正常的乳腺組織(圖3A)。RT-PCR結果顯示:在乳腺癌組織和轉(zhuǎn)移淋巴結中OCT4基因表達均明顯強于正常的乳腺組織(圖3D、E)。RT-PCR檢測，乳腺癌組織和轉(zhuǎn)移的腋窩淋巴結中的OCT4 mRNA 表達明顯強于鄰近正常的乳腺組織(P<0.05)， 在乳腺癌組織和轉(zhuǎn)移的腋窩淋巴結之間的表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

A：正常乳腺組織中的Twist1；B：乳腺癌組織中的Twist1；C：轉(zhuǎn)移淋巴結中的Twist1；D、E：RT-PCR檢測。

圖4Twist1在鄰近正常的乳腺組織、乳腺癌組織和轉(zhuǎn)移的腋窩淋巴結中的表達

2.4Twist1檢測原發(fā)性乳腺癌和淋巴結轉(zhuǎn)移灶中Twist1的過表達可能有助于癌細胞的遷徙、侵襲和遠處轉(zhuǎn)移分別以激光共聚焦、RT-PCR對3種組織中的Twist1的表達狀態(tài)進行了檢測。激光共聚焦照片顯示：乳腺導管癌上皮的基底層的細胞核內(nèi)和細胞間質(zhì)內(nèi)，而且正常乳腺組織內(nèi)小管上皮基底層的細胞核內(nèi)也可見少量表達(圖4A)。然而正常乳腺組織Twist1較原發(fā)乳腺癌組織(圖4B)和轉(zhuǎn)移的腋窩淋巴結組織(圖4C)的熒光強度弱得多。RT-PCR檢測結果顯示乳腺癌組織和轉(zhuǎn)移腋窩淋巴結中Twist1基因的表達較正常乳腺組織中的表達要強很多(圖4D、E)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，然而在后二者中差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

3討論

3.1乳腺癌組織和腋窩淋巴結中BCSCs分子標志物CD44的高表達是癌細胞增殖、轉(zhuǎn)移的關鍵環(huán)節(jié)第1個被確認的實體腫瘤干細胞來源于乳腺癌，那些具有CD44+CD24-標志物的一小撮細胞亞群(僅100個那樣少)能再生為一個腫瘤實體，反之，不具有這種生物標志的眾多腫瘤細胞卻具有該功能[7]。試驗結果表明CD44分子在原發(fā)乳腺癌和轉(zhuǎn)移的腋窩淋巴結中高表達而在正常乳腺組織中低表達。而CD24在腫瘤組織、腋窩淋巴結和正常組織中均低表達，這與以前的研究相符合。Li等[8]報道到了乳腺癌腫瘤干細胞是由高水平的透明質(zhì)酸受體CD44和對熱穩(wěn)定的低表達的CD24分子為特征的細胞。這表明乳腺癌干細胞主要在形成的初始階段其主要作用并維持這種趨勢。乳腺癌干細胞CD44+CD24-也保持干細胞的多種特性如自我更新、增殖和促進癌細胞轉(zhuǎn)移等。進一步研究表明，以透明質(zhì)酸誘導為基礎的這類腫瘤細胞的標志包括高聚集的CD44+CD24-為特征的腫瘤侵襲性細胞，細胞連接蛋白如鈣黏素和封閉素下調(diào)，以及豐富的表皮間質(zhì)化標志物如強烈的淋巴細胞侵襲和對化療產(chǎn)生抵制的分子表型過表達[9]。因而以CD44為標靶可以干預乳腺癌干細胞的分化、自我更新和腫瘤的侵襲。

3.2乳腺癌干細胞OCT4的高表達維系了癌細胞的自我更新并增加了對治療的抵制和復發(fā)的概率正常組織中的OCT4，尤其是孕期，具有多重功能如乳腺上皮細胞的自我更新、增殖，以及環(huán)境誘導的多重特性[10-11]。正常乳腺組織中OCT4一旦變異，他的轉(zhuǎn)導就會導致具有侵襲、克隆能力的腫瘤細胞系產(chǎn)生。實驗結果表明和正常組織相比，乳腺組織和受累腋窩淋巴結內(nèi)OCT4的基因和蛋白均為過表達。這表明OCT4與細胞的產(chǎn)生和分化狀態(tài)密切相關。而且當正常組織內(nèi)OCT4呈高表達時賦予了腫瘤發(fā)生的能力。臨床研究已表明：與組織內(nèi)OCT4呈中低程度表達相比，COT4干性分子高表達的腫瘤與疾病進展、遠處轉(zhuǎn)移和遠期更短的生存期有關[1]。OCT4預后差與腫瘤干細胞耐藥增多導致腫瘤患者化療失敗率高有密切關系[12]。

CD44+CD24-/low乳腺癌干細胞中Twist1的過表達由于使上皮間質(zhì)化而促進了腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。盡管Twist1在其他上皮類腫瘤細胞的核內(nèi)表達是低頻率事件，但是在乳腺癌細胞核內(nèi)表達卻具有重要的臨床意義。試驗結果顯示Twist1主要表達在乳腺癌和轉(zhuǎn)移淋巴結中CD44+CD24-/low癌細胞核內(nèi),同時正常組織內(nèi)也有少量表達。這表明Twist1可能主要在腫瘤的起始和促進腫瘤轉(zhuǎn)移方面起作用。更重要的是，筆者發(fā)現(xiàn)在Ⅰ～Ⅳ級的乳腺癌組織和腋窩淋巴結內(nèi)發(fā)現(xiàn)Twist1的表達上調(diào)。表明轉(zhuǎn)移淋巴結內(nèi)Twist的高表達及后者從陰性到陽性的轉(zhuǎn)變可能會導致更差的預后。研究證明乳腺上皮中Twist1可能通過CD44的過表達促進乳腺癌干細胞的產(chǎn)生和醛酸脫氫酶活性的增加使上皮間質(zhì)化[8，13]。另一方面，Twist1誘導了上皮間質(zhì)化,能使上皮腫瘤細胞具有間質(zhì)化細胞系的特性如與癌細胞遠處轉(zhuǎn)移密切相關的遷徙和侵襲能力[14]。本研究和文獻報道表明腫瘤間質(zhì)中的Twist1與腫瘤中陽性ER和PR的狀態(tài)緊密相關。所有Twist1高表達的腫瘤細胞株都顯示了ER基因和蛋白的表達，以及二者在乳腺癌患者中呈反比關系[15]。

本研究發(fā)現(xiàn)原發(fā)性乳腺癌和轉(zhuǎn)移性腋窩淋巴結中的CD44、OCT4及Twist1分別較正常乳腺組織高表達，而且在Twist1高表達患者中ER呈低表達，預示了這類患者可能預后更差。

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Relation between expression of BCSCs associated genes from swelling axillary lymph nodes of breast cancer with recurrence and metastasis of tumor

Yu Tianwu1,Gong Jianping2△,Guo Dan3,Zhou Jian1

(1.Third Department of General Surgery,Affiliated Yongchuan Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 402160,China;2.Department of Hepatobiliary Surgery,Second Affiliated Hospital of Chongqing Medical University,Chongqing 400010,China；3.Department of Three Glands Surgery, Affiliated Second Clinical College,Chongqing Medical University,Chongqing 400010,China)

[Abstract]ObjectiveTo explore the relation between the expression of breast cancer stem cells(BCSCs) related gene CD44,OCT4 and Twist1 in breast cancer tissues and swelling axillary lymph nodes with the recurrence and metastasis of breast cancer.MethodsThe genes and antigen expressions of BCSCs relative factors CD44,CD24,OCT4 and Twist1 in th breast cancer tissue and axillary lymph nodes were detected by the immunohistochemical method and RT-PCR.ResultsTotally 14 cases of preoperatively and intraoperatively diagnosed breast cancer had axillary lymph nodes metastasis of cancer cells.The over expression of BCSCs relative factors CD44,OCT4 and Twist1 antigen positive in the breast cancer tissue and axillary lymph nodes were detected by the immunohistochemical method,while CD24 was lowly expressed;the gene expressions of BCSCs relative factors CD44,OCT4 and Twist1 in the breast cancer tissue and axillary lymph nodes were enhanced by the RT-PCR detection (P<0.05),while CD24 gene was lowly expressed(P>0.05).ConclusionThe genes and antigen expression of BCSCs related factors CD44,OCT4 and Twist1 in the patients with breast cancer complicating swelling axillary lymph nodes are significantly increased,which might indicate that the BCSCs related factors are related with easily early metastasis and recurrence of breast cancer cells.

[Key words]breast neoplasms;stem cell;CD44；Twist1；OCT4

doi:論著·臨床研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.09.022

作者簡介：余天霧(1968―)，學士，主治醫(yī)師，主要從事乳腺腫瘤治療研究。△通訊作者，E-mail:674079699@qq.com。

[中圖分類號]R737.9

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)09-1224-05

(收稿日期：2015-09-29修回日期：2015-12-01)