賈靜輝，李春東，陳　冰，李景軒，童　英

(中國人民解放軍空軍總醫(yī)院婦產(chǎn)科，北京 100142)

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腫瘤錯配修復(fù)基因PMS2及活化Akt1在不同卵巢癌細胞株中的表達及相關(guān)性

賈靜輝，李春東，陳冰，李景軒，童英△

(中國人民解放軍空軍總醫(yī)院婦產(chǎn)科，北京 100142)

[摘要]目的檢測Akt1、P-Akt S473和PMS2蛋白在人類不同卵巢癌細胞株(A2780、Caov3、C13*和ES2)中的表達水平及相關(guān)性。方法應(yīng)用Western blot檢測Akt1、P-Akt S473和PMS2蛋白分別于A2780、Caov3、C13*和ES2細胞中表達水平；應(yīng)用Akt1激動劑胰島素樣生長因子-1(IGF-1)及Akt1特異性抑制劑API-2調(diào)節(jié)Akt1活化水平，觀察PMS2蛋白表達水平變化。結(jié)果Akt1，P-Akt S473及PMS2 3種蛋白在A2780，Caov3，C13*和ES2卵巢癌細胞內(nèi)均表達，但表達水平高低不一，即Akt1的活化形式P-Akt S473與PMS2蛋白表達呈負相關(guān)；應(yīng)用IGF-1上調(diào)Akt1的活性后，ES2和Caov3中PMS2表達水平明顯下降，且與IGF-1的作用存在時間依賴性；應(yīng)用特異性抑制劑API-2抑制Akt1的活性后，A2780中PMS2表達水平明顯升高，且與API-2的作用存在時間依賴性。結(jié)論人類卵巢癌細胞中PMS2蛋白的表達水平可能受活化Akt1的直接調(diào)控。

[關(guān)鍵詞]卵巢腫瘤；蛋白激酶類；胰島素樣生長因子1

Akt1又稱蛋白激酶B(protein kinase B,PKB)，是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，它是細胞生存信號通路PI3K/Akt的樞紐分子，Akt1活化后可通過磷酸化作用，活化其下游生長因子及其旁路分子，從而抑制細胞凋亡、促進細胞周期、促使細胞侵襲和轉(zhuǎn)移，促進血管生成等生物學(xué)效應(yīng)。Akt1存在兩個磷酸化位點Thr308和Ser473，只有當Ser473活化后Akt1才能完全活化，Akt1通過磷酸化下游靶分子中保守序列RXRXXS/TB(X:任意氨基酸；R:精氨酸；B:疏水氨基酸)發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)[1]。

PMS2是MMRs蛋白家族中的重要一員，它在保持基因組穩(wěn)定性中起至關(guān)重要的作用。PMS2基因突變或表達缺失與HNPCC及15%的實體腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[2]。然而有關(guān)PMS2與腫瘤相關(guān)性報道不盡相同，有研究證實：前列腺癌中PMS2表達異常增高[3]。因此，研究PMS2蛋白的表達調(diào)控及穩(wěn)定性，可能成為新的腫瘤防治靶點。應(yīng)用DNAmanda軟件分析發(fā)現(xiàn)：PMS2蛋白中存在Akt1識別及磷酸化的共有基因序列YPRPRGT156TVSV。因此推測Akt1可能通過活化共有序列中T156位點調(diào)控PMS2蛋白的表達及其穩(wěn)定性。

本研究通過Western blot技術(shù)檢測不同人類卵巢癌細胞株中Akt1、P-Akt S473和PMS2蛋白的表達水平；應(yīng)用Akt1激動劑和Akt1特異的抑制劑調(diào)節(jié)其活化水平，檢測PMS2的蛋白表達變化情況。初步探討PMS2蛋白與活化Akt1的關(guān)系，為進一步研究活化的Akt1與PMS2的作用機制奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1細胞培養(yǎng)將A2780、Caov3，C13*和ES2卵巢癌細胞株于10 %胎牛血清RPMI-1640中培養(yǎng)，每2天傳代1次，選擇生長狀態(tài)好的細胞進行試驗。

1.2Western blot檢測PMS2、Akt1和P-Akt S473的表達各組細胞中加RIPA，超聲裂解，BCA法檢測蛋白濃度，SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜于PVDF膜，室溫封閉1 h，加入Akt1抗體(CST)、P-Akt S473抗體(CST)、PMS2抗體(Epitomics)、GAPDH抗體(CST)，稀釋度均為1∶1 000，4 ℃過夜，加二抗(稀釋度1∶5 000)室溫孵育1 h，曝光，利用Quantity-one軟件進行分析，本試驗重復(fù)3次。

1.3Akt1活性上調(diào)選取已驗證低Akt1活化狀態(tài)的ES2及Caov3卵巢癌細胞，于無血清培養(yǎng)基中饑餓過夜；應(yīng)用Akt1活化劑胰島素樣生長因子-1(IGF-1,100 ng/mL)刺激細胞[4-6]，觀察Akt1的活化是否與IGF-1作用存在時間依賴性。

1.4Akt1活性下調(diào)選取已驗證高Akt1活化的A2780卵巢癌細胞，于無血清培養(yǎng)基中饑餓過夜；應(yīng)用Akt1特異抑制劑API-2 4 μM抑制其活性，觀察Akt1活性抑制是否與API-2存在時間依賴性。

2結(jié)果

2.1Western blot檢測不同卵巢癌細胞株中Akt1、P-Akt S473和PMS2的表達情況P-Akt S473在卵巢癌細胞株ES2中表達缺失(圖1)。PMS2、Akt1和P-Akt S473蛋白在A2780、Caov3及C13*細胞株中均表達，且表達水平不一。如圖1示，C13*、Caov3、ES2細胞株中P-Akt S473表達處于低水平，與此同時PMS2蛋白高水平表達；A2780細胞株中，P-Akt S473蛋白表達明顯增高，但伴隨PMS2蛋白的低表達。因相關(guān)報道證實，Hela宮頸癌細胞株中既無MMR蛋白表達缺失[7]，又無Akt1蛋白異常活化[8]，故本試驗中將其作為陽性對照。綜上所述，在不同的卵巢癌細胞株中，P-Akt S473蛋白高表達對應(yīng)PMS2蛋白低表達，Akt1低活化水平對應(yīng)PMS2蛋白高表達。卵巢癌細胞株中Akt1的活化形式P-Akt S473蛋白與PMS2蛋白表達水平呈負相關(guān)。

GAPDH：內(nèi)參照，Hela：陽性對照。

圖1Western Blot檢測卵巢癌細胞中PMS2，Akt1和P-Akt S473蛋白的表達水平

2.2Western Blot 檢測不同卵巢癌細胞中Akt1活化與PMS2蛋白表達的關(guān)系

2.2.1激活A(yù)kt1后卵巢癌細胞中PMS2蛋白表達水平為進一步檢驗Akt1的活性是否與其下游PMS2蛋白表達相關(guān)，應(yīng)用Akt1激動劑IGF-1上調(diào)Akt1蛋白激酶活性，檢測卵巢癌細胞株中PMS2蛋白表達情況。試驗結(jié)果表明：應(yīng)用100 ng/mL IGF-1作用于卵巢癌細胞ES2和Caov3后活化Akt1蛋白的表達水平明顯增高，且與IGF-1作用呈時間依賴性；活化的Akt1表達上調(diào)卵巢癌細胞株中PMS2的蛋白表達水平明顯下降，且亦存在時間依賴性，結(jié)果見圖2。

2.2.2抑制Akt1活性后卵巢癌細胞中PMS2蛋白表達水平為進一步檢測抑制卵巢癌細胞中Akt1活性后PMS2蛋白表達變化情況，應(yīng)用Akt1特異抑制劑API-2作用于卵巢癌細胞A2780不同時間，如圖3示：API-2可使卵巢癌細胞A2780中P-Akt S473的表達明顯下調(diào)，且存在時間依賴性；在卵巢癌細胞A2780中API-2作用48 h對Akt1活性抑制最明顯，PMS2蛋白表達達峰值。

A：在PMS2高表達的ES2細胞株中，IGF-1上調(diào)P-AktS473表達水平，且呈時間依賴性；Akt1活化后PMS2蛋白的表達明顯下降，亦存在時間依賴性。B：Caov3與ES2 細胞中IGF-1上調(diào)Akt1活性后PMS2蛋白表達水平明顯下調(diào)。

圖2不同卵巢癌細胞株中活化Akt1后PMS2的蛋白表達水平

圖3　Western Blot 檢測卵巢癌細胞中PMS2的表達

3討論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有明顯的遺傳傾向及相關(guān)性。DNA錯配修復(fù)即MMR系統(tǒng)，它是生物進化過程中演化出一種高度保守的錯配修復(fù)系統(tǒng)。MMR不僅能夠識別和修復(fù)DNA重組和復(fù)制過程中的單個堿基錯配，還可矯正小片段DNA聚合酶滑鏈的插入和缺失(IDLs)，以保持整個基因組的穩(wěn)定性及高度保真性；MMR亦可通過誘導(dǎo)細胞凋亡抑制細胞癌變[9]。人類對MMR的認識源于對Ecoli的研究[10]，且MMR的缺失與人類多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，如：宮頸癌、乳腺癌、兒童腫瘤綜合征、Turcot綜合征[11-14]等。

在對散發(fā)性結(jié)直腸癌的研究中首次發(fā)現(xiàn)人類腫瘤錯配修復(fù)基因，目前MMR家族公認有MutS同源物hMSH2～hMSH6及MutL的同源物hMLH1、hMLH3、hPMS1和hPMS2。只有當錯配識別復(fù)合物MutSα(hMSH2-hMSH6)和(或)MutSβ(hMSH2-hMSH3)與DNA序列上錯配位點結(jié)合后，使得ATP依賴水解酶構(gòu)象發(fā)生改變，復(fù)合物MutLα(MLH1-PMS2)與MutSα或MutSβ結(jié)合，才能激活MMR系統(tǒng)，從而發(fā)揮其基因錯配修復(fù)功能[15-16]。以往經(jīng)典研究發(fā)現(xiàn)，MMRs絕大部分突變發(fā)生在MLH1、MSH2和MSH6，發(fā)生于PMS1和PMS2少見。隨著研究深入，PMS2在人類腫瘤中的作用日益受關(guān)注，與其他錯配修復(fù)蛋白不同，PMS2具有高度不穩(wěn)定性，在人類多種腫瘤中表達缺失或功能缺失[17]。本試驗發(fā)現(xiàn)，在卵巢癌細胞株A2780、Caov3、ES2和C13*中PMS2均有表達，但在A2780中PMS2表達水平極低，伴隨高活化水平的Akt1，即PMS2的表達水平與活化的Akt1呈負相關(guān)。

Akt1是細胞生存通路PI3K/Akt的樞紐分子，廣泛存在于哺乳動物各組織中，參與細胞的生長、增殖及凋亡[18-19]。通常情況下，Akt1處于非激活狀態(tài)，只有它被上游激酶磷酸化完全活化后，磷酸化下游靶分子中保守序列，從而發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。Akt1異?；罨c多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸關(guān)系密切。在人類卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、骨髓瘤、直腸癌及腎細胞癌中Akt1異常活化；應(yīng)用抑制劑抑制Akt1磷酸化水平后，明顯抑制以上腫瘤的生長[20-23]。

大量研究證實，已知Akt1下游靶分子，如GSK3、FKHRL1、BAD及BRCA1等，均含有其磷酸化的保守序列RXRXXS/TB[4,24]。本研究前期實驗發(fā)現(xiàn)，PMS2蛋白中存在YPRPRGT156TVSV共有基序，這一結(jié)果提示蛋白PMS2可能被活化的Akt1磷酸化，影響穩(wěn)定性，進而影響其生物學(xué)功能。本研究發(fā)現(xiàn)，不同卵巢癌細胞株中蛋白PMS2及活化Akt1表達水平呈負相關(guān)，提示PMS2蛋白的表達水平可能受活化Akt1的直接調(diào)控，PMS2可能為PI3K/Akt信號通路下游新的靶分子，為人類卵巢癌的治療尋找新靶點奠定基礎(chǔ)。

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The expression and the relativity of PMS2 and P-Akt S473 in different human ovarian cancer cell lines

Jia Jinghui,Li Chundong,Chen Bing,Li Jingxuan,Tong Ying△

(1.Department of Obstetrics and Gynecology,Air Force General Hospital of PLA,Beijing 100142,China)

[Abstract]ObjectiveTo evaluate the expression and the relativity of PMS2,Akt1 and P-Akt S473 protein in A2780,Caov3,C13* and ES2 ovarian cancer cell lines.MethodsThe expression of PMS2,Akt1 and P-Akt S473 protein in A2780,Caov3,C13* and ES2 ovarian cancer cells was detected by Western Blot.After treated with IGF-1 (Akt1 activator) and API-2 (specific Akt1 inhibitor),Caov3,ES2 and A2780 cells were collected and the level of PMS2 was detected by Western Blot.ResultsPMS2,Akt1 and P-Akt S473 proteins were detected in all of the four ovarian cancer cell lines with varied expression levels,and the activity of Akt1 was inversely related to PMS2 expression in ovarian cancer cells.Exposed to Akt kinase stimulator IGF-1,ES2 and Caov3 cells were detected with a dramatically PMS2 decreasing.Meanwhile,the decreasing of PMS2 protein was time-dependent on IGF-1.Treated with API-2,Akt kinase specific inhibitor,A2780 was detected with PMS2 dramatically increasing,and the increasing of PMS2 protein was time-dependent on API-2.ConclusionIn ovarian cancer cells,PMS2 expression could be directly regulated by activated Akt1.

[Key words]ovarian neoplasms;protein kinases;insulin-like growth factor 1

doi:論著·基礎(chǔ)研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.09.010

作者簡介：賈靜輝(1982-)，博士，主治醫(yī)師，主要從事婦科腫瘤研究?！魍ㄓ嵶髡撸珽-mail:tongying7326@sina.com。

[中圖分類號]R737.31

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)09-1183-03

(收稿日期：2015-10-08修回日期：2015-12-26)