謝堂堂　王成云　林君峰　沈雅蕾　李燕華　褚乃清

(深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局工業(yè)品檢測技術(shù)中心，深圳 518067))

儀器應(yīng)用

超高效液相色譜法快速測定紡織品中5種異噻唑啉酮類抗菌劑

謝堂堂王成云林君峰沈雅蕾李燕華褚乃清

(深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局工業(yè)品檢測技術(shù)中心，深圳 518067))

摘要：建立了高效液相色譜分析方法，對紡織品中5種異噻唑啉酮類抗菌劑含量進(jìn)行了同時測定。樣品經(jīng)甲醇超聲萃取，提取液經(jīng)濃縮定容后，直接進(jìn)行高效液相色譜法測定，外標(biāo)法定量。該方法的檢出限為0.25～1.00mg/kg，加標(biāo)平均回收率為88.82～ 97.92%，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)精密度(RSD)為0.62～1.96%，實(shí)驗(yàn)室間精密度(RSD)為1.09～ 2.31%。采用該方法對市售紡織品中異噻唑啉酮類抗菌劑含量進(jìn)行測定，結(jié)果在6個樣品中檢出了不同含量的2-正辛基-4-異噻唑啉-3-酮(OI)。

關(guān)鍵詞：超高效液相色譜法紡織品異噻唑啉酮抗菌劑

1引言

異噻唑啉酮類抗菌劑是一類新型廣譜高效殺菌劑，廣泛應(yīng)用于紡織品、造紙、皮革、涂料、化妝品、玩具等領(lǐng)域[1-12]，目前大量使用的品種有2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮(MI)、5-氯-2甲基-4-異噻唑啉-3-酮(CMI)、1,2-苯并異噻唑-3-酮(BIT)、2-正辛基-4-異噻唑啉-3-酮(OI)、4,5-二氯-2-正辛基-4-異噻唑啉-3-酮(DCOI)等。鑒于其應(yīng)用廣泛，人們對其毒性進(jìn)行了大量研究后發(fā)現(xiàn)[13-16]，MI、CMI和BIT具有接觸致敏性，能引發(fā)接觸性皮炎。歐盟國家部分企業(yè)要求進(jìn)入歐盟市場的紡織品中OI含量不得高于10mg/kg，EN 71-9-2005規(guī)定MI、CMI、BIT的限量分別為10、10、5mg/kg，且MI、CMI總量不得超過15mg/kg，歐盟生物殺滅產(chǎn)品法規(guī)EU No.528/2012將DCOI列入管制范圍。異噻唑啉酮類抗菌劑可采用紫外-可見分光光度法[17，18]、高效液相色譜法[19-27]、氣相色譜法[28]、氣質(zhì)聯(lián)用法[23, 29-32]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[33-36]等方法測定，但文獻(xiàn)報(bào)道的測定對象均未涵蓋上述全部5種異噻唑啉酮類抗菌劑。盡快建立同時檢測紡織品中上述5種異噻唑啉酮類抗菌劑的方法，具有十分重要的意義。本實(shí)驗(yàn)選取真絲、亞麻、棉等紡織品進(jìn)行研究，以甲醇為溶劑進(jìn)行超聲萃取，萃取液濃縮定容后進(jìn)行UPLC分析，建立了同時測定紡織品中5種異噻唑啉酮類抗菌劑含量的高效液相色譜方法。

2試驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

標(biāo)準(zhǔn)品MI(純度100.0%，美國Sigma- Aldrich公司)；CMI(純度99.0%，德國Dr. Ehrenstorfer公司)；BIT(純度99.2%，美國Sigma-Aldrich公司)；OI(純度99.9%，美國Sigma-Aldrich公司)；DCOI(純度99.8%，日本東京化成株式會社)；色譜純甲醇(美國Tedia公司)；分析純甲醇、乙腈、正己烷、丙酮、乙酸乙酯、叔丁基甲醚、四氫呋喃、石油醚、二氯甲烷(廣州化學(xué)試劑廠)；水(二級水)。

Shimadzu LC- 20AD XR高效液相色譜儀(日本Shimadzu公司)；Heidolph 4003旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國Heidolph公司)；0.22μm濾膜(德國Membrane公司)；SB 25-12DTD超聲波清洗器(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

2.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱取適量的標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇配成質(zhì)量濃度約為2000μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液儲備液。分別移取適量體積的各標(biāo)準(zhǔn)溶液儲備液，用甲醇配成混標(biāo)儲備液。混標(biāo)儲備液中各組分的質(zhì)量濃度分別為242.2(MI)、242.7(CMI)、240.7(BIT)、242.9(OI)、244.8μg/mL(DCOI)。測定時用甲醇逐級稀釋，配成混標(biāo)工作液。

2.3樣品處理

將樣品剪碎成小于5mm×5mm的小塊，混勻。稱取1.0g樣品，置于磨口錐形瓶中，加入20mL甲醇，在45℃超聲萃取20min，過濾，殘?jiān)俅斡?0mL甲醇超聲萃取，合并萃取液，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至近干，用甲醇定容至5mL，經(jīng)0.22μm濾膜過濾后進(jìn)行UPLC分析。必要時，先進(jìn)行稀釋或濃縮。

2.4分析條件

Shim-pack XR-ODS色譜柱(100mm×3.0mm×2.2μm)，柱溫40℃，流速0.4mL/min，進(jìn)樣量1.0μL，洗脫梯度見表1，檢測波長分別為275(MI)、277(CMI)、319(BIT)、279(OI)、283nm(DCOI)。

表1　洗脫梯度

3結(jié)果與討論

3.1萃取條件優(yōu)化

以甲醇為萃取溶劑，分別在30、35、40、45、50、55、60℃下對3個陽性樣品(材質(zhì)分別為真絲、亞麻布、棉布，均含有OI)超聲萃取20min，觀察OI萃取量隨萃取溫度的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對于3個陽性樣品，超聲萃取溫度對萃取量影響不大?？紤]到實(shí)驗(yàn)室通常的溫度和控制溫度的便利，超聲萃取溫度選定為40℃。

以甲醇為萃取溶劑，40℃下對3個陽性樣品分別超聲萃取5、10、15、20、25、30、35、40min，觀察OI萃取量隨超聲時間的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對于3個陽性樣品，萃取量均隨萃取時間的增加而增加，并在20min時達(dá)到最大值，萃取時間繼續(xù)增加時，萃取量均反而緩慢下降。因此，超聲萃取時間確定為20min。

以甲醇為萃取溶劑，40℃下對3個陽性樣品超聲萃取20min，甲醇體積分別為10、15、20、25、30mL，觀察OI萃取量隨萃取溶劑體積的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對于3個陽性樣品，萃取量均在溶劑體積為20mL時達(dá)到最大值。因此，超聲萃取溶劑體積確定為20mL。

為綜合考慮萃取時間、萃取溫度和萃取溶劑體積對萃取量的影響，按表2的條件進(jìn)行了正交實(shí)驗(yàn)，并給出了各條件下3個陽性樣品的萃取量。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，條件5#下3個陽性樣品的萃取量均最大。因此，超聲萃取條件最終優(yōu)化如下：以20mL甲醇為萃取溶劑，45℃下超聲萃取20min。

表2　超聲萃取條件正交實(shí)驗(yàn)　 mg/kg

以20mL甲醇為萃取溶劑，45℃下對3個陽性樣品超聲萃取20min，連續(xù)萃取3次，測定每次的萃取量，以連續(xù)3次萃取量為參照，計(jì)算每次萃取量占總萃取量的比例，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，棉布第1次萃取量占總萃取量的94.58%，第2次萃取量占總萃取量的5.42%；亞麻布第1次萃取量占總萃取量的93.28%，第2次萃取量占總萃取量的6.72%，真絲第1次萃取量占總萃取量的93.78%，第2次萃取量占總萃取量的6.22%。對于3個陽性樣品，第3次萃取量均未檢出OI，可見，經(jīng)2次連續(xù)萃取，樣品中的OI均已被萃取完全。因此，確定采用2次連續(xù)萃取方式。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，通?？刹捎眉状?、水、乙腈、四氫呋喃等溶劑來提取異噻唑啉酮等抗菌劑，為了確定合適的萃取溶劑，分別以水、甲醇、乙腈、正己烷、丙酮、乙酸乙酯、叔丁基甲醚、四氫呋喃、石油醚和二氯甲烷等10種常見溶劑作為萃取溶劑，對3個陽性樣品(材質(zhì)分別為真絲、亞麻和棉)進(jìn)行2次連續(xù)超聲萃取，觀察不同溶劑時萃取量的變化，結(jié)果見表3。從表3可知，對于3個陽性樣品，甲醇的萃取效果均最好，特別是真絲樣品，甲醇的萃取效果遠(yuǎn)高于其他溶劑。因此，萃取溶劑最終確定為甲醇。

表3　不同溶劑的超聲萃取效果　mg/kg

3.2分析條件的優(yōu)化

在210～350nm范圍測定各標(biāo)準(zhǔn)品溶液的紫外-可見吸收光譜，發(fā)現(xiàn)各組分在此范圍內(nèi)各有一個強(qiáng)吸收峰，其波長分別為275(MI)、277(CMI)、319(BIT)、279(OI)、283nm(DCOI)，如圖1所示。選擇最大吸收波長作為檢測波長時，相應(yīng)的吸光度最大，有利于提高各組分的檢測靈敏度。因此選擇各組分的最大吸收波長作為檢測波長。

圖1　標(biāo)準(zhǔn)溶液的紫外-可見吸收光譜1.MI; 2.CMI; 3.OI; 4.DCOI; 5.BIT

在反相液相色譜中，流動相通常使用水/甲醇、水/乙腈等強(qiáng)極性流動相，分別考察了水/乙腈、水/甲醇2種流動相，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用水/甲醇流動相時基線平穩(wěn)，色譜峰峰形尖銳，對稱性好，保留時間和峰面積的精密度和重現(xiàn)性較好；使用水/乙腈流動相時，基線漂移比較嚴(yán)重，色譜峰峰形較差，且乙腈毒性大于甲醇，因此選擇水/甲醇作為流動相。

色譜柱的柱壓隨流動相的組成、流速和色譜柱溫度的改變而變化，流動相中水的比例越高、柱溫越低、流速越大時，柱壓越高。色譜柱通常有一定的柱壓承受范圍，在選擇色譜分析參數(shù)時，最大柱壓應(yīng)在可承受柱壓范圍內(nèi)。流動相的組成、流速、色譜柱溫度均直接影響分離效果和方法靈敏度，流速較小時，柱壓較小，各組分的保留時間和峰面積均較大，但峰形展寬，分離度下降；柱溫升高時，峰面積變化不明顯，但柱壓明顯降低，各組分的保留時間變小，峰形變窄，但各色譜柱均有一定的使用溫度范圍，過高的柱溫會損傷色譜柱。改變流速、洗脫梯度和柱溫，觀察各組分的分離效果及峰面積的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用2.4節(jié)中的色譜分析條件時，各組分之間分離完全，各色譜峰峰形尖銳，對稱性好。圖2是該條件下5種異噻唑啉酮類抗菌劑的UPLC圖。

圖2　5種混標(biāo)的UPLC圖1.MI; 2.CMI; 3.BIT; 4.OI; 5.DCOI

3.3方法的線性關(guān)系和檢出限

用甲醇逐級稀釋混標(biāo)儲備液，配制一系列的混標(biāo)工作液，按上述條件進(jìn)行測試，計(jì)算各組分的色譜峰面積，用色譜峰面積(A)對質(zhì)量濃度(ρ)進(jìn)行回歸，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對于每個組分，其色譜峰面積(A)在一定質(zhì)量濃度(ρ繃)范圍內(nèi)均與質(zhì)量濃度(ρ)之間存在良好的線性關(guān)系，表4給出了各組分的線性關(guān)系。按公式LODi=3Sb/b計(jì)算儀器的檢出限(LODi)，式中Sb為測試方法的空白標(biāo)準(zhǔn)偏差，該參數(shù)通過20次平行測試得到，b為校準(zhǔn)曲線的斜率。方法檢出限(LODm) =V×LODi，式中V為最終定容體積。計(jì)算結(jié)果見表4。

表4　線性關(guān)系和檢出限

3.4方法的回收率和精密度

以不含目標(biāo)化合物的棉、亞麻、真絲、滌綸作為空白基質(zhì)，分別添加高(10倍LOD)、中(2倍LOD)、低(1倍LOD)3個濃度水平的混標(biāo)，每個濃度水平制備9個平行樣，按上述方法進(jìn)行測定，計(jì)算方法的加標(biāo)回收率和平均加標(biāo)回收率。結(jié)果表明，5種異噻唑啉酮類抗菌劑的平均加標(biāo)回收率為88.82～97.92%。

對3個陽性樣品(材質(zhì)分別為棉、亞麻、真絲)中的抗菌劑OI的含量進(jìn)行9次平行樣測試，計(jì)算方法的精密度(RSD)，測試結(jié)果見表5，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)精密度(RSD)為0.62～ 1.96%。由國內(nèi)9家實(shí)驗(yàn)室對這3個陽性樣品中抗菌劑OI含量進(jìn)行測定，測試結(jié)果也列于表5中，經(jīng)計(jì)算，實(shí)驗(yàn)室間精密度(RSD)為1.09～2.31%。

表5　方法精密度實(shí)驗(yàn) 　mg/kg

3.5實(shí)際樣品測試

采用本實(shí)驗(yàn)建立的方法對256個市售紡織品進(jìn)行測定，結(jié)果在6個樣品中檢出了不同含量的OI，這6個紡織品分別為平紋機(jī)織染色女式棉上衣、純棉女式短袖襯衫、針織真絲女式長袖套頭衫、梭織真絲連衣裙、梳織亞麻男式襯衫、梳織亞麻女式長袖襯衫，其含分別為9941.7、800.3、734.3、6527.1、8828.4、328.3mg/kg。圖3是純棉女式短袖襯衫的UPLC圖，該樣品中檢出OI，其含量為800.3mg/kg。

圖3　實(shí)際樣品的UPLC圖1.OI

4結(jié)論

建立了超高效液相色譜方法，可同時測定紡織品中5種異噻唑啉酮類抗菌劑的含量。方法簡便快捷，分析過程耗時少，靈敏度高，檢測通量大，可滿足紡織品中異噻唑啉酮類抗菌劑含量檢測工作的需要。

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Rapid determination of five kinds of isothiazolinones antibacterial agents in textiles by UPLC.

Xie Tangtang,Wang Chengyun, Lin Junfeng, Shen Yalei, Li Yanhua, Zhu Naiqing

(TheTestingandTechnologyCenterforIndustrialProducts,ShenzhenEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Shenzhen518067,China)

Abstract:Isothiazolinones in textiles were extracted using methanol as the extraction solvent. Then the extract was concentrated and detected by UPLC, the external standard method was used for quantification. The limits of detection (LODs) varied from 0.25mg/kg to 1.00mg/kg. The spiked average recoveries changed from 88.82% to 97.92%. The relative standard deviation of intra-laboratory changed from 0.62% to 1.96% while the relative standard deviation of inter-laboratory changed from 1.09% to 2.31%. The proposed method was used for the determination of isothiazolinones antibacterial agents in textiles on sale, different content of 2-n-octyl-4-isothiazolin-3-one were detected in six samples.

Key words:UPLC; textile; isothiazolinone; antibacterial agent

基金項(xiàng)目：國家認(rèn)監(jiān)委科研制標(biāo)項(xiàng)目(2013B048)。

作者簡介：謝堂堂，男，1982年出生，博士，高級工程師，研究方向?yàn)檩p紡產(chǎn)品中有毒有害物質(zhì)的儀器分析， tangtangxie@139.com。

DOI:10.3936/j.issn.1001-232x.2016.03.007