楊　俊，吳　瓊，王九峰，劉光男（.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京海淀0093；.內(nèi)蒙古烏蘭察布市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，內(nèi)蒙古烏蘭察布0000）

?

經(jīng)久不愈奶牛臨床型乳房炎病例的病原菌分離鑒定

楊俊1，吳瓊1，王九峰1，劉光男2
（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京海淀100193；2.內(nèi)蒙古烏蘭察布市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，內(nèi)蒙古烏蘭察布012000）

摘要：為了研究全身及局部應(yīng)用抗生素治療臨床型乳房炎后病原菌的構(gòu)成及比例，本試驗(yàn)對全身及局部灌注治療后仍未痊愈的奶牛進(jìn)行基本信息匯總并對乳樣中病原菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)分離鑒定及16S rDNA基因序列分析。結(jié)果表明，經(jīng)過治療仍可分離到大量大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及綠膿假單胞菌等易產(chǎn)生耐藥性的細(xì)菌。本試驗(yàn)為臨床上經(jīng)久不愈的乳房炎病例的治療提供了參考方法。

關(guān)鍵詞：奶牛乳房炎；病原菌；分離鑒定；16S rDNA

本研究對2015年4月北京市某奶牛場的患臨床型乳房炎的奶牛經(jīng)過全身應(yīng)用抗生素后經(jīng)久不愈病例奶樣的病原菌的分離與鑒定，了解治療效果不佳病牛的病原菌分離情況，為尋找更好的治療經(jīng)久不愈乳房炎病例及控制奶牛乳房炎的發(fā)展提供依據(jù)。

1　試驗(yàn)試劑與設(shè)備

1.1主要試劑血平板、7.5%甘露醇氯化鈉瓊脂、伊紅美蘭（EMB）瓊脂、S.S.瓊脂及葡萄球菌生化鑒定管，購自北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司，厭氧袋，購自日本三菱化學(xué)株式會社；PCR體系，購自北京博邁德基因技術(shù)有限公司。

1.2主要儀器與設(shè)備TCYQ型恒溫振蕩培養(yǎng)箱，購自太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；SW-CJ-1FD型單人單面垂直凈化工作臺，購自蘇州智凈凈化設(shè)備有限公司；DHP-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱，購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Model#：99 02型PCR儀，購自美國ABI公司；DYY-6C型電泳儀，購自北京市六一儀器廠；凝膠成像儀，購自美國Alpha Innotech公司；立式高壓蒸汽滅菌器YXQ-LS-50SⅡ，購自上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

2　材料與方法

2.1試驗(yàn)材料采自北京市某奶牛場9頭患臨床型乳房炎并經(jīng)過全身及局部用藥仍未痊愈的荷斯坦泌乳牛9個(gè)乳區(qū)乳樣，并取3個(gè)健康乳區(qū)乳樣進(jìn)行對照試驗(yàn)。首先乳區(qū)消毒后，棄去前3把奶，每個(gè)乳區(qū)采30～40 mL盛于經(jīng)過高壓滅菌的離心管中并作好標(biāo)記，置于冰盒，盡快送往實(shí)驗(yàn)室并進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2試驗(yàn)方法（1）將乳樣涂于血平板：先取乳樣劃線接種于血平板上，另用厭氧袋做一份厭氧培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h；（2）將乳樣同時(shí)接種于選擇性培養(yǎng)基：7.5%甘露醇氯化鈉瓊脂、EMB、S.S.瓊脂選擇性培養(yǎng)基，24 h后觀察在各個(gè)培養(yǎng)基上的結(jié)果，統(tǒng)計(jì)常見細(xì)菌在各乳區(qū)的分布情況；（3）?。?）中特異性菌落，及選擇性培養(yǎng)基中非特異菌落溶解于生理鹽水中進(jìn)行16S rDNA通用引物PCR后，測序，根據(jù)測序結(jié)果對細(xì)菌進(jìn)行生化試驗(yàn)。上游引物序列[1]：5′-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3′，下游引物序列：5′-TAC GGY?TAC CTT GTT ACG ACT T-3′，目的條帶1 465 bp。

3　結(jié)果

3.1取樣奶牛及乳區(qū)信息由表1可知，在患病的9個(gè)乳區(qū)中處于圍產(chǎn)期的有2個(gè)（22%），泌乳早期的有3個(gè)（33%），中期的有3個(gè)（33%），后期有1個(gè)（11%），9頭患病牛中只有2個(gè)體溫高于正常，泌乳量除編號5外均明顯降低。

表1　取樣奶牛及乳區(qū)基本信息

3.2細(xì)菌分離結(jié)果由表2可知，綜合7.5%甘露醇氯化鈉瓊脂、EMB、S.S.瓊脂選擇性培養(yǎng)基結(jié)果、單菌落16S PCR、葡萄球菌屬細(xì)菌生化試驗(yàn)結(jié)果，從12份乳樣中共分離出16種，27株細(xì)菌。其中葡萄球菌屬細(xì)菌最多，共有16株，共覆蓋9個(gè)乳區(qū)（75%），其中占發(fā)病的9個(gè)乳區(qū)中7個(gè)（78%），健康的3個(gè)乳區(qū)占2個(gè)（67%），其中又以表皮葡萄球菌最多，覆蓋了8個(gè)乳區(qū)，占了所有乳區(qū)的67%，乳房炎最常見的大腸桿菌與金黃色葡萄球菌覆蓋率分別為58%、33%。

表2　分離鑒定出的細(xì)菌種類及分離率

4　討論

雖然此次分離出多種細(xì)菌，但是由于目前很多細(xì)菌仍不能培養(yǎng)仍有可能漏檢部分致病菌，原因如下：細(xì)菌相互干擾；優(yōu)勢菌對劣勢菌的抑制作用；一般根據(jù)固體培養(yǎng)基上細(xì)菌的大小、顏色以及形態(tài)判斷，因此若某些細(xì)菌有相似的形態(tài)特征容易漏檢；濃度低也是培養(yǎng)陰性的重要原因；還有可能是此病原體為目前條件下不可培養(yǎng)或此種細(xì)菌在該培養(yǎng)基下不能生長或該培養(yǎng)基缺少此種細(xì)菌生長所需物質(zhì)，可以用多重PCR或高通量測序鑒別，以獲得更全面的信息[2]。乳房炎發(fā)病率與管理和養(yǎng)殖環(huán)境的好壞密切相關(guān)，但在一定的管理和養(yǎng)殖條件下乳房炎發(fā)病率又與年齡、胎次、泌乳期高度相關(guān)，由于此次樣本量較少，經(jīng)久不愈乳房炎與年齡、泌乳期、胎次的關(guān)系并不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義需在以后的試驗(yàn)中考慮到這一點(diǎn)。據(jù)報(bào)道有2%～55%乳牛在泌乳階段發(fā)生乳房炎[3]?？股丿煼ㄔ诿谌槠陂g對許多導(dǎo)致乳房炎的病原體治愈率比較低，特別是對于金黃色葡萄球菌，經(jīng)常導(dǎo)致慢性和復(fù)發(fā)性感染[4]，本次試驗(yàn)所用樣品均為抗生素長期誘導(dǎo)所致，全身療法（氨芐西林、四環(huán)素、頭孢噻呋等靜脈注射）配合林可霉素乳房灌注，但是治療效果不佳，因此有必要將本次試驗(yàn)所得菌株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)以為開辟用于治療導(dǎo)致久治不愈乳房炎細(xì)菌的新途徑。國內(nèi)外很多研究者已經(jīng)將目光投向了抗生素的替代品，已知乳酸桿菌對一些感染有保護(hù)作用。這種能力與上皮細(xì)胞的粘附性能有關(guān)，通過特定的競爭或位阻抑制病原體粘附，以及分泌細(xì)菌素、H2O2、或其他抗菌復(fù)合物，競爭營養(yǎng)物質(zhì)和

調(diào)節(jié)宿主免疫應(yīng)答來抑制病原體的生長[5]，因此乳酸桿菌在乳房炎的治療上有望替代抗生素。據(jù)（Damien S. Bouchard等）報(bào)道，他們通過探究乳酸桿菌菌液中到底是細(xì)菌、培養(yǎng)液、乳酸、pH值、蛋白是哪種成分對金黃色葡萄球菌粘附及侵襲造成的影響，得出只有與活的乳酸桿菌接觸才能抑制金黃色葡萄球菌的侵襲，加熱滅活的乳酸桿菌只能抑制金黃色葡萄球菌的粘附的結(jié)論[9]。細(xì)菌入侵乳腺上皮細(xì)胞是細(xì)菌導(dǎo)致乳房炎的重要機(jī)制，因此有人試圖通過抑制細(xì)菌的內(nèi)化作用來治療及預(yù)防乳房炎，其中研究抑制金黃色葡萄球菌的內(nèi)化比較多，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)丁酸鈉、杜鵑素、麝香草酚、短鏈脂肪酸（丙酸和丁酸），乳酸桿菌還有VD3都能抑制金黃色葡萄球菌內(nèi)化入乳腺上皮細(xì)胞及調(diào)節(jié)抗菌肽基因的表達(dá)[6-7]。

大腸桿菌、克雷伯氏菌、乳房鏈球菌是導(dǎo)致乳房炎最常見細(xì)菌，其次是化膿隱秘桿菌、停乳鏈球菌，再次為金黃色葡萄球菌[8]，在健康或亞臨床乳樣中，厭氧菌、乳房鏈球菌、金黃色葡萄球菌所占比例明顯低于臨床型乳房炎[9]。此次細(xì)菌分離結(jié)果表明，經(jīng)過上述治療像鏈球菌、克雷伯氏菌等乳房炎常見的病原菌均未分離到，余下的是葡萄球菌屬、大腸桿菌、綠膿假單胞菌等易產(chǎn)生耐藥性的細(xì)菌，這可能是抗生素選擇的結(jié)果，可以進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)后進(jìn)行聯(lián)合用藥治療。據(jù)Georgios Oikonomou[9]等報(bào)道，健康乳汁與乳房炎乳汁中細(xì)菌種類均很多，其研究結(jié)果表明，健康乳樣中不含有大腸桿菌與克雷伯氏菌，這與本次試驗(yàn)結(jié)果相悖，在10號乳區(qū)中分離到了大腸桿菌，這可能是由于僅憑臨床癥狀判斷乳房炎的有無，沒有采用SCC、CMT等方法檢測是否患有隱性乳房炎，因此以后的檢測需輔助SCC等指標(biāo)。

參考文獻(xiàn)：

[1] Walcher M，Skvoretz R，Montgomery-Fullerton M，et al.Descrip?tion of an unusual Neisseria meningitidis isolate containing and expressing Neisseria gonorrhoeae-Specific 16S rRNA gene se?quences[J].J Clin Microbiol，2013，51（10）：3199-3206.

[2] Taponen S，Salmikivi L，Simojoki H，et al.Real-time polymerase chain reaction-based identification of bacteria in milk samples from bovine clinical mastitis with no growth in conventional cul?turing[J].J Dairy Sci，2009，92（6）：2610-2617.

[3] Quigley L，O'sullivan O，Stanton C，et al.The complex microbio?ta of raw milk[J].FEMS Microbiol Rev，2013，37（5）：664-698.

[4] Damien S，Bouchard L R，Nadia B，et al.Inhibition of Staphylo?coccus aureus Invasion into Bovine Mammary Epithelial Cells by Contact with Live Lactobacillus casei[J] . Appl and EnvironMicro?biol，2013，79（3）：877-885.

[5] Reid G . Use of Lactobacillus to prevent infection by pathogenic bacteria[J].Microbes infect，2002，4：319-324.

[6] Wei Z，Zhou E，Guo C，et al.Thymol inhibits Staphylococcus aureus internalization intobovine mammary epithelial cells by inhibiting NF-kappaB activation[J].Microb Pathog，2014，71-72：15-9.

[7] Yang Z，F(xiàn)u Y，Liu B，et al.Farrerol regulates antimicrobial pep?tide expression and reduces Staphylococcus aureus internalization into bovine mammary epithelial cells[J] . Microb Pathog，2013，65：1-6.

[8] Oikonomou G，Machado V S，Santisteban C，et al . Microbial di?versity of bovine mastitic milk as described by pyrosequencing of metagenomic 16s rDNA[J].PLoS One，2012，7（10）：e47671.

[9] Oikonomou G，Bicalho M L，Meira E，et al . Microbiota of cow's milk；distinguishing healthy，sub-clinically and clinically dis?eased quarters[J].PLoS One，2014，9（1）：e85904.

Isolation and identification of main pathogenic bacteria causing prolonged unhealed bovineclinical mastitis

YANG Jun1，WU Qiong1，WANG Jiu-feng1，LIU Guang-nan2
（1.College of Veterinary Medicine，China Agricultural University，Beijing 100193，China；2.Inner Mongolia Wulanchabu City Animal Health Inspection，Wulanchabu 012000，China）

Abstract：The aim of the present study is to detect the composition and proportion of pathogenic bacteria in milk samples from prolonged unhealed clinical mastitis cows after systemic and local application of antibiotics .We collected the basic informa?tion of the prolonged unhealed cows，and identified the pathogens through the colony morphology and 16S rDNA gene sequencing. The results showed that pathogenic bacteria（Escherichia coli，Staphylococcus aureus and Bacillus pyocyaneus）were resistant to an?tibiotics.This study provides an approach to treat prolonged unhealed clinical mastitis.

Key words：Bovine mastitis；Pathogenic bacteria；Identification；16S rDNA

中圖分類號：S858.23

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：0529-6005（2016）05-0087-02

收稿日期：2016-01-29

基金項(xiàng)目：奶牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系北京市創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（BAIC0-62016）

作者簡介：楊?。?990-），男，碩士生，從事臨床獸醫(yī)研究，E-mail：yang_jun1992@126.com

通訊作者：劉光男，E-mail：wsy4886061@163.com

Corresponding author：LIU Guang-nan