張琴靜，陳愛琴，寧松，高超，蔣春艷，崔毓桂，陳娟，覃蓮菊，劉嘉茵

(南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，南京　210029)

·實(shí)驗(yàn)研究·

建立不同類型干細(xì)胞并比較其分泌細(xì)胞因子的水平

張琴靜，陳愛琴，寧松，高超，蔣春艷，崔毓桂，陳娟，覃蓮菊*，劉嘉茵*

(南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，南京210029)

【摘要】目的比較不同類型干細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的水平，探討其潛在的臨床意義。方法建立人類胚胎干細(xì)胞(hESCs)、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(UMSCs)、羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞(AMSCs)株系；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)分析干細(xì)胞分泌細(xì)胞因子水平：(1)促炎因子，包括白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-8(IL-8)和腫瘤壞死因子(TNF-α)；(2)抑炎因子白細(xì)胞介素-10(IL-10)；(3)生長(zhǎng)因子，包括肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、干細(xì)胞因子(SCF)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)；(4)基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-1及其抑制劑TIMP-1；(5)血管形成因子(Angiogenin)，白血病抑制因子(LIF)以及骨形成蛋白(BMP4)。結(jié)果女性UMSCs分泌生長(zhǎng)因子、血管生成因子、造血因子、抑炎因子等的能力顯著強(qiáng)于hESCs、AMSCs(P<0.05)；女性hESCs、男性UMSCs分泌金屬蛋白酶的水平顯著高于其它干細(xì)胞(P<0.05)。結(jié)論女性UMSCs可能具有更好的促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、改善血供的能力；而女性hESCs、男性UMSCs則可能具有更強(qiáng)的降解結(jié)締組織的能力。

【關(guān)鍵詞】人胚胎干細(xì)胞；人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞；人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；細(xì)胞分泌因子

Methods： The cell lines of human embryonic stem cells (hESCs)，umbilical cord mesenchymal stem cells (UMSCs) and amniotic mesenchymal stem cells (AMSCs) were established and identified. The expressions of secretory cytokines，such as：(1) pro-inflammatory factors of IL-6，IL-8 and TNF-α；(2) anti-inflammatory factor of IL-10；(3) Growth factors (HGF，BDNF，SCF and VEGF)；(4) matrix metalloprotein (MMP-1) and its inhibitor TIMP-1；(5) angiogenic factor，LIF and BMP4 were determined by real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR).

Results： The expresses of growth factors，angiogenic factor，LIF and IL-10 in female UMSCs were significantly higher than those in hESCs and AMSCs(P<0.05). The expressions of MMP-1 in female hESCs and male UMSCs were significantly higher than those in other stem cell lines (P<0.05).

Conclusions： Female UMSCs may have stronger capacity to promote cell growth and improve blood supply. Female hESCs and male UMSCs may be more powerful in degradation of connective tissue.

(JReprodMed2016，25(6)：528-539)

干細(xì)胞是一種具有自我更新、增殖能力的特殊細(xì)胞，且具有多向分化潛能，在特定培養(yǎng)條件下能分化為特定類型的細(xì)胞[1]。最近幾年，認(rèn)為干細(xì)胞治療是能夠修復(fù)和恢復(fù)受傷組織正常功能，具有潛力的替代治療方法[2]。卵巢功能早衰(POF)是引起女性不孕的常見原因，同時(shí)也增加了女性退行性疾病的發(fā)生率，如心血管疾病、骨質(zhì)疏松、認(rèn)知障礙[3-5]。針對(duì)POF的治療，目前廣泛接受的是激素替代療法(HRT)[6]，但該療法大大增加了靜脈血栓、卵巢癌和乳腺癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[7-8]。另一類治療方法是將卵巢組織、卵母細(xì)胞或胚胎進(jìn)行冷凍保存[9]，但依舊不能根治POF。研究顯示，移植間充質(zhì)干細(xì)胞可恢復(fù)雌性POF模型小鼠的卵巢功能[10-13]。

研究顯示，移植的間充質(zhì)干細(xì)胞是通過分泌細(xì)胞因子，而不是通過分化為新的卵母細(xì)胞改善受損卵巢的功能[14]。此外，直接注射細(xì)胞培養(yǎng)上清可改善受損器官的功能[15-16]。目前認(rèn)為，干細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子中，促炎因子可促進(jìn)炎癥反應(yīng)和組織損傷；而機(jī)體釋放的抗炎因子，如白細(xì)胞介素-10(IL-10)，具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)的作用[17]；細(xì)胞生長(zhǎng)因子則主要促進(jìn)細(xì)胞增殖與分化，但不同的細(xì)胞因子也具有其特異的生物學(xué)功能，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)具有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂、誘發(fā)血管形成及增加血管通透性的功能[18]，而肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)則在細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、侵襲轉(zhuǎn)移、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用[19]；金屬蛋白酶及其抑制劑主要維持機(jī)體結(jié)締組織的平衡[20]。另外，骨形成蛋白4(BMP4)主要參與骨的形成與胚胎發(fā)育[21]；白血病抑制因子(LIF)在不同細(xì)胞的作用不同，包括刺激或抑制細(xì)胞的增殖、分化或存活，同時(shí)也可促進(jìn)胚胎發(fā)育[22]；血管生成素(Angiogenin)則可促進(jìn)新生血管形成，同時(shí)通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、存活、遷移、侵襲、分化，在各種生理病理過程中發(fā)揮重要作用[23]。預(yù)測(cè)，將來(lái)干細(xì)胞培養(yǎng)上清提取物可直接作為注射劑治療包括POF在內(nèi)的相關(guān)疾病。

然而，不同類型干細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的種類、質(zhì)量可能具有較大差異，因此適應(yīng)證及療效也具有差異性。另外，推測(cè)不同性別的同類型干細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子種類、質(zhì)量可能也存在差異，對(duì)癥治療時(shí)應(yīng)精準(zhǔn)選擇。本研究為探明不同類型干細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的質(zhì)量，為將來(lái)干細(xì)胞治療生殖相關(guān)疾病提供依據(jù)，將比較不同種類、不同性別干細(xì)胞中細(xì)胞分泌因子的表達(dá)水平。

材料與方法

一、材料

人胚胎干細(xì)胞(hESC)系CCRM22由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建[24]；α-MEM、DMEM F/12、Knockout血清替代物(knockout serum replacement，KSR)、1% L-谷氨酰胺(LG)、1%青霉素-鏈霉素(PS)、1%非必需氨基酸(NEAA)、膠原酶Ⅵ、Trizol、DPBS、CTSTMTrypLETMSelect Enzyme(Gibco，美國(guó))；絲裂霉素C、α-二巰基乙醇、β-甘油磷酸鈉、地塞米松、抗壞血酸(VitC)、吲哚美辛、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(Sigma，美國(guó))；間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化培養(yǎng)基(Promo cell，德國(guó))；堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)(Peprotech，美國(guó))，血小板裂解物(Helios，中國(guó))；胰島素、肝素鈉、反轉(zhuǎn)錄(PCR)試劑盒(Takara，日本)；PCR引物由南京瑞真生物技術(shù)有限公司合成。

兔多克隆抗體OCT4、NONAG、小鼠單克隆抗體SSEA-4羊抗兔二抗(紅色)、羊抗鼠二抗(綠色)(Abcam，美國(guó))；流式抗體PE Mouse-Anti-Hman CD44、CD73、CD90、CD105、CD11b/Mac-1、CD19、CD34、CD45，F(xiàn)ITC-Mouse-Anti-Human HLA-DR，DP，DQ、PE-Mouse-IgG2b、FITC-Mouse-IgG2a(BD，美國(guó))；Mount封片劑(SBA，美國(guó))。

二、方法

hESC細(xì)胞系CCRM15和CCRM22來(lái)源于不孕不育夫婦向本院生殖中心捐贈(zèng)的廢棄胚胎。羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的羊膜、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的臍帶，均由足月剖宮產(chǎn)產(chǎn)婦捐贈(zèng)。實(shí)驗(yàn)方案取得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，捐獻(xiàn)志愿者均簽署了書面知情同意書。

(一)人胚胎干細(xì)胞的建系及鑒定

1.胚胎干細(xì)胞的建系及培養(yǎng)：參照本實(shí)驗(yàn)既往建立hESC的方法[24-25]建立胚胎干細(xì)胞系CCRM15。簡(jiǎn)要步驟如下：提前準(zhǔn)備滋養(yǎng)層小鼠成纖維細(xì)胞(MEF)，在胚胎第6天，將去除透明帶的囊胚種植于MEF上，每天更換ES培養(yǎng)基(DMEM/F12+20% KO-SR+1% LG+1% PS+1% NEAA+0.1 mmol/L α-二巰基乙醇+10 ng/ml bFGF)，待出現(xiàn)克隆樣生長(zhǎng)的細(xì)胞團(tuán)，機(jī)械法傳代(5代后用1 mg/ml 膠原酶Ⅵ消化后傳代)。

2.人胚胎干細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)鑒定：4%多聚甲醛室溫固定hESCs，杜氏磷酸鹽緩沖液(DPBS)洗滌，0.4% Triton X-100/PBS破膜，然后依次用5%BSA封閉、加一抗OCT4(1∶200)、NANOG(1∶200)、SSEA-4(1∶500)，過夜；洗滌后加二抗，室溫避光孵育，DPBS洗滌，Mount封片，熒光顯微鏡拍照。

3.擬胚狀體分化：hESCs克隆用1 mg/ml膠原酶Ⅳ不完全消化，使其保持團(tuán)塊狀；接種至不貼壁培養(yǎng)皿內(nèi)，加入不含bFGF的hESCs培養(yǎng)基；隔天換液，培養(yǎng)7 d。

4.基因組測(cè)序鑒定核型：收集培養(yǎng)至第6天的hESCs，應(yīng)用美國(guó)Life TECH公司的Ion Torrent PGM測(cè)序系統(tǒng)，對(duì)人類全基因組進(jìn)行較低深度(0.07X覆蓋度)的高通量全基因組測(cè)序。

(二)間充質(zhì)干細(xì)胞的建系及鑒定

1.羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的建系及培養(yǎng)：本實(shí)驗(yàn)室改進(jìn)了Marongiu等[26]的方法進(jìn)行人類羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞(AMSC)的分離，建立AMSC株系A(chǔ)MSC1.2.2 (46，XY)、AMSC2.2.2 (46，XX)。簡(jiǎn)述如下：DPBS清洗羊膜去除血細(xì)胞，加入Tryple，37℃水浴30 min；再次洗滌剩余組織，加入新鮮Tryple，37℃水浴45 min；加入PLT培養(yǎng)液(α-MEM+5%血小板裂解物+1%LG+2000u/ml肝素鈉)中和，離心棄上清；PLT培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，種于培養(yǎng)皿，每3 d換液；當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)80%～90%時(shí)，1∶4傳代。

2.臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的建系及培養(yǎng)：本實(shí)驗(yàn)按以下方法分離人類臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(UMSC)，建立UMSC株系UMSC2.2.2(46，XX)、AMSC4.2.2(46，XY)：臍帶用DPBS清洗后剪成2 cm的小塊，抽除動(dòng)、靜脈；將臍帶小塊剪碎成2 mm左右碎片，移至培養(yǎng)皿中均勻鋪開；加入少量PLT培養(yǎng)液濕潤(rùn)組織，培養(yǎng)皿倒置放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h；加入足量血小板裂解物(PLT)培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)1～2周，加入Tryple消化組織塊周圍爬出的細(xì)胞，1∶3傳代。

3.流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)AMSCs和UMSCs細(xì)胞表面標(biāo)志物：AMSCs和UMSCs 均在第三代(P3)進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)基因包括血管細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志(CD11b、CD19、CD34、CD45)、間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志(CD44、CD73、CD90、CDl05)和免疫排斥相關(guān)的表面標(biāo)志(HLA-DP/DQ/DR)。DPBS洗滌細(xì)胞，Tryple消化，等量PLT培養(yǎng)液中和后離心、重懸、分裝；分別加入鼠抗人流式抗體及相對(duì)應(yīng)的同型對(duì)照，4℃避光放置20 min；離心、洗滌，加入DPBS重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)(型號(hào)Gallios，Beckman，美國(guó))。

4.AMSCs和UMSCs分化潛能檢測(cè)：AMSCs和UMSCs分別均在P3代進(jìn)行中胚層分化誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。①成骨分化：細(xì)胞用DPBS洗滌后加入成骨分化培養(yǎng)基(DMEM+10% FBS+1% PS+10 mmol/L β-甘油磷酸鈉+0.1 μmol/L地塞米松+50 mg/L抗壞血酸)，每3 d換液，培養(yǎng)至21 d；茜素紅染色。②成脂分化：細(xì)胞用DPBS洗滌后加入成脂分化培養(yǎng)基(DMEM+10% FBS+1 μmol/L地塞米松+200 μmol/L吲哚美辛+0.5 mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤+10 mg/L胰島素)，每3 d換液，培養(yǎng)至14 d；油紅O染色。③成軟骨分化：將細(xì)胞種于U型96孔板內(nèi)(1×105cells/孔)，PLT培養(yǎng)，細(xì)胞成球后，培養(yǎng)液更換為商品化成軟骨分化培養(yǎng)基，每3 d換液，培養(yǎng)21 d；阿辛藍(lán)染色。

5.遺傳標(biāo)志檢測(cè)-STR圖譜鑒定AMSCs和UMSCs：利用遺傳標(biāo)志檢測(cè)-STR圖譜鑒定AMSCs和UMSCs的純合性以及核型，該實(shí)驗(yàn)由南京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院完成。

(三)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)

在CCRM15 (46，XX)、CCRM22 (46，XY)培養(yǎng)的第6天，加入膠原酶IV、Dispase消化為細(xì)胞克隆并收集、洗滌，然后加入tryple消化成單細(xì)胞；在AMSC1.2.2 (46，XY)、AMSC2.2.2 (46，XX)、UMSC2.2.2 (46，XX)、UMSC4.2.2 (46，XY)培養(yǎng)的第3天、細(xì)胞呈90%融合度時(shí)，加入tryple消化成單細(xì)胞。在以上細(xì)胞中加入適量的Trizol 試劑，按照Trizol試劑操作說(shuō)明書提取總RNA；根據(jù) Takara公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA為模板分別以下述引物(表1)，在RT-PCR儀(Life Technologies，美國(guó))進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)。反應(yīng)過程如下：94℃預(yù)變性1 min；94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸45 s，以上過程進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5 min。每個(gè)樣品以其β-actin的表達(dá)量進(jìn)行定量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果以倍數(shù)改變±SD表示。

表1　各細(xì)胞因子引物序列

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié)果

一、建立、鑒定hESC細(xì)胞系

我們之前的研究證實(shí)CCRM22(46，XY)具有hESC的典型特征[24]。本次實(shí)驗(yàn)建立的CCRM15特性與CCRM22一致：細(xì)胞呈克隆狀生長(zhǎng)(圖1A)，能形成擬胚體(圖1B)，表達(dá)多能性標(biāo)志物OCT4、NONAG、SSEA-4(圖1C)；另外，測(cè)序結(jié)果顯示其染色體核型為46，XX (圖1D)。

二、建立、鑒定AMSC、UMSC株系

成功建立AMSCs細(xì)胞系兩株，命名為AMSC1.2.2及AMSC2.2.2。P0時(shí)細(xì)胞混有少量羊膜上皮細(xì)胞，純化至P3時(shí)細(xì)胞呈典型的間充質(zhì)細(xì)胞形態(tài)，呈放射狀或漩渦狀分布(圖2A)。

建立UMSCs細(xì)胞系兩株，命名為UMSC2.2.2和UMSC4.2.2。在組織塊貼壁培養(yǎng)約7 d左右組織塊周圍有細(xì)胞爬出，至貼壁培養(yǎng)14 d左右第一次傳代，其后每3～4 d可傳代，細(xì)胞形態(tài)為梭形，為間充質(zhì)細(xì)胞形態(tài)(圖2B)。

細(xì)胞系遺傳標(biāo)志檢測(cè)-STR圖譜結(jié)果顯示：UMSC2.2.2為46，XX；AMSC1.2.2和UMSC4.2.2來(lái)自同一胎盤，為46，XY；AMSC2.2.2已知胎兒性別為女性，即為46，XX。

流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果表明：新建立的AMSC、UMSC系均符合間充質(zhì)干細(xì)胞的質(zhì)量鑒定標(biāo)準(zhǔn)[27]，其中CD44、CD73、CD90和CD105陽(yáng)性率均超過95%，而CD11b、CD19、CD34、CD45以及HLA-DR/DP/DQ的陽(yáng)性率均<2%(圖3A～D)。

新建立的AMSCs、UMSCs均具有向中胚層分化潛能。在誘導(dǎo)分化條件下，4種間充質(zhì)干細(xì)胞均可被誘導(dǎo)分化為成脂細(xì)胞(油紅陽(yáng)性)、成骨細(xì)胞(茜素紅染色陽(yáng)性)和成軟骨細(xì)胞(阿辛藍(lán)染色陽(yáng)性)(圖4)。

三、hESC、AMSC和UMSC細(xì)胞分泌因子基因表達(dá)水平的比較

選取生殖細(xì)胞發(fā)育相關(guān)的高分泌的細(xì)胞因子進(jìn)行分析。選取細(xì)胞因子種類包括：(1)促炎因子IL-6、IL-8和TNF-α；(2)抑炎因子IL-10；(3)生長(zhǎng)因子HGF、BDNF、SCF和VEGF；(4)基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-1及其抑制劑TIMP-1；(5)血管形成因子Angiogenin，造血因子LIF和骨形成蛋白BMP4。

(一)同種類型、不同性別干細(xì)胞中細(xì)胞分泌因子表達(dá)水平的比較

1.不同性別hESC中細(xì)胞分泌因子表達(dá)水平的比較：比較女性胚胎干細(xì)胞株系CCRM15(46，XX)、男性胚胎干細(xì)胞株系CCRM22(46，XY)中細(xì)胞分泌因子的相對(duì)表達(dá)水平(圖5)。發(fā)現(xiàn)：(a)促炎因子IL-6、IL-8低水平表達(dá)，TNF-α極低水平表達(dá)，且在CCRM15中的表達(dá)水平分別為CCRM22的4.3倍(P<0.01)、10.3倍(P<0.001)、13.9倍(P<0.001)。(b)抑炎因子IL-10在兩種hESCs中表達(dá)水平極低，在CCRM22中的表達(dá)水平約為CCRM15的2.1倍(P<0.01)。(c)生長(zhǎng)因子在hESCs中表達(dá)水平較高，其中SCF、BDNF及HGF在CCRM22中的表達(dá)均顯著高于CCRM15，分別為1.3倍(P<0.01)、3.4倍(P<0.01)、3.8倍(P<0.001)；VEGF的表達(dá)水平無(wú)顯著的性別差異(P>0.05)。(d)金屬蛋白酶MMP-1及其抑制劑TIMP-1在hESCs中高水平表達(dá)，且在CCRM15中的表達(dá)水平均顯著高于CCRM22，分別為6.1倍(P<0.001)、1.1倍(P<0.001)。(e)BMP4在hESCs中高水平表達(dá)，但無(wú)顯著的性別差異(P>0.05)；LIF在hESCs中低水平表達(dá)，且在CCRM22中的表達(dá)量顯著高于CCRM15(1.9倍，P<0.01)；Angiogenin的表達(dá)水平與LIF相當(dāng)，但在CCRM15中較高，為CCRM22中表達(dá)量的1.6倍(P<0.01)。

A：CCRM15和CCRM27均呈克隆狀生長(zhǎng)，核質(zhì)比高，邊界清晰(×4)；B：CCRM15能形成擬胚狀體，圖為擬胚狀體培養(yǎng)Day 4和Day 7時(shí)形態(tài)(×10)；C：免疫熒光檢測(cè)CCRM15多能性基因，其中OCT4、NANOG紅色信號(hào)為陽(yáng)性，SSEA-4綠色信號(hào)為陽(yáng)性，藍(lán)色為PAPI染核(×10)；D：基因組測(cè)序結(jié)果表明CCRM的核型為46，XX。標(biāo)尺=50 μm圖1　CCRM15的細(xì)胞形態(tài)及多能性鑒定

圖2　間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)

A：AMSC2.2.2；B：AMSC1.2.2；C：UMSC2.2.2；D：UMSC4.2.2。圖中橫坐標(biāo)均表示熒光強(qiáng)度，縱坐標(biāo)均表示細(xì)胞計(jì)數(shù)。 CD44、CD73、CD90以及CD105陽(yáng)性率>95%，CD11b、CD19、CD34、CD45以及HLA-DR/DP/DQ陽(yáng)性率<2%圖3　AMSCs和UMSCs表面標(biāo)志物流式檢測(cè)

AMSC2.2.2、AMSC1.2.2、UMSC2.2.2、UMSC4.2.2在體外誘導(dǎo)條件下向中胚層分化：成脂、成骨、成軟骨分化。成脂分化為油紅O染色陽(yáng)性，成骨分化為茜素紅染色陽(yáng)性，成軟骨分化為阿辛藍(lán)染色陽(yáng)性(均為×10)圖4　AMSCs和UMSCs具有向中胚層組織細(xì)胞分化潛能

以CCRM15為基數(shù)，比較各因子的相對(duì)表達(dá)倍數(shù)。*P<0.01；#P<0.001圖5　hESC株系CCRM15、CCRM22中細(xì)胞分泌因子相對(duì)表達(dá)水平比較

2.不同性別AMSC中細(xì)胞分泌因子表達(dá)水平的比較：比較羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞女性株系A(chǔ)MSC2.2.2 (46，XX)和男性株系A(chǔ)MSC1.2.2(46，XY)中細(xì)胞分泌因子的相對(duì)表達(dá)水平(圖6)。結(jié)果表明：(a)促炎因子IL-6、IL-8高表達(dá)，且AMSC2.2.2中的表達(dá)水平顯著高于AMSC1.2.2，分別為3.4倍(P<0.01)、8.6倍(P<0.01)；而TNF-α表達(dá)水平極低，且無(wú)顯著的性別差異(P>0.05)。(b)抑炎因子IL-10表達(dá)水平極低，且無(wú)顯著的性別差異(P>0.05)。(c)生長(zhǎng)因子在AMSCs中高表達(dá)，其中BDNF、HGF在AMSC2.2.2中的表達(dá)量顯著高于AMSC1.2.2，分別為1.2倍(P<0.05)、3.9倍(P<0.001)；與此相反，VEGF在AMSC1.2.2的表達(dá)水平則為AMSC2.2.2中的3.1倍(P<0.01)；SCF的表達(dá)量無(wú)顯著的性別差異(P>0.05)。(d)金屬蛋白酶MMP-1低水平表達(dá)，其抑制劑TIMP-1以極高水平表達(dá)，但兩種分泌因子的表達(dá)水平均無(wú)顯著的性別差異(P>0.05)。(e)BMP4高水平表達(dá)，Angiogenin、LIF低水平表達(dá)，且在AMSC1.2.2中的表達(dá)水平均顯著高于AMSC2.2.2，分別為5.4倍(P<0.001)、3.3倍(P<0.001)、1.8倍(P<0.01)。

3.不同性別UMSC中細(xì)胞分泌因子表達(dá)水平的比較：比較臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞女性株系UMSC2.2.2(46，XX)和男性株系UMSC4.2.2(46，XY)中細(xì)胞分泌因子的表達(dá)水平(圖7)。結(jié)果顯示：(a)促炎因子IL-6、IL-8高表達(dá)，TNF-α極低表達(dá)，且IL-6、IL-8在UMSC2.2.2中的表達(dá)水平顯著高于UMSC4.2.2，分別為3.9倍(P<0.001)、6.1倍(P<0.001)；而TNF-α在UMSC4.2.2中的表達(dá)水平顯著高于UMSC4.2.2(10.3倍，P<0.01)。(b)抑炎因子IL-10在以極低水平表達(dá)，但UMSC4.2.2中的表達(dá)水平顯著高于UMSC2.2.2(1.9倍，P<0.01)。(c)生長(zhǎng)因子在兩種性別細(xì)胞中均高表達(dá)，其中BDNF、HGF在UMSC2.2.2中的表達(dá)水平顯著高于UMSC4.2.2，分別為2.6倍(P<0.001)、5.5倍(P<0.001)，而VEGF在UMSC4.2.2中的表達(dá)水平較高，為UMSC2.2.2的1.4倍(P<0.05)；SCF的表達(dá)水平無(wú)顯著的性別差異(P>0.05)。(d)金屬蛋白酶MMP-1在UMSCs中低水平表達(dá)，且UMSC4.2.2中的表達(dá)水平顯著高于UMSC2.2.2(9.6倍，P<0.001)；而其抑制劑TIMP-1在UMSCs中高表達(dá)，且在UMSC2.2.2中的表達(dá)水平為UMSC4.2.2中的3.8倍(P<0.05)。(e)BMP4、Angiogenin在UMSC2.2.2低水平表達(dá)，BMP4表達(dá)水平在UMSC4.2.2中顯著高于UMSC2.2.2(1.8倍，P<0.05)；而Angiogenin、LIF的表達(dá)水平無(wú)顯著的性別差異(P>0.05)。

以AMSC2.2.2為基數(shù)，比較各因子的相對(duì)表達(dá)倍數(shù)。*P<0.05；**P<0.01；#P<0.001圖6　AMSC株系A(chǔ)MSC2.2.2、AMSC1.2.2中細(xì)胞分泌因子相對(duì)表達(dá)水平比較

以UMSC2.2.2為基數(shù)，比較各因子的相對(duì)表達(dá)倍數(shù)。*P<0.05；**P<0.01；#P<0.001圖7　UMSC株系UMSC2.2.2、UMSC4.2.2中細(xì)胞分泌因子相對(duì)表達(dá)水平比較

(二)不同類型、同性別干細(xì)胞中細(xì)胞分泌因子表達(dá)水平的比較

1.不同類型女性干細(xì)胞中細(xì)胞分泌因子表達(dá)水平的比較：兩兩比較女性干細(xì)胞系CCRM15、AMSC2.2.2、UMSC2.2.2中細(xì)胞分泌因子的相對(duì)表達(dá)水平(圖8)。發(fā)現(xiàn)：(a)促炎因子IL-6、IL-8表達(dá)水平在三種細(xì)胞間存在顯著差異，其中IL-6的相對(duì)表達(dá)量排序?yàn)锳MSC2.2.2(4.9倍，P<0.001)>UMSC2.2.2(3.0倍，P<0.001)>CCRM15，IL-8為UMSC2.2.2(2.0倍，P<0.001)>AMSC2.2.2(3.0倍，P<0.001)>CCRM15；而TNF-α在CCRM15的相對(duì)表達(dá)量顯著高于AMSC2.2.2(16.0倍，P<0.001)和UMSC2.2.2(47.1倍，P<0.001)，但AMSC2.2.2和UMSC2.2.2間并無(wú)顯著差異(P>0.05)。(b)抑炎因子IL-10在CCRM15的相對(duì)表達(dá)量顯著高于AMSC2.2.2(2.0倍，P<0.05)和UMSC2.2.2(3.1倍，P<0.01)，但AMSC2.2.2和UMSC2.2.2間無(wú)顯著差異(P>0.05)。(c)生長(zhǎng)因子VEGF、HGF的表達(dá)量在CCRM15、AMSC2.2.2、UMSC2.2.2三者間均存在顯著差異性，VEGF表達(dá)量排列順序?yàn)閁MSC2.2.2(5.6倍，P<0.01)>AMSC2.2.2(2.5倍，P<0.05)>CCRM15，HGF為UMSC2.2.2(3.6倍，P<0.01)>AMSC2.2.2(3.9倍，P<0.01)>CCRM15；BDNF在AMSC2.2.2、UMSC2.2.2中的表達(dá)水平均顯著高于CCRM15，分別為2.1倍(P<0.01)、2.0倍(P<0.01)，但AMSC2.2.2、UMSC2，2.2之間無(wú)顯著差異(P>0.05)；SCF在三種細(xì)胞系間的表達(dá)水平無(wú)顯著差異性(P>0.05)。(d)金屬蛋白酶MMP-1及其抑制劑TIMP-1的相對(duì)表達(dá)水平在CCRM15、AMSC2.2.2和UMSC2.2.2三者間均存在顯著差異，MMP-1的表達(dá)水平排列順序?yàn)镃CRM15(5.4倍，P<0.001)>AMSC2.2.2(5.0倍，P<0.01)>UMSC2.2.2，TIMP-1則為AMSC2.2.2(1.1倍，P<0.001)>UMSC2.2.2(37.2倍，P<0.001)>CCRM15。(e)BMP4表達(dá)水平在CCRM15中顯著高于AMSC2.2.2(18.5倍，P<0.001)和UMSC2.2.2(7.2倍，P<0.001)，但AMSC2.2.2、UMSC2.2.2間無(wú)顯著差異(P>0.05)；LIF的表達(dá)水平在UMSC2.2.2中顯著高于CCRM15(1.4倍，P<0.05)，但UMSC2.2.2與AMSC2.2.2間、AMSC2.2.2與CCRM15間無(wú)顯著差異(P>0.05)；Angiogenin在三種細(xì)胞系中的表達(dá)水平均存在顯著差異，排列順序?yàn)閁MSC2.2.2(1.2倍，P<0.05)>CCRM15(1.5倍，P<0.01)>AMSC2.2.2。

2.不同類型男性干細(xì)胞中細(xì)胞分泌因子表達(dá)水平的比較：兩兩比較男性干細(xì)胞系CCRM22、AMSC1.2.2和UMSC4.2.2中細(xì)胞分泌因子的相對(duì)表達(dá)水平(圖9)。發(fā)現(xiàn)：(a)促炎因子中，IL-6在UMSC4.2.2中的表達(dá)水平顯著高于CCRM22(3.3倍，P<0.01)，其它細(xì)胞系之間無(wú)顯著差異(P>0.05)；IL-8、TNF-α在三種細(xì)胞中的表達(dá)水平無(wú)顯著差異(P>0.05)。(b)抑炎因子IL-10在CCRM22中的表達(dá)水平顯著高于AMSC1.2.2(3.5倍，P<0.001)、UMSC4.2.2(3.4倍，P<0.01)，但AMSC1.2.2和UMSC4.2.2之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。(c)生長(zhǎng)因子SCF、VEGF、BDNF以及HGF在三種細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量均存在顯著差異性：SCF表達(dá)水平排列順序?yàn)镃CRM22(1.2倍，P<0.05)>AMSC1.2.2(1.3倍，P<0.05)>UMSC4.2.2，BDNF為CCRM22(2.2倍，P<0.001)>AMSC1.2.2(2.0倍，P<0.01)>UMSC4.2.2，VEGF為UMSC4.2.2(2.6倍，P<0.001)>AMSC1.2.2(21.0倍，P<0.001)>CCRM22，HGF為CCRM22(1.4倍，P<0.05)>UMSC4.2.2(2.6倍，P<0.01)>AMSC1.2.2。(d)金屬蛋白酶MMP-1在UMSC4.2.2中的表達(dá)水平顯著高于CCRM22(2.1倍，P<0.01)、AMSC1.2.2(1.8倍，P<0.01)，而在CCRM22、AMSC1.2.2間無(wú)顯著差異性(P>0.05)；金屬蛋白酶抑制劑TIMP-1的表達(dá)水平在AMSC1.2.2中顯著高于CCRM22(20.7倍，P<0.001)和UMSC4.2.2(1.9倍，P<0.01)，但CCRM22和UMSC4.2.2間無(wú)顯著差異性(P>0.05)。(e)BMP4在CCRM22中的表達(dá)水平顯著高于AMSC1.2.2(3.2倍，P<0.001)、UMSC4.2.2(3.8倍，P<0.001)，而在AMSC1.2.2、UMSC4.2.2之間無(wú)顯著差異(P>0.05)；Angiogenin在三者間均有顯著差異，且AMSC1.2.2(2.0倍，P<0.001)>UMSC4.2.2(1.7倍，P<0.001)>CCRM22；LIF的相對(duì)表達(dá)量在三者之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。

以CCRM15為基數(shù)，比較相同性別不同種類干細(xì)胞細(xì)胞分泌因子的相對(duì)表達(dá)倍數(shù)。*P<0.05；**P<0.01；#P<0.001圖8　女性株系CCRM15、AMSC2.2.2以及UMSC2.2.2中細(xì)胞分泌因子相對(duì)表達(dá)水平比較

以CCRM22為基數(shù)，比較相同性別不同種類干細(xì)胞細(xì)胞分泌因子的相對(duì)表達(dá)倍數(shù)。*P<0.05；**P<0.01；#P<0.001圖9　男性株系CCRM22、AMSC1.2.2以及UMSC4.2.2中細(xì)胞分泌因子相對(duì)表達(dá)水平比較

討論

干細(xì)胞分為胚胎干細(xì)胞(ES)和間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)，根據(jù)其來(lái)源又可以具體分為胚胎干細(xì)胞(ESCs)、新生兒附屬物干細(xì)胞(NDSCs)、成體間充質(zhì)干細(xì)胞(ASCs)、組織干細(xì)胞(TSCs)、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)等，其中NDSCs、ASCs和TSCs同屬于MSCs類型。

不同來(lái)源的干細(xì)胞臨床應(yīng)用范圍、價(jià)值也各不相同。因?yàn)镋S具有致瘤性，且存在倫理問題，因此hES更多的是用于機(jī)制研究而很少用于臨床治療，例如用來(lái)研究生殖細(xì)胞發(fā)育的調(diào)控機(jī)制[28-29]。MSCs來(lái)源較廣，具有低免疫原性的特性，因而具有較高的臨床應(yīng)用潛能。目前，MSCs已廣泛用于改善化療后所致卵巢功能減退的研究[12-13]，而進(jìn)入體內(nèi)的MSCs并不能進(jìn)一步分化為生殖細(xì)胞。我們推測(cè)，進(jìn)入小鼠體內(nèi)的MSCs通過分泌細(xì)胞因子來(lái)改善卵巢功能，其作用機(jī)制與脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子可以改善小鼠阿爾茲海默癥癥狀[30]、羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子可減少小鼠心肌梗死面積[15]類似。

細(xì)胞因子種類繁多，具體是哪一類或哪幾類細(xì)胞因子在其中發(fā)揮關(guān)鍵作用，目前尚無(wú)定論。另外，干細(xì)胞種類不同，分泌的細(xì)胞因子數(shù)量、質(zhì)量存在差異；而對(duì)于改善生殖功能，可能不同性別干細(xì)胞具有不同的療效。為給基于干細(xì)胞的臨床治療提供依據(jù)，本研究比較包括了2種性別的3種干細(xì)胞類型、共6個(gè)細(xì)胞株中干細(xì)胞分泌因子表達(dá)水平的差異。

同類型、不同性別細(xì)胞進(jìn)行比較時(shí)：(1)促炎因子IL-8、金屬蛋白酶及其抑制劑、Angiogenin在女性hESC系中的表達(dá)水平顯著高于男性hESC；而抑炎因子IL-10、生長(zhǎng)因子HGF、BDNF、SCF及LIF則在男性hESC中的表達(dá)水平較高；(2)促炎因子IL-6、IL-8、生長(zhǎng)因子BDNF及HGF的表達(dá)量在女性AMSC系中顯著高于男性AMSC系；VEGF、Angiogenin、LIF和BMP4則在男性AMSC系中的表達(dá)水平較高；(3)促炎因子IL-6、TNF-α，生長(zhǎng)因子BDNF、HGF及金屬蛋白酶抑制劑TIMP-1均在女性UMSC系中具有較高表達(dá)水平；而促炎因子IL-8，抑炎因子IL-10，生長(zhǎng)因子VEGF，金屬蛋白酶MMP-1及BMP4均在男性UMSC系中表達(dá)水平較高。

同性別、不同類型細(xì)胞進(jìn)行比較時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：(1)在女性細(xì)胞中，促炎因子IL-8，生長(zhǎng)因子VEGF、HGF，LIF以及Angiogenin在UMSC中相對(duì)表達(dá)水平顯著高于其他細(xì)胞系；促炎因子IL-6及金屬蛋白酶抑制劑TIMP-1則在AMSC中的相對(duì)表達(dá)量較高；而促炎因子TNF-α、抑炎因子、金屬蛋白酶MMP-1、BMP4在hESC中表達(dá)水平顯著高于成體干細(xì)胞；(2)男性細(xì)胞系中，促炎因子、金屬蛋白酶的表達(dá)水平在UMSCs中顯著高于其他兩種細(xì)胞類型；而抑炎因子、BMP4的表達(dá)水平在hESCs中較高；金屬蛋白酶抑制劑、Angiogenin的表達(dá)水平在成體干細(xì)胞中較高；生長(zhǎng)因子的表達(dá)水平在三種細(xì)胞系中存在顯著差異、互有高低。

總之，女性hESCs、男性UMSCs可分泌較多的金屬蛋白酶，具有更強(qiáng)的降解纖維的能力，臨床上可考慮用于促進(jìn)傷口愈合、抑制或消除疤痕；而女性UMSCs分泌生長(zhǎng)因子、血管生成因子、造血因子、抑炎因子的能力要強(qiáng)于hESCs、AMSCs，可能具有更好的改善血供、提高生殖功能的療效。以上推測(cè)尚需動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

本實(shí)驗(yàn)通過比較不同性別、不同類型干細(xì)胞中細(xì)胞分泌因子的表達(dá)水平差異，為研究干細(xì)胞治療、特別是POF治療機(jī)制提供了基礎(chǔ)，同時(shí)也為選擇合適類型的干細(xì)胞來(lái)實(shí)施POF臨床治療提供理論依據(jù)。

【參考文獻(xiàn)】

[1]Cherry AB，Daley GQ.Reprogramming cellular identity for regenerative medicine[J].Cell，2012，148：1110-1122.

[2]Liu J，Zhang H，Zhang Y，et al.Homing and restorative effects of bone marrow-derived mesenchymal cells on cisplatin injured ovaries in rats[J].Mol Cells，2014，37：865-872.

[3]Shelling AN.Premature ovarian failure[J].Reproduction，2010，140：633-641.

[4]Bachelot A，Rouxel A，Massin N，et al.Phenotyping and genetic studies of 357 consecutive patients presenting with premature ovarian failure[J].Eur J Endocrinol，2009，161：179-187.

[5]Panay N，F(xiàn)enton A.Premature ovarian failure：a growing concern[J].Climacteric，2008，11：1-3.

[6]Maclaran K，Panay N. Premature ovarian failure[J]. J Fam Plann Reprod Health Care，2011，37：35-42.

[7]Chen H，Li J，Cui T，et al.Adjuvant gonadotropin-releasing hormone analogues for the prevention of chemotherapy induced premature ovarian failure in premenopausal women[DB].Cochrane Database Syst Rev，2011，(11)：CD008018.

[8]Antoine C，Ameye L，Paesmans M.et al. Systematic review about breast cancer incidence in relation to hormone replacement therapy use[J]. Climacteric，2014，17：116-132.

[9]Donnez J，Dolmans MM.Fertility preservation in women[J].Nat Rev Endocrinol，2013，9：736-749.

[10]Ghadami M，El-Demerdash E，Zhang D，et al.Bone marrow transplantation restores follicular maturation and steroid hormones production in a mouse model for primary ovarian failure[J/OL].PLOS One，2012，7：e32462.

[11]Kilic S，Pinarli F，Ozogul C，et al.Protection from cyclophosphamide-induced ovarian damage with bone marrow-derived mesenchymal stem cells during puberty[J].Gynecol Endocrinol，2014，30：135-140.

[12]Takehara Y，Yabuuchi A，Ezoe K，et al.The restorative of adipose-derived mesenchymal stem cells on damaged ovarian function[J].Lab Invest，2013，93：181-193.

[13]Xiao GY，Liu IH，Cheng CC，et al.Amniotic fluid stem cells prevent follicle atresia and rescue fertility of mice with premature ovarian failure induced by chemotherapy[J/OL].PLOS One，2014，9：e106538.

[14]Santiquet N，Vallieres L，Pothier F，et al.Transplanted bone marrow cells do not provide new oocytes but rescue fertility in female mice following treatment with chemotherapeutic agents[J].Cell Reprogram，2012，14：123-129.

[15]Danieli P，Malpasso G，Ciuffreda MC，et al.Conditioned medium from human amniotic mesenchymal stromal cells limits infarct size and enhances angiogenesis[J].Stem Cells Transl Med，2015，4：448-458.

[16]Gao Z，Zhang Q，Han Y，et al.Mesenchymal stromal cell-conditioned medium prevents radiation-induced small intestine injury in mice[J].Cytotherapy，2012，14：267-273.

[17]姚娜，李樹德，王文林.IL-6，IL-10在實(shí)驗(yàn)性肺部炎癥中的研究進(jìn)展[J].昆明醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，35：161-163.

[18]呂倩，王昌明，蔣明，等.HIF-1α和VEGF在大鼠COPD中的表達(dá)及肺血管重構(gòu)的關(guān)系研究[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2012，28：772-777.

[19]孫燕來(lái)，李增軍.肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子及其受體c-Met表達(dá)與胃癌肝轉(zhuǎn)移的相關(guān)性[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2015，31：2635-2637.

[20]Nagase H，Visse R，Murphy G.Structure and function of matrix metalloproteinases and TIMPs[J].Cardiovasc Res，2006，69：562-573.

[21]Guo WT，Dong DL.Bone morphogenetic protein-4：a novel therapeutic target for pathological cardiac hyperrophy/heart failure[J].Heart Fail Rev，2014，19：781-788.

[22]Nicola NA，Babon JJ.Leukemia inhibitory factor (LIF)[J].Cytokine Growth Factor Rev，2015，26：533-544.

[23]Sheng J，Xu Z.Three decades of research on angiogenin：a review and perspective[J/OL].Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai)，2016，48：399-410.

[24]Jiang C，Cai L，Huang B，et al.Normal human embryonic stem cell lines were derived from microsurgical enucleated tripronuclear zygotes[J].J Cell Biochem，2013，114：2016-2023.

[25]Huang B，Jiang C，Chen A，et al.Establishment of human-embryonic-stem-cell line from mosaic trisomy 9 embryo[J].Taiwan J Obestet Gynecol，2015，54：505-511.

[26]Marongiu F，Gramignoli R，Sun Q，et al.Isolation of amniotic mesenchymal stem cells[J].Curr Protoc Stem Cell Bio，2010，Chapter 1：Unit1E.5-1E.5.11.

[27]Dominici M，Le Blanc K，Mueller I，et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement[J]. Cytotherapy，2006，8：315-317.

[28]Wongtrakoongate P，Jones M，Gokhale PJ，et al. STELLA facilitates differentiation of germ cell and endodermal lineages of human embryonic stem cells[J/OL]. PLoS One，2013，8：e56893.

[29]Gkountela S，Li Z，Vincent JJ，et al. The ontogeny of cKIT+human primordial germ cells proves to be a resource for human germ line reprogramming，imprint erasure and in vitro differentiation[J]. Nat Cell Biol，2013，15：113-122.

[30]Yamazaki H，Jin Y，Tsuchiya A，et al.Adipose-derived stem cell-conditioned medium ameliorates antidepression-related behaviors in the mouse model of Alzheimer’s disease[J].Neurosci Lett，2015，609：53-57.

[編輯：谷炤]

Expressions of secretory factors in different types of stem cells

ZHANG Qin-jing，CHEN Ai-qin，NING Song，GAO Chao，JIANG Chun-yan，CUI Yu-gui，CHEN Juan，QIN Lian-ju*，LIU Jia-yin*

StateKeyLaboratoryofReproductiveMedicine，CenterofClinicalReproductiveMedicine，F(xiàn)irstAffiliatedHospital，NanjingMedicalUniversity，Nanjing210029

【Abstract】Objective： To compare the expression levels of secretory cytokine in different type of stem cell，and explore their clinical significance.

Key words：Human embryonic stem cell；Human amniotic mesenchymal stem cell；Human umbilical cord mesenchymal stem cell；Secretory cytokine

DOI：10.3969/j.issn.1004-3845.2016.06.009

【收稿日期】2016-01-16；【修回日期】2016-02-05

【基金項(xiàng)目】973項(xiàng)目(2012CB944902)；國(guó)家自然科學(xué)基金(81370764，81370754)；江蘇省科技廳項(xiàng)目(BL2012009、BM201358)、衛(wèi)生廳項(xiàng)目(ZX201110)

【作者簡(jiǎn)介】張琴靜，女，江蘇昆山人，碩士，婦產(chǎn)科生殖醫(yī)學(xué)方向.(*通訊作者，Email：ljqin@njmu.edu.cn；jyliu_nj@126.com)