化療藥物致卵巢損傷的表型分析及可能機制

呂曉丹，李瑩，張璐，王學(xué)芹，馬旭*，夏紅飛*

(1.國家衛(wèi)生計生委科學(xué)技術(shù)研究所遺傳優(yōu)生中心，北京　100081；2.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院，北京　100730)

化療藥物致卵巢損傷的表型分析及可能機制

呂曉丹1，2，李瑩1，張璐1，王學(xué)芹1，馬旭1*，夏紅飛1*

(1.國家衛(wèi)生計生委科學(xué)技術(shù)研究所遺傳優(yōu)生中心，北京100081；2.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院，北京100730)

【摘要】目的探索化療藥物對小鼠卵巢的影響及可能的機制。方法將60只ICR小鼠平均分為給藥組和對照組。給藥組小鼠一次性腹腔注射環(huán)磷酰胺120 mg/kg+白消安20 mg/kg，對照組小鼠注射同等體積的DMSO；通過觀察小鼠動情周期的變化、性激素水平、卵巢組織形態(tài)及卵泡計數(shù)分析化療藥物對卵巢的影響；通過檢測抗苗勒管激素(AMH)、Ki67表達水平等分析卵巢儲備能力和細胞增殖能力的變化。結(jié)果給藥組雌激素水平(203.00±24.91 pmol/L)比對照組(379.00±36.13 pmol/L)顯著降低(P<0.01)；給藥組臟器系數(shù)(0.0318)比對照組(0.0487)顯著下降(P<0.01)；給藥組可見卵巢萎縮、各級卵泡數(shù)目明顯減少、卵泡閉鎖增多；給藥組顆粒細胞分泌的AMH明顯減少、增殖細胞數(shù)目顯著降低(P<0.01)。結(jié)論化療藥物能導(dǎo)致小鼠卵巢損傷，卵巢儲備能力和卵巢細胞的增殖能力明顯下降。

【關(guān)鍵詞】化療藥物；卵巢損傷；表型分析；抗苗勒管激素；增殖

Methods： Sixty ICR mice were equally divided into two groups：the mice were administrated with 120 mg/kg cyclophosphamide and 20 mg/kg busulfan by intraperitoneal injection in CTX+BUS group；and the mice were given with the same quantity of DMSO in the control group. The function of ovary were checked by analyzing estrous cycle，serum gonadal hormone levels，morphology of ovarian tissues，changes of numbers of follicles.Ovarian reserve capacity and cell proliferation were verified by detecting the expression of anti-mullerian hormone and Ki67.

Results： Compared with the control group，the estrogen levels [(203.00±24.91) pmol/L vs. (379.00±36.13) pmol/L] were significantly decreased (P<0.01)；organ coefficient (0.0318 vs. 0.0487) was significantly decreased (P<0.01)；the numbers of follicles reduced and the numbers of atretic follicles increased；AMH levels secreted by granulosa cells significantly reduced and the numbers of proliferating cells were significantly decreased in mice injected with chemotherapy drugs of CTX+BUS group (P<0.01).

Conclusions： Chemotherapy drugs can lead to ovarian damage in mice，and the ovarian reserve capacity and ovarian cell proliferation significantly decreased.

(JReprodMed2016，25(6)：540-544)

化療藥物在抑制腫瘤的同時會產(chǎn)生一定的毒副作用。長期的化療通常會對女性性腺造成損傷，出現(xiàn)原始卵泡減少等一系列卵巢功能過早衰竭的現(xiàn)象[1-2]。通常卵巢早衰(POF)是指婦女在40歲之前出現(xiàn)閉經(jīng)、雌激素缺乏(E2<92 pmol/L)、卵泡刺激素(FSH)和黃體生成素(LH)水平升高(FSH>40 U/L，LH>30 U/L)為特征的一種疾病[3-4]。一般人群中發(fā)病率為1%～3%，在繼發(fā)性閉經(jīng)婦女中占4%～18%，在20歲以前的發(fā)病率約為0.01%[5]。目前，如何在化療的同時保護婦女的卵巢功能、改善其生活質(zhì)量成為婦產(chǎn)科學(xué)及生殖醫(yī)學(xué)研究的重要內(nèi)容。因此，本實驗旨在研究對卵巢毒性較強的化療藥物環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)和白消安(Busulfan，BUS)對小鼠卵巢功能的損傷，為深入探索POF的發(fā)病機制和治療方法提供動物模型和實驗依據(jù)。

材料與方法

一、材料來源

1. 實驗動物：健康ICR(Institute of Cancer Research)雌性小鼠，6周齡，SPF級，體重約27 g，購于北京華阜康生物科技股份有限公司，合格證編號為SCXK(京)2014-0004。所有小鼠在恒溫恒濕環(huán)境下飼養(yǎng)，提供12 h光照/12 h黑暗環(huán)境。

2. 主要試劑：CTX (Baxter，德國)，BUS和DMSO (Sigma，美國)，E2和FSH試劑盒 (Bio-Swamp，中國)，孕馬血清促性腺激素(Pregnant Mare Serum Gonadotropin，PMSG；寧波第二激素廠)，蘇木精-伊紅染液(hematoxylin-eosin，HE；中杉金橋)，AMH抗體 (R&D Systems，美國)，Ki67抗體(Abcam，英國)。

實驗經(jīng)國家衛(wèi)生計生委科學(xué)技術(shù)研究所倫理委員會批準(zhǔn)。

二、方法

1. 實驗動物給藥方案：經(jīng)陰道涂片，將有正常動情周期的小鼠納入實驗。ICR雌性小鼠分為2組，卵巢損傷給藥組(CTX+BUS)30只和空白對照組(Control)30只。給藥組采用一次性腹腔注射CTX 120 mg/kg+BUS 20 mg/kg[6]，CTX用生理鹽水配制成20 mg/ml的水溶性注射液，BUS用DMSO配制成66.7 mg/ml的脂溶性注射液。對照組腹腔注射相同體積的DMSO。

2. 動物的一般狀態(tài)及動情周期：觀察處理后各組小鼠的飲食、活動及皮毛變化等情況。每日8﹕00行陰道脫落細胞涂片，用95%乙醇固定5 min，顯微鏡觀察細胞的形態(tài)和種類。

3. 動物處理和取材：取材前2 d對各組小鼠進行PMSG注射，使各組小鼠的動情周期處于相同時期。處死小鼠前，準(zhǔn)確稱取小鼠體重，摘眼球取血，4℃放置過夜后，4 000 rpm離心5 min，分離血清保存于-20℃。處死小鼠，迅速從卵囊內(nèi)取出卵巢，準(zhǔn)確稱重(精確至0.001 g)，計算臟器系數(shù)：臟器系數(shù)=卵巢組織質(zhì)量/體質(zhì)量×100%。一側(cè)卵巢組織置于4%多聚甲醛中固定，包埋蠟塊用于制備組織切片，一側(cè)卵巢凍于-80℃冰箱用于提取RNA或蛋白。

4. 酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)：操作步驟嚴格按照FSH和E2試劑盒說明書進行，在酶標(biāo)包被板上加入待測血清樣品與相應(yīng)抗體37℃溫育30 min，加酶標(biāo)試劑37℃溫育30 min，顯色液顯色，經(jīng)終止液終止后迅速將樣品放入酶標(biāo)儀中測定吸光度。使用標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

5. HE染色法：將石蠟切片脫蠟、水化。蘇木精染色1 min，伊紅染色10 min，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。TE2000-U倒置相差顯微鏡(Nikon，日本)下觀察卵巢組織形態(tài)學(xué)變化，并對切片中的原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡、成熟卵泡進行計數(shù)。根據(jù)Tilly JL[7]報道的計算卵泡數(shù)目方法計算各級卵泡的最終數(shù)目。

6. 免疫組化檢測：取5 μm的石蠟切片，采用超敏二步免疫組織化學(xué)方法檢測小鼠卵巢組織顆粒細胞AMH分泌及Ki67的分布。AMH按照1∶40的比例稀釋，Ki67按照1∶100的比例稀釋。為了檢測一抗的特異性，我們用羊血清代替一抗作為陰性對照。TE2000-U倒置相差顯微鏡(Nikon，日本)下觀察并拍照。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié)果

一、小鼠的一般情況及動情周期的變化

給藥組小鼠注射CTX和BUS后活動減少，精神萎靡，體毛光澤度下降。對照組小鼠活動、體毛光澤度等一般情況正常，對外界刺激的反應(yīng)性好，靈活性強。

動情周期變化明顯，給藥組小鼠動情間期占動情周期的比例顯著高于對照組 (P<0.001)，動情期占動情周期的比例顯著低于對照組 (P<0.001)(圖1)。

兩組比較，*P<0.001圖1　對照組和給藥組小鼠的動情周期構(gòu)成

二、化療藥物對血清E2和FSH水平的影響

用ELISA法檢測小鼠血清中E2和FSH的水平。結(jié)果顯示，與對照組相比，給藥組小鼠血清中E2濃度明顯降低 (P<0.001)，給藥組小鼠血清FSH濃度有所升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

表1　小鼠血清E2、FSH水平(x-±s)

注：與對照組比較，*P<0.001

三、化療藥物對卵巢臟器系數(shù)的影響

臟器系數(shù)是藥物安全性評價中一種必要的檢測指標(biāo)。觀察卵巢肉眼可見給藥組卵巢體積明顯小于對照組 (圖2A)，卵巢的臟器系數(shù)在給藥組顯著低于對照組(P<0.01) (圖2B)。

A. 卵巢外觀；B. 卵巢臟器系數(shù)。兩組比較，*P<0.01圖2　對照組和給藥組小鼠卵巢的外觀體積

四、化療藥物對卵巢組織形態(tài)和各級卵泡數(shù)量的影響

卵巢組織結(jié)構(gòu)的變化是評價化療藥物危害性的重要指標(biāo)。HE染色顯示對照組小鼠卵巢體積較大，可見生長活躍、發(fā)育良好的原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡、成熟卵泡，且有很多排卵前的竇狀卵泡，卵母細胞周邊顆粒細胞排列緊密、整齊，亦可見發(fā)育良好的黃體，卵巢組織中未見炎細胞浸潤(圖3ⅠA)；給藥組小鼠卵巢萎縮明顯，結(jié)構(gòu)混亂，各階段生長卵泡數(shù)目明顯減少，僅有少數(shù)原始卵泡，卵巢卵母細胞周邊顆粒細胞明顯減少、排列紊亂、細胞間隙增大，大部分間質(zhì)組織為無功能白體(圖3ⅠB)。

與對照組小鼠相比，給藥組小鼠原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡和成熟卵泡數(shù)均顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖3Ⅱ)。

Ⅰ. 卵巢組織形態(tài)(A. 對照組；B. 給藥組)；Ⅱ.各級卵泡數(shù)目(a.始基卵泡；b. 初級卵泡；c. 次級卵泡；d. 成熟卵泡；e.黃體；f. 閉鎖卵泡)。兩組比較，*P<0.05，**P<0.01圖3　對照組和給藥組小鼠卵巢卵泡的病理學(xué)改變(HE染色 ×50)

五、化療藥物對卵巢儲備能力的影響

AMH是發(fā)育的卵泡細胞分泌的激素，女性卵巢中AMH的水平是其卵巢儲備能力的一個好的指示劑[8-9]。免疫組化檢測顯示對照組小鼠竇前卵泡顆粒細胞高表達AMH，小竇卵泡顆粒細胞亦表達AHM，竇狀卵泡不表達AMH；給藥組小鼠卵巢幾乎檢測不到AMH的陽性信號，提示化療藥物降低了卵巢的儲備能力(圖4)。

六、化療藥物對小鼠卵巢細胞增殖的影響

Ki67是一種增殖細胞相關(guān)的核抗原[10]，在細胞增殖中是不可缺少，可作為標(biāo)記細胞增殖狀態(tài)的抗原。免疫組化檢測顯示對照組小鼠各級卵泡染色均較深，均處于增殖期，給藥組小鼠各級卵泡幾乎不著色，少有處于增殖期的細胞(圖5)。

A. 對照組；B. 給藥組；C. 陰性對照組(a. 始基卵泡；b. 初級卵泡；c. 次級卵泡；d. 成熟卵泡；e.黃體)圖4　對照組和給藥組小鼠卵巢組織顆粒細胞中AMH分泌情況(免疫組化染色 ×100)

A. 對照組；B. 給藥組；C. 陰性對照組；A～C(×100)標(biāo)出區(qū)域相應(yīng)放大(×200)圖為A1～C1(a. 始基卵泡；b. 初級卵泡；c. 次級卵泡；d. 成熟卵泡；e.黃體；f. 閉鎖卵泡)圖5　對照組和給藥組小鼠卵巢組織中Ki67的表達分布(免疫組化染色)

討論

研究表明化療藥物可能誘發(fā)卵巢早衰，導(dǎo)致女性雌激素水平降低，降低生育能力，從而使女性生活質(zhì)量下降[11]。本研究顯示化療藥物環(huán)磷酰胺和白消安能夠擾亂性成熟的雌性小鼠的動情周期，降低雌激素的水平，并使小鼠卵巢組織中閉鎖卵泡數(shù)目增多和各級卵泡數(shù)目明顯減少，這些結(jié)果提示了化療藥物能夠引起小鼠的卵巢早衰。

小鼠的動情周期分為動情前期、動情期、動情后期、動情間期。我們的研究發(fā)現(xiàn)，與正常小鼠相比，化療藥物能顯著延長小鼠的動情間期，降低小鼠的動情期。這顯示了小鼠的動情周期被化療藥物擾亂，也提示了小鼠的卵巢功能被破壞。

雌性動物體內(nèi)的E2主要由卵巢合成、分泌，能增進和調(diào)節(jié)雌性器官及副性征的正常發(fā)育。E2的含量降低意味著卵巢分泌雌激素的功能降低。卵泡刺激素是由垂體前葉分泌的一種促性腺激素，能促進卵泡的成熟、雌性激素的合成與分泌，促進排卵，它的升高意味著卵巢功能的減退[12]。本研究發(fā)現(xiàn)給藥組小鼠血清E2的值顯著低于對照組，這與臨床卵巢早衰患者的表現(xiàn)類似。

卵巢組織形態(tài)觀察及卵泡計數(shù)結(jié)果顯示，與對照組相比，給藥組小鼠卵巢組織中閉鎖卵泡數(shù)目顯著增多，各級卵泡數(shù)目明顯減少，少有成熟卵泡，卵泡顆粒細胞結(jié)構(gòu)松散。這與卵巢早衰患者的卵巢有卵泡丟失、閉鎖、不排卵等表現(xiàn)相符。

AMH是由睪丸未成熟支持細胞和卵巢生長卵泡的顆粒細胞分泌的一類單糖蛋白，具有抑制雄性苗勒管發(fā)育、調(diào)節(jié)兩性生殖細胞和性腺發(fā)育的重要功能[13]。研究發(fā)現(xiàn)AMH具有抑制原始卵泡募集和通過降低卵泡對FSH的敏感性影響優(yōu)勢卵泡選擇的作用，是評價雌性動物卵巢儲備功能的敏感指標(biāo)[8-9]。我們研究顯示，AMH的水平在給藥組顯著低于對照組，提示化療藥物能夠降低卵巢的儲備能力。

環(huán)磷酰胺在體內(nèi)可經(jīng)一系列生物化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生磷酰胺氮芥，磷酰胺氮芥可與細胞內(nèi)的DNA發(fā)生烷化反應(yīng)，交叉聯(lián)結(jié)，干擾DNA的正常代謝，從而抑制細胞的生長繁殖[14]。白消安可作用于分裂細胞的G0/G1期，抑制細胞分裂增殖[15]。為此，我們研究了它們對卵巢細胞增殖能力的影響。研究發(fā)現(xiàn)在正常的卵巢組織中，始基卵泡、初級卵泡、次級卵泡和成熟卵泡均有明顯的細胞增殖，而在化療藥物處理的小鼠卵巢組織中幾乎檢測不到發(fā)生細胞增殖的卵泡。這些結(jié)果表明化療藥物可以顯著抑制卵巢細胞增殖，與其臨床作用機理相符。

此外，本研究選擇小鼠作為實驗動物是由于小鼠具有適應(yīng)性強、性情溫順、生長發(fā)育快、繁殖力強、實驗重復(fù)性好、自發(fā)性排卵、動情周期規(guī)律且易于觀察的特點[16]。雌性小鼠性成熟后，生殖器官發(fā)生周期性變化。為了取材時實驗小鼠處于同一周期，在取材前2 d給所有小鼠注射PMSG[17]，48 h后小鼠處于同一發(fā)情周期再處死小鼠進行后續(xù)實驗，得到的數(shù)據(jù)更加可信、具有說服力。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，化療藥物能夠通過抑制雌激素分泌、降低卵巢儲備能力和抑制卵巢細胞增殖等誘導(dǎo)卵巢早衰的發(fā)生。實驗結(jié)果不僅能為探討卵巢早衰的病理表現(xiàn)和發(fā)病機制提供實驗性模型，也能為卵巢早衰的治療提供動物模型。

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[編輯：辛玲]

Phenotypic analysis and possible mechanism of chemotherapy drugs induced ovarian damage

LU Xiao-dan1，2，LI Ying1，ZHANG Lu1，WANG Xue-qin1，MA Xu1*，XIA Hong-fei1*

1.Reproductive&GeneticCenterofNationalResearchInstituteforFamilyPlanning，Beijing100081 2.GraduateSchool，PekingUnionMedicalCollege，Beijing100730

【Abstract】Objective： To investigate the effect and possible mechanism of chemotherapy drugs induced ovarian damage in mice.

Key words：Chemotherapy drugs；Ovarian damage；Phenotype analysis；Anti-Mullerian hormone；Proliferation

DOI：10.3969/j.issn.1004-3845.2016.06.010

【收稿日期】2015-12-16；【修回日期】2016-01-21

【基金項目】國家自然科學(xué)基金(No. 30800396)和中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項(2015GJZ01)

【作者簡介】呂曉丹，女，碩士研究生，生殖遺傳專業(yè). (*通訊作者，Email：hongfeixia@126.com)