H7亞型禽流感病毒HA基因的原核表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的反應(yīng)原性分析

董斌+陳海超 楊倫 耿文學(xué) 熊曉妍 孫興臣+李敏婕+陳聞+蔣家森

摘要：為構(gòu)建新型H7亞型禽流感HA基因的原核表達(dá)載體，并在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)。從NCBI數(shù)據(jù)庫下載H7亞型禽流感HA全基因序列，合成HA基因；定向克隆到原核表達(dá)載體pET-32a（+）的多克隆位點(diǎn)中，構(gòu)建重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32a（+）-HA；轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21（DE3）中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE和Western-blot法鑒定。結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切及基因測序鑒定構(gòu)建正確；重組的HA融合蛋白約為84 ku，大小與預(yù)期融合蛋白大小一致；重組HA融合蛋白可以與His標(biāo)簽單克隆抗體特異性結(jié)合，與H7陽性血清有較強(qiáng)的反應(yīng)原性。成功構(gòu)建了HA基因原核表達(dá)載體，并在大腸桿菌BL21（DE3）中獲得重組HA融合蛋白表達(dá)。

關(guān)鍵詞：H7N9禽流感病毒；HA基因；pET32a（+）；原核表達(dá)；反應(yīng)原性分析

中圖分類號： S852.65文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）10-0049-04

收稿日期：2015-09-01

基金項(xiàng)目：江蘇省句容市科委項(xiàng)目（編號：NY2013029）；江蘇省鎮(zhèn)江市農(nóng)業(yè)科技支撐項(xiàng)目（編號：SBK2014022021）；南京農(nóng)業(yè)大學(xué)教改項(xiàng)目（編號：2013Y021）；南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院教育教學(xué)改革研究項(xiàng)目；江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目。

作者簡介：董斌（1990—），男，黑龍江哈爾濱人，碩士研究生，研究方向?yàn)轭A(yù)防獸醫(yī)學(xué)。E-mail：1135220155@qq.com。

通信作者：許家榮，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事學(xué)獸醫(yī)流行病學(xué)研究、畜禽傳染病防治、生物制品研制。E-mail：xjr@njau.edu.cn。[HJ]

[ZK）]

H7N9型禽流感病毒感染人事件于2013年3月底在華東地區(qū)（上海和安徽2地）率先發(fā)生，感染以迅速進(jìn)展的肺炎、呼吸衰竭、急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）和致死性轉(zhuǎn)歸為特點(diǎn)[1]。目前，已經(jīng)在雞、鴿子中檢測到H7N9型禽流感病毒，但這些家禽不表現(xiàn)明顯的臨床癥狀。陳化蘭團(tuán)隊(duì)在《科學(xué)通報(bào)》的最新研究顯示，近期在我國導(dǎo)致人感染的新型H7N9流感病毒與同一時期存在于活禽市場上的H7N9流感病毒高度同源；該新型H7N9流感病毒是不同來源病毒的重組病毒，它的6個內(nèi)部基因來源于H9N2禽流感病毒，HA基因來源于浙江鴨H7N3，NA基因來自韓國野生鳥類攜帶的H7N9；H7N9病毒的受體結(jié)合位點(diǎn)獲得了部分人流感病毒特征的突變，病毒再感染人后獲得了關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)的適應(yīng)性突變，這可能與該病毒對人的感染和致死能力有關(guān)[2]。尚未證實(shí)此類病毒是否具有人傳染人的特性，但已有家族式感染的報(bào)道[3]，到目前已有數(shù)名患者搶救無效死亡。

禽流感病毒在生物分類學(xué)上屬正黏病毒科（Orthomyxoviridae）A型流感病毒屬（Influenzavirus A）[4-5]。A型流感病毒基因組為8個節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA，編碼11種功能蛋白。病毒基因組分節(jié)段的特性使流感病毒容易發(fā)生基因重排。A型流感病毒呈多形性，多為球形，然而新分離的主要為絲狀。病毒直徑80～120 nm。病毒粒子結(jié)構(gòu)的最外層為來自于宿主細(xì)胞的雙層類脂囊膜。囊膜上有3種蛋白突起（又稱纖突）：血凝素（hemagglutinin，HA）、神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase，NA）和基質(zhì)蛋白2（matrixprotein，M2），這3種突起均以疏水性氨基酸錨定在類脂膜上。中間層為基質(zhì)蛋白1（M1）。最里層是呈螺旋型對稱的核衣殼，含有核蛋白（neucleoprotein，NP）、3種多聚蛋白酶和病毒基因組RNA[6]。迄今為止，已知A型流感病毒的HA有16個亞型（H1-H16）[7]，NA有9個亞型（N1-N10），HA和NA之間的不同組合使A型流感病毒有許多亞型（如H1N1、H3N2、H5N1、H9N2等），各亞型之間無交互免疫力。其中高致病性的主要有H7和H5亞型。在A型流感病毒的8個RNA節(jié)段中，節(jié)段4編碼血凝素HA。HA屬于Ⅰ型膜糖蛋白，是流感病毒最重要的表面蛋白。新合成的HA在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中進(jìn)行糖基化，并在通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)時切除氨基端含14～18個氨基酸的信號肽。HA以同源三聚體的形式突出在囊膜表面，呈棒狀，由球形的頭部和頸部組成，其中球部在HA1亞單位內(nèi)，包括受體結(jié)合位點(diǎn)和大部分的抗原位點(diǎn)；頸部由全部HA2和部分HA1亞單位組成。HA 是流感病毒的主要表面抗原，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性中和抗體[8-11]。流感病毒感染后產(chǎn)生能針對病毒HA、NA、M和NP蛋白的抗體，但只有針對HA頂部球形區(qū)的抗體能阻止病毒吸附到宿主細(xì)胞受體上[12]，從而中和病毒的感染力。這些抗體可以通過病毒中和試驗(yàn)或HI試驗(yàn)測定。

檢測雞血清樣品中H7亞型抗體能有助于了解雞群的感染情況，檢測抗體可以用中和試驗(yàn)或血凝抑制（HI）試驗(yàn)來進(jìn)行，但操作過程時間較長，影響因素多且比較繁瑣，所以建立1種快速、易標(biāo)準(zhǔn)化、能同時檢測大量樣品的檢測方法尤為迫切，例如膠體金、間接ELISA等。本次試驗(yàn)只進(jìn)行到HA基因的原核表達(dá)以及反應(yīng)原性的鑒定，檢測方法的建立有待后續(xù)研究。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1質(zhì)粒、細(xì)胞從NCBI下載此次疫情GenBank最早發(fā)布的A/Hangzhou/1/2013（H7N9）株HA全基因序列，Gen-Bank登錄號為KC853766。自行設(shè)計(jì)優(yōu)化，由上海捷瑞生物技術(shù)公司合成HA基因，并將其插入質(zhì)粒pET-32a（+）中，構(gòu)建pET-32a（+）-HA重組質(zhì)粒。實(shí)驗(yàn)室常備大腸桿菌BL21。

1.1.2主要材料限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ、10 000 bp DNA Marker、小鼠抗6× His組氨酸單克隆抗體（mAb）、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗雞IgY均購自大連寶生物工程有限公司。商品化的麗春紅染色液，增強(qiáng)型ECL發(fā)光液，NC膜，濾紙購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。H7陽性血清來自哈爾濱獸醫(yī)研究所。

1.2方法

1.2.1HA基因序列及生物信息學(xué)分析利用DNAstar中Protean進(jìn)行抗原表位分析。

1.2.2重組質(zhì)粒的鑒定對上海捷瑞生物有限公司合成的重組質(zhì)粒pET-32（+）-HA進(jìn)行雙酶切鑒定。以該合成重組質(zhì)粒為模板。20 μL酶切體系：質(zhì)粒8 μL（100 ng/μL），10×酶切buffer 2 μL，BamHⅠ 1 μL，XhoⅠ 1 μL，加ddH2O至 20 μL，37 ℃酶切1 h。重組質(zhì)粒陽轉(zhuǎn)的單菌落菌液送南京金斯瑞生物科技有限公司測序。

1.2.3感受態(tài)BL21制備在LB平板上挑取大腸桿菌BL21單個菌落接種于3.0 mL LB液體培養(yǎng)基中 200 r/min過夜振蕩培養(yǎng)。次日按20 μL菌液接種至3 mL新的LB培養(yǎng)基中 200 r/min 振蕩培養(yǎng)3～4 h至D600 nm=0.4，將細(xì)菌移至 1.5 mL 的滅菌離心管中，離心去上液。先加200 μL CaCl2重懸菌體，再加800 μL CaCl2（冰上進(jìn)行），冰浴30 min，然后 4 ℃ 12 000 r/min 離心1 min，取上液最后用100 μL CaCl2重懸細(xì)菌，即為新鮮制備的感受態(tài)BL21。

1.2.4質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21取pET32a（+）-HA重組質(zhì)粒，pET32a空載體各1 μL，分別加入到新鮮制備的大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30 min，然后置于42 ℃水浴中熱休克90 s，迅速置于冰中冷卻5 min，加入 800 μL LB培養(yǎng)基，37 ℃ 180 r/min振蕩培養(yǎng)45 min，取 100 μL 凃布于帶有氨芐抗性的平板上，37 ℃培養(yǎng)8 h。

1.2.5重組表達(dá)菌的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)[JP2]將DNA測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli BL21（DE3）中，同時另取空載體pET-32（+）化至E.coli BL21（DE3）作對照，涂布于LB（Amp+）培養(yǎng)基平板，挑取單克隆菌落接種于3 mL LB（Amp+），37 ℃ 200 r/min振蕩培養(yǎng)6～8 h，取菌20 μL至4 mL LB（Amp+）液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 200 r/min振蕩培養(yǎng)基至D600 nm為0.8，取1 mL樣品于無菌1.5 mL EP管中作為誘導(dǎo)前對照，向上述菌液中加入終濃度為1 mol/L的IPTG進(jìn)行重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，并對誘導(dǎo)時間及溫度進(jìn)行優(yōu)化篩選。超聲裂菌器裂菌。

1.2.6SDS-PAGE分析表達(dá)產(chǎn)物表達(dá)產(chǎn)物加5×SDS蛋白上樣緩沖液煮沸處理后，進(jìn)行SDS-PAGE分析，選用5%濃縮膠、10%分離膠，濃縮膠80 V恒定電壓，分離膠120 V恒定電壓，考馬斯亮藍(lán)染色，脫色液脫色，鑒定分析融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。

1.2.7重組蛋白的Western-Blot鑒定表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)印至NC膜上，5%脫脂奶粉封閉3 h，1 ∶[KG-*3]20 000 稀釋小鼠抗6×His mAb室溫3 h，4 ℃過夜，PBST洗膜3次，1 ∶[KG-*3]3 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG室溫孵育3 h，PBST洗膜3次，增強(qiáng)型ECL發(fā)光液顯影。以重組蛋白為抗原，以商品化H7陽性血清（哈爾濱獸醫(yī)研究所）為一抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗雞IgG為二抗，增強(qiáng)型ECL發(fā)光液為顯色液，以此來證明該蛋白的反應(yīng)原性。

1.2.8曝光將涂布發(fā)光液的NC膜置于暗室進(jìn)行曝光，將膠片置于顯色液中顯色，水中洗去顯色液，再置于定影液中定影，待膠片透明定影結(jié)束，觀察結(jié)果。

2結(jié)果與分析

2.1HA蛋白的親水性和抗原性預(yù)測及表面可能性分析[HT]

利用DNAStar中Protean軟件分析結(jié)果（圖1）顯示，HA蛋白的二級結(jié)構(gòu)以α螺旋和β螺旋為主，對其抗原性及表面可能性的分析結(jié)果顯示，該蛋白抗原可能位點(diǎn)豐富，具有良好的親水性和疏水性。

2.2重組質(zhì)粒酶切鑒定

重組質(zhì)粒pET-32a（+）-HA經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，可獲得大小5 900 bp的載體片段和1 609 bp的基因片段，該片段大小與HA基因片段大小相符（圖2）。以空載體酶切圖（圖3）作為對照，雙酶切鑒定正確。DNA測序結(jié)果正確。

2.3重組質(zhì)粒表達(dá)分析

[JP2]HA蛋白約59 ku， 對含有重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a（+）-HA的重組大腸桿菌BL21利用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)出HA-His融合蛋白，融合蛋白含有25 ku的His標(biāo)簽蛋白（圖4）；對蛋白表達(dá)條件優(yōu)化后表明，HA-His蛋白在28 ℃下1.0 mol/L IPTG[CM（19]誘導(dǎo)8[KG*3]h表達(dá)量最大，融合蛋白大小約為[CM）][FL）]

84 ku （圖5、圖6）；重組表達(dá)蛋白在包涵體和上清中都存在，在上清中表達(dá)量較高（圖7）。

2.4重組融合蛋白Western-Blot 鑒定

分別采用His標(biāo)簽抗體和H7陽性血清對HA-His融合蛋白進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖8、圖9所示，同種抗體均能在分量約為84 ku處檢測到特異性條帶，說明融合蛋白能夠特異性表達(dá)，與預(yù)期結(jié)果一致。

3討論

[CM（24]本研究通過原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)H7亞型禽流感病毒的HA抗原，從上述SDS-PAGE、Western blot的檢測結(jié)果可以得知，HA蛋白獲得表達(dá)并與H7陽性血清產(chǎn)生良好的反應(yīng)原性，重組蛋白在包涵體和上清中都存在，且上清中較多?？偨Y(jié)本次試驗(yàn)，HA蛋白的二級結(jié)構(gòu)以α螺旋和β螺旋為主，對其抗原性及表面可能性的分析結(jié)果顯示，該蛋白抗原可能位點(diǎn)豐[CM（25]富，該蛋白具有良好的親水性和疏水性。根據(jù)目的基因序列預(yù)測蛋白的大小應(yīng)該為84 ku，在SDS-PAGE鑒定中顯示目的蛋白條帶出現(xiàn)在66.2～116 ku，符合預(yù)測結(jié)果，且發(fā)現(xiàn)低溫誘導(dǎo)表達(dá)量大于37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)量，在低溫誘導(dǎo)時，誘導(dǎo)6 h與 8 h 表達(dá)量變化不大，在37 ℃誘導(dǎo)時，誘導(dǎo)4、6、8 h，表達(dá)量有明顯梯度增加，時間再延長表達(dá)量變化不大。分別采用His標(biāo)簽抗體和H7陽性血清對HA-His融合蛋白進(jìn)行檢測，同種抗體均能在分子量約為84 ku處檢測到特異性條帶，說明融合蛋白能夠特異性表達(dá)，并與H7陽性血清產(chǎn)生良好反應(yīng)性。本研究只進(jìn)行到HA基因的原核表達(dá)以及反應(yīng)原性的鑒定，建立1種快速、易標(biāo)準(zhǔn)化、能同時檢測大量樣品的檢測方法有待后續(xù)研究。

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