顏　娟，鄭茂東，崔玉環(huán)，趙秀花，班旭霞，趙虹琇

(1.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，張家口 075000;2.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院老年科，張家口 075000)

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牡荊苷對(duì)小鼠腦缺血/再灌注損傷抗氧化應(yīng)激作用

顏娟1，鄭茂東1，崔玉環(huán)2，趙秀花1，班旭霞1，趙虹琇1

(1.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，張家口 075000;2.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院老年科，張家口 075000)

摘要：目的探討牡荊苷對(duì)小鼠腦缺血/再灌注損傷后腦組織中丙二醛(malondialdehyde，MDA)、一氧化氮(nitric oxide，NO)含量和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)活性的影響。方法雄性昆明種小鼠70只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組、尼莫地平組(0.6 mg·kg-1)、牡荊苷組(10、20、40 mg·kg-1)。采用線栓法制備小鼠腦缺血/再灌注損傷模型，采用試劑盒法測(cè)定MDA、NO含量和SOD、NOS活性。結(jié)果再灌注24 h后，小鼠腦缺血/再灌注后神經(jīng)功能評(píng)分模型組顯著升高(P<0.01)，牡荊苷組顯著降低(P<0.05)。模型組腦組織中MDA、NO含量及NOS活性顯著升高(P<0.01)，SOD活性顯著降低(P<0.01)；牡荊苷組腦組織中MDA、NO含量和NOS活性顯著降低(P<0.05)，SOD活性增強(qiáng)(P<0.01)。結(jié)論牡荊苷腦保護(hù)作用可能是通過(guò)抗氧化應(yīng)激作用實(shí)現(xiàn)的。

關(guān)鍵詞：牡荊苷；丙二醛；超氧化物歧化酶；一氧化氮；一氧化氮合酶；腦缺血/再灌注

對(duì)腦缺血/再灌注損傷的研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激[1]、自由基[2]、細(xì)胞凋亡[3]、興奮性氨基酸[4]等諸多因素參與其中。機(jī)體內(nèi)存在的酶系能夠清除自由基,如超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)使細(xì)胞免受氧化帶來(lái)的損傷，而丙二醛(malondialdehyde，MDA)的含量不但直接反映脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的程度和水平，而且間接反映清除自由基的能力[5]。缺血/再灌注損傷機(jī)制極為復(fù)雜，氧化應(yīng)激即可直接損傷細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞損傷，還可通過(guò)線粒體途徑[6]、神經(jīng)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)[7]、溶酶體結(jié)構(gòu)和功能的變化[8]等間接導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。因此，激活抗氧化系統(tǒng)對(duì)抗氧化應(yīng)激是減輕缺血/再灌注損傷的重要機(jī)制。

金蓮花是毛茛科植物金蓮花的干燥花及花蕾，有消腫明目，清熱解毒的功效，臨床上主要用于扁桃體炎、上呼吸道感染等。牡荊苷屬黃酮碳苷類，是金蓮花主要有效成分單體，前期藥理實(shí)驗(yàn)表明牡荊苷對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠腦損傷具有保護(hù)作用[9]。本研究探討了牡荊苷對(duì)小鼠腦缺血/再灌注損傷后腦組織MDA、一氧化氮(nitric oxide，NO)水平和SOD、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)活性的影響，旨在探討牡荊苷對(duì)腦缺血/再灌注損傷的抗氧化應(yīng)激作用。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1藥品與試劑

牡荊苷由河北北方學(xué)院藥物研究所提供，純度>98%；尼莫地平注射劑(nimodipine，Nim)；MDA測(cè)定試劑盒、SOD測(cè)定試劑盒、NO測(cè)定試劑盒、NOS測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；其他試劑均為分析純。

1.1.2動(dòng)物

昆明種小鼠70只，體質(zhì)量22～24 g，雄性，由河北北方學(xué)院動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：XCYK(冀)2010-2014。

1.2方法

1.2.1牡荊苷溶液的配制

N，N-二甲基甲酰胺溶解牡荊苷，吐溫-80助溶，振蕩混勻，加入生理鹽水(N，N-二甲基甲酰胺∶吐溫-80∶生理鹽水=1∶1∶20)。

1.2.2分組及模型制備

70只小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組、尼莫地平組(0.6 mg·kg-1)、牡荊苷(10、20、40 mg·kg-1)組，每組10只。牡荊苷組在缺血/再灌注前連續(xù)腹腔給予牡荊苷3 d，缺血/再灌注24 h后取材。小鼠稱重后3.5%水合氯醛(10 mL·kg-1)腹腔麻醉，仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，按文獻(xiàn)方法[10]制備腦缺血/再灌注小鼠模型，并于術(shù)后48 h阻斷兩側(cè)頸總動(dòng)脈造成大腦缺血狀態(tài)，5 min后恢復(fù)血液再灌注。假手術(shù)組手術(shù)過(guò)程與缺血/再灌注組一致，但只暴露頸總動(dòng)脈，并不進(jìn)行插線。

1.3神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分

小鼠蘇醒后，觀察存活小鼠行為變化，于再灌注24 h后參考Clark評(píng)分[11](0～28分)。

1.4MDA、NO含量和SOD、NOS活性的測(cè)定

再灌注24 h后立即處死動(dòng)物，取腦缺血側(cè)2/3腦組織，除去樣本表面附屬物，生理鹽水沖洗3次后，濾紙吸干水分，制成10%腦勻漿，4 000 r·min-1離心10 min，取上清，依次按MDA試劑盒、SOD試劑盒、NO試劑盒、NOS試劑盒方法測(cè)定。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1各組小鼠腦缺血/再灌注損傷神經(jīng)功能缺陷評(píng)分比較

假手術(shù)組與正常對(duì)照組相比，差異無(wú)顯著性(P>0.05);模型組與假手術(shù)組相比神經(jīng)功能缺陷評(píng)分差異有顯著性(P<0.01)；牡荊苷10、20、40 mg·kg-1組與模型組相比神經(jīng)功能缺陷評(píng)分差異有顯著性(P<0.05)(表1)。

表1 各組小鼠腦缺血/再灌注損傷神經(jīng)功能缺陷評(píng)分比較±s)

注：與假手術(shù)組比較*P<0.01；與模型組比較#P<0.01，##P<0.05

2.2各組小鼠腦缺血/再灌注損傷腦組織中MDA、NO含量和SOD、NOS活性比較

與假手術(shù)組相比，模型組小鼠腦組織中MDA含量明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，牡荊苷10、20、40 mg·kg-1組小鼠腦組織中MDA含量降低(P<0.05)。與假手術(shù)組相比，模型組小鼠腦組織中SOD活性明顯降低(P<0.01)；與模型組相比，牡荊苷10、20、40 mg·kg-1組小鼠腦組織中SOD活性顯著增強(qiáng)(P<0.01)。與假手術(shù)組相比，模型組小鼠腦組織NO含量、NOS活性顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，牡荊苷10、20、40 mg·kg-1組腦組織中NO含量、NOS活性顯著降低(P<0.05)。假手術(shù)組與正常對(duì)照組相比，差異無(wú)顯著性(P>0.05)(表2)。

表2　各組小鼠腦缺血/再灌注損傷腦組織中MDA、NO含量和SOD、NOS活性比較±s)

注：與假手術(shù)組比較*P<0.01；與模型組比較#P<0.01，##P<0.05

3討論

在腦缺血/再灌注過(guò)程中，氧化應(yīng)激損傷、自由基損傷、氧化劑過(guò)剩、解毒系統(tǒng)失活、抗氧化劑不足[12]多個(gè)環(huán)節(jié)相互作用。過(guò)量的氧自由基作用于細(xì)胞膜不飽和脂肪酸及細(xì)胞內(nèi)各種酶發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，使質(zhì)膜破壞和功能障礙，誘導(dǎo)DNA、RNA、蛋白質(zhì)交聯(lián)和氧化反應(yīng)，引起神經(jīng)元死亡或凋亡[13]。腦缺血/再灌注時(shí)，雖然組織重新獲得供氧可緩解腦組織的缺血缺氧狀態(tài)，但同時(shí)也產(chǎn)生大量自由基，使其大量聚集，腦組織損傷進(jìn)一步加重。在人體正常狀態(tài)下，體內(nèi)存在天然的自由基清除系統(tǒng)。SOD是一類金屬酶，能將活性氧歧化為O2和H2O2，是內(nèi)源性自由基清除劑，可通過(guò)歧化方式清除自由基，保護(hù)細(xì)胞免受損傷，因此，機(jī)體清除氧自由基的能力可用SOD活力的高低表示。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組小鼠腦組織中MDA含量明顯升高，SOD活性明顯降低，表明腦缺血/再灌注后氧化產(chǎn)物顯著增加，而清除自由基的主要活性酶活性顯著下降，抗氧化能力降低；牡荊苷組能夠顯著降低MDA水平，表明牡荊苷腦保護(hù)作用可能因其可減輕脂質(zhì)過(guò)氧化損傷及牡荊苷具有增強(qiáng)SOD活性的作用。

NO是最早發(fā)現(xiàn)的參與體內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的氣體信號(hào)分子，NO也是一種自由基，是新型信使。在正常人體生理?xiàng)l件下，NO對(duì)腦具有保護(hù)作用，但內(nèi)源性或外源性NO產(chǎn)生過(guò)量則會(huì)直接導(dǎo)致神經(jīng)毒性[14]。NO由L-精氨酸在NOS作用下生成，具有雙重作用，即可擴(kuò)張腦血管、增加腦血流、改善腦缺血癥狀，又具有抑制線粒體呼吸、損傷DNA和過(guò)氧化膜脂質(zhì)等作用導(dǎo)致神經(jīng)元損傷[15]。研究表明，NO參與腦缺血/再灌注損傷發(fā)生發(fā)展的諸多環(huán)節(jié)[16]。其主要作用機(jī)制是NO與氧或超氧自由基反應(yīng)，生成毒性更大的超氧亞硝酸根，又可進(jìn)一步降解為NO2和OH自由基，這些產(chǎn)物可引起細(xì)胞蛋白質(zhì)、核酸及脂肪膜損傷，使細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，導(dǎo)致大量神經(jīng)元死亡及腦組織損傷[17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示腦缺血/再灌注后NO含量升高，NOS活性明顯增加，與假手術(shù)組相比，模型組NO含量、NOS活性顯著升高；與模型組相比，牡荊苷組NO含量、NOS活性顯著降低，減輕了腦缺血/再灌注損傷。

牡荊苷在腦缺血/再灌注損傷中具有很強(qiáng)的抗氧化應(yīng)激能力，但腦缺血/再灌注損傷的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，各種因素間可能相互促進(jìn)、相互影響，牡荊苷腦缺血/再灌注損傷保護(hù)作用機(jī)制需要進(jìn)一步深入研究。

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[責(zé)任編輯：李薊龍英文編輯：劉彥哲]

Anti-oxidative Stress of Vitexin on Brain in Mice with Cerebral Ischemia-Reperfusion Injury

YAN Juan1,ZHENG Mao-dong1,CUI Yu-huan2,ZHAO Xiu-hua1,BAN Xu-xia1,ZHAO Hong-xiu1

(1.Department of Pharmacy,The First Affiliated Hospital,Hebei North University,Zhangjiakou 075000,Hebei China;2.Department of Geriatrics,The First Affiliated Hospital,Hebei North University,Zhangjiakou 075000,Hebei China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of vitexin on the content of MDA and NO and the activities of SOD and NOS in mice with cerebral ischemia-reperfusion injury.Methods70 Kunming male mice were randomly divided into the control group,sham-operation group,cerebral ischemia-reperfusion group,nimodipine group(0.6 mg·kg-1)and vitexin groups(10,20,40 mg·kg-1).Mice were prepared with cerebral ischemia-reperfusion injury by suture method,and then the contents of MDA and NO and the activities of SOD and NOS were determined by kit method.ResultsAfter reperfusion 24 h,neurological deficit score of cerebral ischemia-reperfusion group was significantly higher than that of the sham-operation group(P<0.01);whereas those of vitexin groups were significantly lower than the value of the model group(P<0.05).The contents of MDA and NO and the activity of NOS significantly increased(P<0.01),the activity of SOD significantly decreased(P<0.01)in cerebral ischemia-reperfusion group,vitexin groups significantly reduced the contents of MDA and NO and the activity of NOS(P<0.05),enhancing the activity of SOD(P<0.01).ConclusionThe protective effect of vitexin on cerebral ischemia-reperfusion injury might be produced by anti-oxidative stress.

Key words:vitexin;malondialdehyde;superoxide dismutase;nitric oxide;nitric oxide synthase;cerebral ischemia-reperfusion

基金項(xiàng)目：河北省衛(wèi)生廳項(xiàng)目(No.20150474)

作者簡(jiǎn)介：顏娟(1984-)，女，博士，主管藥師，研究方向，神經(jīng)藥理學(xué)。

中圖分類號(hào)：R 285.5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

DOI：10.3969/j.issn.1673-1492.2016.02.004

來(lái)稿日期：2015-07-14