凹葉厚樸低溫脅迫SSH文庫(kù)的構(gòu)建及差異基因的表達(dá)分析

陸 寧， 陳劍成， 鄭郁善

(1.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院，福建福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)藝術(shù)園林學(xué)院,福建福州 350002)

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凹葉厚樸低溫脅迫SSH文庫(kù)的構(gòu)建及差異基因的表達(dá)分析

陸 寧1， 陳劍成1， 鄭郁善2*

(1.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院，福建福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)藝術(shù)園林學(xué)院,福建福州 350002)

摘要[目的]通過(guò)凹葉厚樸差減文庫(kù)的構(gòu)建及序列分析，找出其主要抗寒相關(guān)功能基因。[方法]隨機(jī)挑選單克隆菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)，對(duì)837個(gè)陽(yáng)性克隆測(cè)序后進(jìn)行拼接得到97個(gè) unigenes，將97個(gè) unigenes在NCBI進(jìn)行BLAST比對(duì),后進(jìn)行BLAST2GO功能分類，推定出11個(gè)相關(guān)基因進(jìn)行熒光定量PCR。[結(jié)果]CHS、APX、TRX、ERF、DREB、LHCB、WRKY、HSP、PP2C、GAPDH 10個(gè)基因在凹葉厚樸受到低溫侵害時(shí)出現(xiàn)差異表達(dá)，推斷這10個(gè)基因在低溫時(shí)可能表現(xiàn)出防御機(jī)制。[結(jié)論]該研究為與凹葉厚樸親緣關(guān)系相近的植物抗低溫特性遺傳育種提供理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞凹葉厚樸;低溫脅迫;SSH文庫(kù);基因表達(dá)量

溫度是影響凹葉厚樸生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵因素, 探尋低溫脅迫對(duì)凹葉厚樸分子機(jī)理的影響具有重要的理論和實(shí)踐意義。植物為了應(yīng)對(duì)寒冷氣候進(jìn)化形成了具有抗低溫能力的遺傳特性[1]。當(dāng)受到低溫傷害時(shí)植物的抗寒基因才能被誘導(dǎo)表達(dá)啟動(dòng)。植物在抵御低溫過(guò)程中是由多個(gè)基因共同參與代謝調(diào)控,單個(gè)基因無(wú)法增加植物的抗寒性[2]。根據(jù)抗寒過(guò)程中代謝產(chǎn)物的作用歸為兩類：調(diào)控基因和保護(hù)基因[3]。調(diào)控基因是編碼能與操縱序列結(jié)合的調(diào)控蛋白的基因,能夠起到調(diào)節(jié)保護(hù)基因的表達(dá)。保護(hù)基因轉(zhuǎn)錄翻譯而成的蛋白及其他代謝產(chǎn)物可以直接起到抗低溫的作用[4]。

目前，對(duì)凹葉厚樸及其親緣相近植物有關(guān)抗寒基因的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。筆者通過(guò)凹葉厚樸差減文庫(kù)的構(gòu)建及序列分析，找出其主要抗寒相關(guān)功能基因，分析代謝途徑，以期為與凹葉厚樸親緣關(guān)系相近的植物抗低溫特性遺傳育種提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料選取11月份生長(zhǎng)健壯、粗細(xì)接近的2年生凹葉厚樸，來(lái)源于三明明溪。

1.2試劑大腸桿菌 DH5α和 Trizol 試劑均購(gòu)自諾普生物有限公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和載體 pMD18-T vector 均購(gòu)自寶生物工程有限公司。其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3方法

1.3.1植物半致死溫度的測(cè)定。幼苗低溫鍛煉后,選取適量材料分別置于-2、-4、-6、-8、-10、-12、-14、-16 ℃的低溫冰箱中低溫脅迫24 h,將頂芽取下，加入 ddH2O后用電導(dǎo)率儀測(cè)定第1次內(nèi)含物滲透值(Ci);然后將其置于沸水中水浴10 min后25 ℃下放置12 h,漩渦振蕩后測(cè)定第2次電解質(zhì)滲透值(Ct),按Y=(Ci-Cw)/(Ct-Cw) 計(jì)算試樣的電解質(zhì)滲透率,每處理重復(fù)3次。

對(duì)測(cè)定后的結(jié)果用Logistic方程對(duì)溫度與電解質(zhì)滲透值關(guān)系進(jìn)行擬合,用坐標(biāo)曲線的拐點(diǎn)溫度作為試樣的臨界溫度。Logistic方程：Y=K/(l+aebt)。

1.3.2植物的低溫脅迫處理。為使driver組和tester組除溫度不同其他生長(zhǎng)條件一致，采取如下方法進(jìn)行試驗(yàn)：取4棵凹葉厚樸苗,分為2盆,放于25 ℃人工氣候培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d,7 d后將一盆凹葉厚樸留于人工氣候培養(yǎng)箱中,作為driver組；將另一盆凹葉厚樸于生長(zhǎng)期轉(zhuǎn)移至溫度為半致死溫度的人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d,作為tester組。3 d后將2組頂芽采下除去最外層,保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3RNA 的提取和 cDNA 的合成。采用天根RNApreppure植物總試劑盒法提取凹葉厚樸頂芽總RNA,取得到的2管driver組(常溫)總RNA提取液與2管tester組(低溫)RNA提取液各5μL于PCR管中進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。

使用 clontech公司In-Fusion SMARTer DirectionalcDNA Library Construction Kit合成cDNA，操作步驟按照使用說(shuō)明書進(jìn)行。加入小于1 μg的起始模板總RNA,當(dāng)進(jìn)行至10個(gè)循環(huán)后暫停程序,取出反應(yīng)液30 μL至新的PCR管,作為探尋最佳循環(huán)數(shù)的試驗(yàn)液體,剩余70 μL反應(yīng)液置于4 ℃冰箱備用,當(dāng)進(jìn)行至13、16、19、22個(gè)循環(huán)，取出反應(yīng)液5 μL至新的PCR管,將上述各循環(huán)產(chǎn)物取出5 μL通過(guò)電泳得到的條帶尋找最佳循環(huán)數(shù)。之后將剩下的第一鏈產(chǎn)物全部進(jìn)行至最佳循環(huán)數(shù)。

1.3.4抑制SSH文庫(kù)的構(gòu)建。 抑制SSH雜交具體操作按照 PCR Select TM cDNA Subtraction Kit(Clontech 公司)的使用說(shuō)明書進(jìn)行。以低溫條件下凹葉厚樸cDNA作為試驗(yàn)組(tester),25 ℃凹葉厚樸cDNA 作為驅(qū)動(dòng)組(driver)。經(jīng) Rsa I 酶切消化、接頭連接、2 次SSH雜交和 2 次 PCR 完成整個(gè)抑制SSH雜交過(guò)程。利用看家基因CBC18的特異引物:上游引物TGATACAGATGGAACTAAC，下游引物GGAACTCTATACGCTAAC。對(duì)SSH和未SSH的第 2 次 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增,以檢測(cè) SSH 成功與否。

用分級(jí)柱對(duì)SSH PCR 產(chǎn)物進(jìn)行純化回收,與pMD-18T Easy載體(TaKaRa 公司)連接。利用電轉(zhuǎn)化法將連接好的載體導(dǎo)入大腸桿菌菌株 DH5a(Tian公司)中,取一些原始文庫(kù)稀釋不同倍數(shù)混勻后移至培養(yǎng)皿中涂板,將培養(yǎng)皿放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)后檢查菌落形成與否。經(jīng)藍(lán)白斑篩選,挑取所有白色克隆至含有LB 液體培養(yǎng)基中,37 ℃振蕩過(guò)夜培養(yǎng)。 第2天每管取1 μL采用質(zhì)粒引物進(jìn)行陽(yáng)性克隆PCR檢測(cè)。將陽(yáng)性克隆送伯尚生物公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3.5序列分析和功能分類。 將測(cè)序的序列進(jìn)行去載體、聚類拼接得到unigenes序列,將序列在NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì),得到序列相關(guān)的相似核酸序列和相似蛋白質(zhì)。在BLAST比對(duì)結(jié)果中,將對(duì)齊分(Score)>80,同一性(Ident)>35%的序列進(jìn)行相關(guān)作用注釋,將對(duì)齊分值(Score)<80的序列利用BLASTN進(jìn)行同源性比對(duì)。將序列用BLAST2GO進(jìn)行功能分類。

1.3.6熒光定量 PCR 分析候選基因的表達(dá)。 將供試幼苗分為4組放入培養(yǎng)箱，溫度分別設(shè)為25、6、-2、-8 ℃。脅迫處理24 h后取各處理凹葉厚樸頂芽,提取總RNA,取各樣品RNA 1 μg,按TaKaRa公司PrimerScriptTM RT reagent Kit說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄?；虻奶禺愐镌O(shè)計(jì)按照熒光定量PCR引物原則使用Primer 5.0軟件對(duì)選定的11個(gè)低溫相關(guān)的候選基因設(shè)計(jì)特異引物,內(nèi)參基因選用UBC18基因。

反應(yīng)在ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行,循環(huán)數(shù)為40。每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù),相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算：△△Ct= (CT,gene-CT,UBC18)低溫處理-(CT,gene - CT,UBC18)常溫處理。

2結(jié)果與分析

2.1半致死溫度在4個(gè)溫度梯度下將凹葉厚樸幼苗脅迫24 h后，電導(dǎo)率檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。從圖1可以看出，在-8～-10 ℃電導(dǎo)率直線上升,在-10 ℃時(shí)電導(dǎo)率為65.35%，膜透性幾乎完全破壞。運(yùn)用SPSS軟件對(duì)內(nèi)含物滲透值進(jìn)行分析,得回歸方程：y=0.752 6/(1+18.925e-0.372x) ,半致死溫度為-7.93，與預(yù)測(cè)值相近,可以代表凹葉厚樸頂芽的半致死溫度。

圖1　電導(dǎo)率隨溫度的變化規(guī)律Fig.1　The variation law of conductivity with temperature

2.2cDNA的合成結(jié)果

2.2.1RNA提取結(jié)果。提取的4組凹葉厚樸RNA的OD260/OD280均高于2.0且小于2.2,認(rèn)為RNA中蛋白質(zhì)或其他有機(jī)物的污染在許可范圍內(nèi)。OD260/OD230均大于1.8,表明RNA溶液中的鹽類等無(wú)機(jī)物污染較小,且充分去除了漂洗殘留的乙醇。由圖2可知,4組提取的凹葉厚樸RNA經(jīng)電泳檢測(cè)28S、18S條帶明亮,且28S的亮度接近于18S的2倍,說(shuō)明RNA的完整度較高,比例適當(dāng)。試驗(yàn)中選取tester1與driver1進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

圖2　RNA電泳檢測(cè)圖譜Fig.2　RNA electrophoresis detection

2.2.2雙鏈cDNA的合成。從圖3可以看出,隨著擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的增加,dscDNA的300～3 000 bp的亮度呈由淺到深到淺的變化,且dscDNA的片段大小也呈向上集中的趨勢(shì)。選取分布較集中、亮度最高、含量最多的19循環(huán)為最優(yōu)循環(huán)數(shù),其產(chǎn)物集中分布在0.3～3.0 kb,可以滿足下一步試驗(yàn)的需要,將tester和driver剩余的70 μL反應(yīng)液通過(guò)PCR進(jìn)一步擴(kuò)增到19循環(huán),再進(jìn)行下一步的反應(yīng)。

圖3　dscDNA的電泳結(jié)果Fig.3　dscDNA electrophoresis results

2.3SSH文庫(kù)的構(gòu)建結(jié)果

2.3.1雙鏈cDNA(dscDNA)的酶切。由圖4可知，合成的dscDNA分布在0.2～3.0 kb,酶切后的dscDNA分布在0.1～2.0 kb,條帶下移說(shuō)明dscDNA的RsaI酶切比較完全。

注：M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；driverB與testerB為RsaI酶切產(chǎn)物；driverA與testerA為合成的試驗(yàn)組雙鏈cDNA。Note: M. DNA molecular weight marker; driverB and testerB. RsaI enzyme products; driverA and testerA. Synthetic test group double-stranded cDNA. 圖4　driver與tester組雙鏈cDNA合成與酶切結(jié)果Fig.4　driver and tester group double-stranded cDNA synthesis and enzyme digestion

2.3.2接頭連接效率分析。由圖5可知，看家基因UBC18 的3′端引物與primer1的5′端引物共同擴(kuò)增的片段大于看家基因UBC18 3′端、5′端引物擴(kuò)增的片段,與預(yù)期結(jié)果一致。

注：M.DNA分子量標(biāo)準(zhǔn);1、2.以Tested-1與Adaptor1連接為模板PCR的產(chǎn)物;3、4.以Tested-2與Adaptor2R連接為模板PCR的產(chǎn)物;1、3.以PCRprimer1與看家基因3′引物PCR的產(chǎn)物;2、4.以看家基因3′與5′引物PCR的產(chǎn)物。Note: M. DNA molecular weight marker; 1, 2. PCR products with Tested-1 Adaptor1 connection as template; 3, 4. PCR products with Tested-2 Adaptor2R connection as template; 1, 3. With PCRprimer1 and housekeeping gene 3′primer PCR products; 2, 4. With housekeeping gene 3′ and 5′primer PCR product.圖5　接頭連接效率檢測(cè)Fig.5　Joint connection detection efficiency

2.3.3消減產(chǎn)物2次PCR結(jié)果。第2次PCR擴(kuò)增結(jié)束后,取陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增產(chǎn)物、未消減抑制性擴(kuò)增產(chǎn)物、消減抑制性擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè),結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可知，消減產(chǎn)物2次抑制性PCR擴(kuò)增出的條帶較亮且完整,由此可知，接頭連接效率較高。因?yàn)闆](méi)有兩端連有接頭的DNA是無(wú)法在特定引物下進(jìn)行擴(kuò)增。第2次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物主要分布在0.3～1.0 kb,且分布均勻,未見(jiàn)明顯的主帶,與預(yù)期結(jié)果符合。

注：M.DNA分了量標(biāo)準(zhǔn);1.陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增產(chǎn)物，2.未消減抑制性擴(kuò)增產(chǎn)物，3.消減抑制性擴(kuò)增產(chǎn)物。Note: M. DNA molecular weight marker; 1. Positive contrast amplification products, 2. Not cutting inhibitory amplification products, 3. Cutting inhibitory amplification products. 圖6　消減產(chǎn)物2次PCR結(jié)果Fig.6　Reduction product twice PCR results

2.3.4消減效率檢測(cè)。以消減雜交的產(chǎn)物為模板PCR檢測(cè)UBC18看家基因,28個(gè)循環(huán)后才有條帶出現(xiàn),而以未經(jīng)消減雜交的產(chǎn)物為模板擴(kuò)增,在第18個(gè)循環(huán)處即有條帶出現(xiàn)。UBC18看家基因18S在消減cDNA和未消減cDNA中含量差異顯著,表明tester和driver中共有的cDNA已被有效消除,同時(shí)也表明低溫組和常溫組的特異性差異表達(dá)基因也相應(yīng)得到富集(圖7)。

注：1～4分別為未經(jīng)消減雜交產(chǎn)物的18、23、28、33循環(huán)，5～8分別為消減雜交產(chǎn)物的18、23、28、33循環(huán)。Note: 1-4 are 18, 23, 33 and 28 cycles of not cutting hybrid products, and 5-8 are 18, 23, 28 and 33 cycles of cutting hybrid products. 圖7　PCR檢測(cè)看家基因cDNA的消減效率Fig.7　PCR detection of housekeeping gene cDNA abatement efficiency

圖8　差減原始文庫(kù)菌落Fig.8　Differential reduced original library colony plate

2.3.5文庫(kù)質(zhì)量評(píng)價(jià)。通過(guò)IPTG誘導(dǎo)，經(jīng)X-Gal染色測(cè)定原始文庫(kù)的重組率,統(tǒng)計(jì)藍(lán)白斑比例，結(jié)果表明文庫(kù)重組率為99.3%(圖8)，隨機(jī)挑選的23個(gè)陽(yáng)性克隆插入片段在0.2～1.0 kb,平均值約為0.65 kb,菌液PCR檢測(cè)得到的陽(yáng)性克隆重組率為100%(圖9)。

圖9　差減cDNA文庫(kù)部分隨機(jī)插入片段電泳圖譜Fig.9　Subtraction cDNA library partial random insertion fragment electrophoresis

2.4測(cè)序結(jié)果

2.4.1片段長(zhǎng)度。消減文庫(kù)共測(cè)序900個(gè)陽(yáng)性克隆,通過(guò) SEQMAN 軟件分析,去除低質(zhì)量及污染序列,共得到高質(zhì)量序列837個(gè)。

經(jīng)聚類拼接共得到126個(gè)conting。經(jīng)SEQMAN 軟件組裝,最后得到 97個(gè) unigenes(包括病毒或污染的 unigenes)。其中，unigenes最長(zhǎng)的序列為 5 849 bp,最短的為 523 bp,序列長(zhǎng)度集中在 1 000～3 000 bp,79%的序列長(zhǎng)度大于 1 000 bp,43%的序列長(zhǎng)度大于2 000 bp,22%的序列長(zhǎng)度大于3 000 bp。由此可知，消減文庫(kù)中的序列分布全面。

2.4.2NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)注釋。從GenBank中對(duì)編碼區(qū)進(jìn)行注釋,通過(guò)與NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)注釋,得到與unigenes序列編碼同源性相近的蛋白信息。將97個(gè)拼接完成的unigenes與NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)注釋,有76條unigenes在數(shù)據(jù)庫(kù)中得到注釋。其中，來(lái)自于蓮的基因有29條、葡萄12條、可可7、海棗5、油棕4,表明凹葉厚樸抗寒基因具有與上述植物較高的同源性。

2.4.3GO功能分類。將具有已知或推定功能蛋白的98條unigeness在BLAST2GO進(jìn)行功能分類,成功對(duì)58條unigeness進(jìn)行了分類,共獲得114個(gè)GO terms。其中，生物學(xué)過(guò)程最多(67)，占46.52%，其次是分子功能(42)和細(xì)胞組件(35)，分別占29.17%和24.31%。

分類結(jié)果顯示,凹葉厚樸抗寒抵御機(jī)制主要靠生物學(xué)過(guò)程的調(diào)控方式進(jìn)行,而細(xì)胞組件的調(diào)控相對(duì)較少。測(cè)序的ESTs涵蓋的功能較齊全,且能反映特定時(shí)期細(xì)胞表達(dá)信息(低溫脅迫),表明文庫(kù)構(gòu)建成功,可用于后續(xù)抗寒相關(guān)基因的篩選。

2.4.4可能在逆境環(huán)境中有響應(yīng)的基因。在對(duì)97條unigenes信息處理后，最終推定出有可能參與抗寒應(yīng)激防御的11個(gè)基因(表1)。

表1　推定出的11條抗寒基因

2.5熒光定量PCR結(jié)果由圖10可知，除FLS基因外,其他基因均比常溫表達(dá)量較高。其中，CHS、APX、TRX、DREB等基因均隨溫度的降低表達(dá)量不斷增加,LHCB、WRKY、HSP、PP2C等基因在-8 ℃時(shí)由于溫度過(guò)低代謝受到抑制，從而使表達(dá)量有所下降。ERF、GAPDH基因表達(dá)量隨溫度的降低而升高，這2個(gè)基因與溫度的相關(guān)性較強(qiáng)。但在溫度過(guò)低時(shí)植物代謝受到阻礙,基因的表達(dá)受到抑制,這是由于低溫破壞了基因正常的代謝途徑。因而判定CHS、APX、TRX、ERF、DREB、LHCB、WRKY、HSP、PP2C、GAPDH10個(gè)基因在凹葉厚樸受到低溫侵害時(shí)出現(xiàn)差異表達(dá)，由此推斷這10個(gè)基因在低溫時(shí)可能表現(xiàn)出防御機(jī)制。

圖10　熒光定量PCR測(cè)定基因表達(dá)量Fig.10　Gene expression measured by fluorescence quantitative PCR

3討論

3.1文庫(kù)構(gòu)建注意事項(xiàng) cDNA文庫(kù)是生物在某一時(shí)期基因所表達(dá)的文庫(kù)，即DNA所轉(zhuǎn)錄出的RNA序列，因此，文庫(kù)中大部分為相同的高峰度序列，對(duì)于尋找低峰度的功能基因較為困難。差減cDNA文庫(kù)可以有效較少文庫(kù)中的高峰度基因，保留低峰度差異基因，有利于篩選出目的基因，是較為理想的基因篩選方法。但差減文庫(kù)相比全長(zhǎng)文庫(kù)試驗(yàn)步驟多而復(fù)雜，因此需要注意以下幾點(diǎn)：①植物的低溫脅迫臨界值受季節(jié)氣候的影響較大，在測(cè)定脅迫臨界值后應(yīng)盡快開(kāi)始差減文庫(kù)的構(gòu)建過(guò)程。此外，植物抗寒基因的表達(dá)量也會(huì)隨季節(jié)氣候的變化而變化，因此，為了能準(zhǔn)確反映凹葉厚樸11月份抗寒基因的表達(dá)情況，在進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證基因表達(dá)量時(shí)宜選擇與11月份溫度相近的冬季進(jìn)行為宜。②植物取材。為了減少原始tester組和driver組在遺傳背景和基因表達(dá)上的差異，在植株取材上應(yīng)選擇相同年份、同一種源且生長(zhǎng)環(huán)境相同的植株。挑取形態(tài)外觀相近的植株，取同一部位作為試驗(yàn)材料。取材部位以嫩葉或嫩芽為宜。凹葉厚樸為落葉植物，受到低溫侵害時(shí)植物葉片自然掉落，葉片中的抗寒基因較少。頂芽在低溫下可存活，證明頂芽具有較多的抗寒基因表達(dá)，因此，頂芽為凹葉厚樸構(gòu)建差減文庫(kù)較好的取材。③RNA的提取和cDNA的合成。在操作過(guò)程中RNA與DNA的降解都會(huì)造成差減文庫(kù)假陽(yáng)性的產(chǎn)生，加大數(shù)據(jù)分析難度。因此，在試驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)盡量保持樣品的低溫以避免外界污染，可以選擇在冰上對(duì)試劑進(jìn)行添加，且保持周圍環(huán)境潔凈，在超凈工作臺(tái)上操作可以減少外界環(huán)境的干擾，所有與樣品有直接或間接接觸的儀器和試劑都應(yīng)消毒殺菌。

3.22種cDNA合成方法的比較差減文庫(kù)所用的cDNA是用Oligo d法合成的cDNA,因?yàn)镺ligo d(T)15和基因特異性引物(GSP)比隨機(jī)引物的特異性低。隨機(jī)引物在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中會(huì)有多個(gè)退火位點(diǎn),產(chǎn)物短且只有部分長(zhǎng)度的cDNA。但Oligo d法的起始模板是mRNA,加大了試驗(yàn)難度。

該試驗(yàn)最終采用clontech 公司的 in-fusion SMARTer cDNA Construction Kit 合成差減文庫(kù)構(gòu)建所需要的cDNA,這是由于：①在總RNA中僅含有2%左右的poly(A)RNA，即mRNA,且在mRNA提取過(guò)程中會(huì)有大量mRNA的損耗。因此，需要100 μg左右總RNA才可以滿足后續(xù)試驗(yàn)的需求,而10株左右的凹葉厚樸幼苗頂芽可提取出100 μg總RNA。②用Oligo d法合成的cDNA未進(jìn)行擴(kuò)增,產(chǎn)物總量較少,在進(jìn)行純化后又會(huì)有部分損失。下一步進(jìn)行酶切后需要進(jìn)行純化,還會(huì)損失一部分。最終因量太少在進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后無(wú)法顯示出明顯條帶,不利于后續(xù)試驗(yàn)操作。③使用磁珠提取mRNA步驟繁瑣,且成功率較低，而過(guò)柱法提取mRNA較為簡(jiǎn)單高效,但價(jià)格相對(duì)較高。

3.3抗寒基因評(píng)價(jià)通過(guò)對(duì)所得到的97條基因比對(duì)，結(jié)果表明，凹葉厚樸的低溫脅迫信號(hào)途徑為不依賴ABA的信號(hào)途徑，研究表明有CBF/DRE參與的信號(hào)途徑不依賴ABA。該試驗(yàn)通過(guò)對(duì)差減文庫(kù)序列片段的深入分析得到10個(gè)有關(guān)脅迫響應(yīng)的基因,并通過(guò)熒光定量PCR驗(yàn)證了基因的差異表達(dá)，包括：①WRKY基因?qū)儆阡\指家族蛋白家族[5]，在多種植物的抗性基因中均有發(fā)現(xiàn)，是抵御逆境的重要基因，但尚未有關(guān)于WRKY基因分子機(jī)制的相關(guān)資料[6]。②DREB/CBF轉(zhuǎn)錄因子[7]通過(guò)調(diào)控凹葉厚樸的磷酸肌醇代謝、膜運(yùn)輸、細(xì)胞新陳代謝、脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等來(lái)抵御低溫[8]傷害。③ERF基因是AP2/ERF[9]蛋白基因家族的其中一員[10]，AP2/ERF蛋白基因與植物抗逆有關(guān)，其通過(guò)蠟質(zhì)合成、激素合成以及ROS清除來(lái)抵御低溫[11]。④HSP基因轉(zhuǎn)錄[12]得到的熱激蛋白在植物受到低溫侵害時(shí)可以減少溶質(zhì)滲漏保護(hù)植物細(xì)胞膜的完整性，減少細(xì)胞的脫水進(jìn)而保護(hù)植物在低溫下不受侵害。⑤LHCB1基因轉(zhuǎn)錄得到的捕光葉綠素結(jié)合蛋白與光能的吸收和多余能量的消耗有關(guān)[13]，可以提高植物在低溫下細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，且減少因低溫產(chǎn)生的過(guò)氧化物的積累。⑥APX可以在植物受到逆境傷害時(shí)減少過(guò)氧化物[14]和羥基自由基的積累，保護(hù)植物葉綠體和其他細(xì)胞組分，是植物抗逆過(guò)程中重要的酶[15]。⑦Trx硫氧[16]還蛋白可以調(diào)控酶活性，并使可逆的二硫鍵及硫醇變化起氧化還原載體的功能，是維持細(xì)胞膜內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要因子。⑨GAPDH基因[17]是與細(xì)胞膜抗?jié)B透脅迫及穩(wěn)定性有關(guān)的基因。

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作者簡(jiǎn)介陸寧(1988- ),男,福建漳州人,碩士研究生，研究方向：分子生物學(xué)與基因工程。*通訊作者,教授,博士，博士生導(dǎo)師,從事藥用植物分子生物學(xué)方面的研究。

收稿日期2016-04-26

中圖分類號(hào)Q 781

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2016)14-141-05

Construction ofMagnoliaofficinalisLow Temperature Stress SSH Library and Differential Gene Expression Analysis

LU Ning1, CHEN Jian-cheng1, ZHENG Yu-shan2*

(1. College of Forestry, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002; 2 College of Art and Landscape, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002)

Abstract[Objective] The aim was to obtain cold resistance relevant genes through construction of Magnolia officinalis subtractive library and sequence analysis. [Method] PCR detection was conducted on randomly selected monoclonal colony, after 837 positive clone sequencing, 97 unigenes were obtained, BLAST comparison was conducted on NCBI, then BLAST2GO functional classification was carried out. [Result] Fluorescence quantitative PCR was conducted on 11 relevant genes. CHS, APX, TRX, ERF, DREB, LHCB, WRKY, HSP, PP2C, GAPDH exhibited the defense mechanism when Magnolia officinalis was damaged by low temperature. [Conclusion] The study can provide theoretical basis for cold resistance genetic breeding of plants with similar affinities to Magnolia officinalis.

Key wordsMagnolia officinalis; Low temperature stress; SSH library; Gene expression