黃依藍(lán)++岳倩倩++倪愛新

摘要：利用稀釋平板法和基于ITS rDNA基因序列的分析方法對(duì)寬闊水自然保護(hù)區(qū)3種類型的土壤進(jìn)行真菌的分離鑒定，共分離得到353株真菌，歸為34個(gè)不同的屬。對(duì)土壤真菌多樣性進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果表明：紫色土真菌優(yōu)勢(shì)屬為酵母菌屬（Saccharomyces），黃棕壤真菌優(yōu)勢(shì)屬為酵母菌屬（Saccharomyces）和被孢霉屬（Mortierella），黃壤真菌優(yōu)勢(shì)屬為青霉屬（Penicillium）和木霉屬（Trichoderma）。土壤真菌Margalef豐富度指數(shù)（R）最高的是黃壤，最低的是黃棕壤；Shannon-Wiener多樣性指數(shù)（H′）最高的是紫色土；Pielou均勻度指數(shù)（J）黃棕壤最高；Jaccard相似性指數(shù)（Cj）為0444 ～0.536，表明3種類型土壤的真菌多樣性均具有一定差異。

關(guān)鍵詞：寬闊水；土壤真菌；多樣性

中圖分類號(hào)： S154.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）05-0458-03

收稿日期：2015-11-22

基金項(xiàng)目：國(guó)家科技基礎(chǔ)性工作專項(xiàng)（編號(hào)：2014FY120100）。

作者簡(jiǎn)介：黃依藍(lán)（1992—），女，碩士研究生，主要從事土壤真菌資源研究。E-mail：ylhuang77@163.com。

通信作者：周禮紅，博士，副教授，主要從事微生物應(yīng)用方向的研究。E-mail：lhzhou33@126.com。寬闊水自然保護(hù)區(qū)位于貴州省遵義市綏陽縣境內(nèi)，總面積26 231 km2，海拔在650～1 762 m之間，地形切割強(qiáng)烈，除中南部以中低山谷地為主的侵蝕地貌外，保護(hù)區(qū)東、西部及北部多為典型的喀斯特地貌。寬闊水保護(hù)區(qū)的森林植被主體為亮葉水青岡林與常綠闊葉樹種構(gòu)成落葉常綠闊葉混交林，林下土壤發(fā)育良好，具有較豐富的腐殖質(zhì)積累[1]。由于特殊的氣候及地質(zhì)土壤條件，寬闊水自然保護(hù)區(qū)為森林野生動(dòng)植物及微生物的生長(zhǎng)繁育提供了有利的棲息場(chǎng)所，形成了復(fù)雜多樣的生境類型。與動(dòng)植物的分布類似，微生物的分布是確定性（環(huán)境）和隨機(jī)性（擴(kuò)散）的共同結(jié)果。由于微生物個(gè)體較小，可以通過孢子抵御長(zhǎng)距離傳播中的不良環(huán)境，在適宜條件下以多種繁殖方式存活下來，這種巨大的分散潛力和對(duì)小環(huán)境的敏感性，是微生物群落結(jié)構(gòu)與大型生物群落結(jié)構(gòu)之間的區(qū)別。土壤真菌作為微生物群落結(jié)構(gòu)中的一個(gè)重要組成部分，其多樣性程度與土壤肥力和生態(tài)狀況密切相關(guān)，同時(shí)生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)及環(huán)境變化，也直接影響到真菌物種多樣性和空間分布情況[2-4]。

本研究采用傳統(tǒng)分離方法對(duì)寬闊水自然保護(hù)區(qū)3種不同土壤的真菌多樣性進(jìn)行調(diào)查，結(jié)合微生物多樣性的分析方法，對(duì)該地區(qū)真菌菌群的基本特征、空間分布狀況和物種多樣性進(jìn)行調(diào)查，為進(jìn)一步揭示微生物和環(huán)境之間的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料和試劑

土樣采自寬闊水自然保護(hù)區(qū)。馬丁氏培養(yǎng)基、馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基、沙氏培養(yǎng)基均按標(biāo)準(zhǔn)方法配制，所用試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。真菌基因組DNA提取試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1土樣采集選取寬闊水自然保護(hù)區(qū)內(nèi)的紅沙地、花生地、太陽山、煤場(chǎng)灣、天鵝湖、珙桐溝和一線天7個(gè)區(qū)域，GPS記錄采集地的地理位置，采集地環(huán)境描述（表1）。采用對(duì)角線型路線多點(diǎn)采集腐殖質(zhì)層土壤樣品于滅菌袋中，進(jìn)行編號(hào)，4 ℃保存。

1.2.2土壤真菌的分離及純化分離培養(yǎng)基為馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基、改良沙氏孟加拉紅培養(yǎng)基和馬鈴薯孟加拉紅培養(yǎng)基，均在使用前加入鏈霉素，使培養(yǎng)基中含鏈霉素30 μg/mL。

用稀釋涂布法分離土壤真菌。稱取10 g土壤于90 mL含少量玻璃珠的無菌水中，充分振蕩混勻，按10倍稀釋法稀釋到1×10-3，取400 μL菌懸液于培養(yǎng)基上，均勻涂布，28 ℃培養(yǎng)5 d，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.2.3ITS序列分子鑒定

1.2.3.1真菌基因組DNA的提取基因組DNA提取按照試劑盒操作說明書進(jìn)行。

1.2.3.2ITS序列的PCR擴(kuò)增（1）引物序列如下：ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG；ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC。（2）PCR反應(yīng)體系：擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μL（表2）。配制完成后，充分混勻，稍加離心使體系在PCR管底部，再置于PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。（3）PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，55 ℃ 引物退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

1.2.3.3PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)反應(yīng)結(jié)束后，分別取3 μL PCR產(chǎn)物和DNA marker點(diǎn)于1% 瓊脂糖凝膠的點(diǎn)樣孔中進(jìn)行電泳，結(jié)束后使用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察，若條帶單一且明亮清晰則表明擴(kuò)增成功，樣品可用于進(jìn)一步測(cè)序。

1.2.4序列測(cè)定與分析方法

1.2.4.1測(cè)序PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后用全自動(dòng)DNA測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序，獲得ITS序列。

1.2.4.2序列及真菌種群分布分析將已測(cè)定的序列在表1土壤采集地環(huán)境描述

采集地緯度（N）經(jīng)度（E）海拔（m）土壤類型土壤pH值生境類型紅沙地28°13′10″107°9′17″1 486 ～ 1 510紫色土5.5灌木叢花生地28°13′26″107°9′43″1 503 ～ 1 517黃棕壤6.0竹林地太陽山28°14′9″107°9′37″1 592 ～ 1 722黃棕壤6.0方竹煤場(chǎng)灣28°13′56″107°9′42″1 555 ～ 1 579黃壤6.5灌木叢天鵝湖28°13′45″107°9′43″1 515 ～1 524黃壤7.0灌木叢珙桐溝28°13′59″107°10′1″1 582 ～ 1 629黃壤6.5灌木叢一線天28°14′11″107°11′12″1 411 ～ 1 455黃壤6.5灌木叢

表2PCR反應(yīng)體系組分

反應(yīng)組分體積（μL）引物ITS1 1引物ITS4 1模板 22×PCR Master Mix12dd H2O 9

GenBank上使用Blast（basic local alignment search tool，Blast 2.2.31）進(jìn)行序列比對(duì)分析、鑒定。

1.2.5真菌多樣性分析方法采用物種個(gè)體數(shù)量（N）、物種數(shù)（S）、種群優(yōu)勢(shì)度（d）、Margalef豐富度指數(shù)（R）、Shannon-Wiener的多樣性指數(shù)（H′）、Pielou均勻度指數(shù)（J）和Jaccard相似性指數(shù)（Cj）對(duì)寬闊水保護(hù)區(qū)不同土壤真菌群落多樣性進(jìn)行分析[5-7]。

種群優(yōu)勢(shì)度：di=Ni/N；

Margalef豐富度指數(shù)：R =（S-1）/lnN。

Shannon-Wiener多樣性指數(shù)：H′ =-∑PilnPi（i=1，2，3，…，n）；

Pielou均勻度指數(shù)：J =H′/lnS。

式中，Pi=di，表示第i種個(gè)體數(shù)占總個(gè)體數(shù)的比例。

Jaccard相似性指數(shù)：Cj = c/（a+b+c）。

式中，a和b分別為2種生境地中真菌的種數(shù)或?qū)贁?shù)，c為2種生境地中共有的真菌種數(shù)或?qū)贁?shù)。Jaccard相似性系數(shù)（Cj）用于比較2個(gè)生境中真菌種類組成的相似程度，根據(jù)其原理：當(dāng)Cj為0.00～<0.25時(shí)，為極不相似；當(dāng)Cj為0.25～<0.50時(shí)，為中等不相似；當(dāng)Cj為0.50～<0.75時(shí)，為中等相似；當(dāng)Cj為0.75 ～1.00時(shí)，為極相似。

2結(jié)果與分析

2.1總體土壤真菌的群落組成

2.2不同土壤真菌群落組成及優(yōu)勢(shì)度分析

2.3不同土壤真菌群落多樣性差異

生境條件越適宜，豐富度指數(shù)和多樣性指數(shù)越高，多樣性指數(shù)也可反映出群落穩(wěn)定性大小。均勻度反映的是群落中不同物種分布的均勻程度[9-10]。由表4可見，真菌單菌落數(shù)量S為黃壤>紫色土>黃棕壤，物種數(shù)（屬數(shù)）N為紫色土>黃壤>黃棕壤，Margalef豐富度指數(shù)R黃壤>紫色土>黃棕壤，Shannon-Wiener多樣性指數(shù)H′紫色土>黃壤>黃棕壤，Pielou均勻度指數(shù)J黃棕壤>黃壤>紫色土。紫色土和黃棕壤的Jaccard相似性指數(shù)Cj為0.536，中等相似；紫色土和黃壤Cj為0.500，中等相似，黃棕壤和黃壤Cj為0.444，中等不相似。

3討論

本研究采用種群優(yōu)勢(shì)度、豐富度指數(shù)、多樣性指數(shù)、均勻度和相似度指數(shù)，對(duì)寬闊水自然保護(hù)區(qū)3種不同土壤的真菌群落多樣性進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，從群落組成來看，各類土壤的優(yōu)勢(shì)種屬、常見種屬和稀有種屬均有較大差異，其中有一些屬為其相應(yīng)土壤所特有。寬闊水自然保護(hù)區(qū)土壤中大量存土壤類型S（N）RH′J紫色土26（127）5.160 82.775 60.851 9黃棕壤17（90）3.555 72.468 20.871 2黃壤22（136）4.274 72.676 10.865 8

在的酵母菌屬（Saccharomyces）、木霉屬（Trichoderma）、被孢霉屬（Mortierella）、擬青霉屬（Paecilomyces）、綠僵菌屬（Metarhizium）、黏帚霉屬（Gliocladium）等，具有較高的利用價(jià)值和應(yīng)用前景，可作為農(nóng)林病害防治和可持續(xù)開發(fā)的資源[11-15]。此外，不同土壤真菌群落多樣性存在一定差異，Margalef豐富度指數(shù)最高的是黃壤真菌，最低的是黃棕壤；3種土壤真菌群落的Shannon-Wiener多樣性指數(shù)在2.46～278之間，紫色土最高，黃棕壤最低；黃棕壤的Pielou均勻度指數(shù)最高，紫色土最低；Jaccard相似性指數(shù)為0.444 ～0536，表明3種土壤相似性介于中等相似和中等不相似之間。造成不同土壤真菌群落多樣性的差異原因比較復(fù)雜，除了土壤質(zhì)地和土壤肥力外，還與其對(duì)應(yīng)生境地的光照、降雨量、植被類型等有關(guān)[16-17]。同時(shí)由于其中一些種屬的菌株具有生防功能，且不同微生物群落之間產(chǎn)生的相互作用使網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，因此在一定程度上也影響了環(huán)境中的真菌多樣性[18]。

由于傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的局限性，大量不可培養(yǎng)微生物無法通過分離獲得，菌株數(shù)量十分有限。因此還需嘗試多種不同的分離方法，結(jié)合以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的相關(guān)技術(shù)進(jìn)行多樣性分析，才能更加全面地了解寬闊水保護(hù)區(qū)的土壤真菌多樣性分布特征以及與環(huán)境之間的相互關(guān)系。

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