柳朝陽，張鵬霞，榮光影，張　濤

(佳木斯大學，黑龍江 佳木斯 154007)

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川芎嗪對 AD模型小鼠腦內(nèi)APP和NEP表達的影響①

柳朝陽，張鵬霞，榮光影，張濤

(佳木斯大學，黑龍江 佳木斯 154007)

摘要：目的：探討川芎嗪(TMP)對AD模型小鼠學習記憶及腦內(nèi)β淀粉樣前體蛋白(APP)和腦啡肽酶(NEP)表達的影響。方法：腹腔注射D-半乳糖和灌胃三氯化鋁制備AD 模型小鼠。Morris水迷宮實驗檢測小鼠學習記憶能力；免疫組化法檢測腦內(nèi)APP和NEP蛋白的表達。結果：低、高劑量TMP組均能改善 AD小鼠的學習記憶能力(P<0.01),下調(diào)小鼠海馬APP蛋白表達(P<0.01),上調(diào)NEP蛋白的表達(P<0.01)。低、高劑量TMP組相比無明顯差異。結論：TMP可改善AD小鼠學習記憶能力, 可能與降低APP及增加NEP蛋白表達有關。

關鍵詞：川芎嗪；AD模型小鼠；β-淀粉樣前體蛋白；腦啡肽酶

阿爾茨海默病是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)進行性退行疾病,即老年性癡呆[1，2],主要病理學特征是在大腦皮層和海馬區(qū)域形成大量的老年斑(SP)。SP主要成分是β淀粉樣蛋白(Aβ )。Aβ的神經(jīng)毒性在AD發(fā)生發(fā)展中起了核心作用[3]。Aβ由β淀粉樣前體蛋白(APP)水解而成。研究表明, APP和 Aβ 的過度生成是AD重要發(fā)病機制[4]腦啡肽酶(Neprilysin,NEP)是腦內(nèi)最重要的天然Aβ降解酶,在Aβ的水解過程中發(fā)揮關鍵酶的作用[5]。因此,通過減少APP的生成和上調(diào)NEP活性來降低Aβ水平可以預防和治療AD。本實驗觀察TMP對AD小鼠的學習記憶能力及腦內(nèi)APP及NEP蛋白表達的影響，探討TMP對AD的治療作用。

1材料和方法

1.1實驗動物

實驗采用清潔級昆明種系小鼠，6～8周齡，體重 25～30g，佳木斯大學動物實驗中心提供。

1.2主要試劑

磷酸川芎嗪片；D-半乳糖；石杉堿甲；一抗兔抗小鼠APP、兔抗小鼠 NEP抗體購；二抗PV-6001； SABC免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒(以上試劑均購于武漢博士德生物工程有限公司)。

1.3方法

1.3.1模型的建立[6]和給藥方法

將小鼠50只隨機分為 5組(每組10只)：正常對照組、AD模型組、石杉堿甲組(0.02mg kg-1·d-1, 雙蒸水配制)、低劑量TMP組(100mg kg-1·d-1)(L-TMP組)、高劑量TMP組(200mg kg-1·d-1)(H-TMP組) 。

AD模型組和給藥組腹腔注射D-半乳糖120mg kg-1·d-1和灌胃三氯化鋁10mg kg-1·d-1，連續(xù)90d，制備AD小鼠模型，正常對照組灌胃和腹腔注射生理鹽水，低、高劑量TMP組從第51天開始灌胃藥物, 模型組灌胃生理鹽水, 連續(xù)40d。

1.3.2隱蔽平臺試驗

從第86天起, 進行 Morris 水迷宮試驗[7],連續(xù)5d。隱蔽平臺固定水迷宮象限中央，將小鼠在任一個象限內(nèi)的隨機位置頭朝外放入水中，小鼠爬到平臺上到達100秒時，實驗停止。潛伏期記為100秒，每天訓練 4 次，間隔 20min。用影像記錄小鼠尋找并爬上平臺所需時間即逃避潛伏期。數(shù)據(jù)由Morris水迷宮圖像處理系統(tǒng)處理。

1.3.3空間探索實驗

撤去平臺, 隨機選1個位置放小鼠入水中,小鼠就會找尋記憶中的平臺, 記錄小鼠在100s內(nèi)的運動軌跡、原平臺象限停留的時間和穿越原平臺的次數(shù)。

1.3.4免疫組化法檢測小鼠海馬APP和NEP蛋白的表達

取小鼠海馬組織甲醛固定,乙醇脫水、石蠟包埋,制片。切片脫蠟,高壓修復抗原 ,滴加一抗,37℃2h,滴加二抗,DAB顯色,蘇木素復染,脫水,封片。DAB顯色后Aβ、APP 陽性細胞為棕黃色。在 APP和NEP染色的海馬區(qū)分別找 3 個視野(×400), 應用圖像分析系統(tǒng)測量每個視野內(nèi) APP、NEP陽性細胞數(shù)。

1.4統(tǒng)計學方法

2結果

2.1隱蔽平臺試驗結果

與正常對照組相比, AD模型組的小鼠從第 1 天開始逃避潛伏期即縮短(P<0.05或P<0.01),表明長期注射D-半乳糖可引起小鼠的學習記憶顯著下降。

與AD模型組相比，從第3天起，TMP各組和石杉堿甲組的逃避潛伏期明顯縮短(P<0.05 或P<0.01),說明藥物可以提高AD小鼠的學習記憶能力。TMP各組與石杉堿甲組相比無顯著差異(P>0.05)，TMP各組之間相比無顯著差異(P>0.05)。見表1。

表1　各組小鼠隱蔽平臺實驗潛伏期，單位:s)

注：與對照組相比a)P<0.05，b)P<0.01；與AD模型組相比c)P<0.05,d)P<0.01；與石杉堿甲組相比e)P<0.05。

2.2空間隱蔽平臺試驗結果

正常對照組、石杉堿甲組和TMP各組大部分小鼠在原平臺象限內(nèi)運動, 其次在與原平臺象限相鄰的位置象限較多地運動,模型組小鼠一般都隨機圍繞池壁在各象限中運動。

與AD模型組相比, 正常對照組、石杉堿甲組和TMP各組在原平臺象限停留時間和穿越原平臺次數(shù)均明顯增加(P<0.05或P<0.01)，提示TMP能增強AD模型小鼠的記憶能力。TMP各組與石杉堿甲組相比無顯著差異(P>0.05)，TMP各組之間相比無顯著差異(P>0.05)。見表2。

表2　各組小鼠空間探索試驗

注：與對照組相比a)P<0.05，b)P<0.01；與AD模型組相比c)P<0.05,d)P<0.01；與石杉堿甲組相比e)P<0.05。

2.3免疫組化APP和NEP蛋白的表達

與正常對照組相比，AD模型組小鼠海馬組織APP陽性細胞數(shù)明顯增加(P<0.01)；NEP陽性細胞數(shù)明顯減少(P<0.01)；與AD模型組相比, 石杉堿甲組和TMP各組 APP陽性細胞數(shù)明顯減少(P<0.01，P<0.05) ，NEP陽性細胞數(shù)明顯增加(P<0.01，P<0.05),TMP各組與石杉堿甲組相比，APP和NEP陽性細胞數(shù)差異均無顯著性(P>0.05)。提示TMP能減少APP的表達和增加NEP的表達。見表3。

表3　各組小鼠海馬APP和NEP表達陽性細胞數(shù)±s)

注：與對照組相比a)P<0.05，b)P<0.01；與AD模型組相比c)P<0.05,d)P<0.01；與石杉堿甲組相比e)P<0.05，f)P<0.01。

3討論

逃避潛伏期是隱蔽平臺試驗中的反映動物空間記憶，即學習能力的實驗；空間探索試驗是測定動物記憶保持能力[5]。研究結果顯示，與正常對照組相比，AD模型小鼠逃避潛伏期明顯延長, 停留在原平臺象限的時間明顯縮短，穿越原平臺次數(shù)明顯減少，表明AD小鼠學習能力和記憶保持能力明顯降低。與AD模型組相比，石杉堿甲組和TMP 各組小鼠的逃避潛伏期明顯縮短, 停留在原平臺象限的時間明顯延長，穿越原平臺次數(shù)明顯增加， 表明經(jīng)TMP治療可以顯著改善AD小鼠的學習能力和記憶保持能力。本實驗應用免疫組化法檢測海馬組織APP和NEP蛋白表達的結果中顯示：與正常對照組相比，AD模型組小鼠海馬組織APP陽性細胞數(shù)明顯增加；NEP陽性細胞數(shù)明顯減少；與AD模型組相比, 石杉堿甲組和TMP各組 APP陽性細胞數(shù)明顯減少，NEP陽性細胞數(shù)明顯增加。以上結果說明, TMP可以通過降低腦內(nèi)APP的表達和增加NEP表達，改變Aβ的代謝，減少Aβ生成，在一定程度上抑制Aβ聚集，從而延緩AD小鼠大腦病理進程，減少Aβ對腦細胞神經(jīng)元的損傷，從而延緩AD小鼠大腦病理進程，改善小鼠學習記憶能力，為TMP臨床治療AD提供可行性依據(jù)。

參考文獻：

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基金項目：①1.黑龍江省衛(wèi)生廳科研項目，編號：2009-336；2.黑龍江省普通高等學校青年學術骨干支持計劃項目，編號：1252G059；3. 黑龍江省自然科學基金資助項目，編號：H2015074；4.佳木斯大學科技重點項目，編號：Sz2011-009。

作者簡介：柳朝陽(1971～)男，黑龍江佳木斯人，碩士，副主任醫(yī)師。 通訊作者：張濤(1971～)女，黑龍江佳木斯人，博士，教授，碩士研究生導師。E-mail：ztlzy1971@163.com。

中圖分類號：R749.16

文獻標識碼：A

文章編號：1008-0104(2016)03-0008-02

(收稿日期：2015-02-20)