王　霄，文　強，岳健博，曹志敏，黃　璐，閆　鴻，張建勇，陳　玲

(遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院 呼吸二科，貴州 遵義　563099)

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臨床醫(yī)學研究

GeneXpert Mtb/RIF、抗酸染色及培養(yǎng)在淺表淋巴結結核診斷中的比較研究

王霄，文強，岳健博，曹志敏，黃璐，閆鴻，張建勇，陳玲

(遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院 呼吸二科，貴州 遵義563099)

[摘要]目的 比較GeneXpert Mtb/RIF、抗酸桿菌涂片和結核菌培養(yǎng)3種檢測技術對診斷淺表淋巴結結核的應用價值。方法 收集2015年4月至2016年1月就診于遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院結核及呼吸門診臨床疑診淺表淋巴結結核患者的淋巴結穿刺液標本32例，將每例標本分為一式三份，分別進行GeneXpert Mtb/RIF、AFB和結核菌培養(yǎng)檢測，統(tǒng)計和分析3種實驗室檢測方法的診斷價值。結果 32例標本中，GeneXpert Mtb/RIF檢測25例陽性，陽性率78.1%(25/32)，7例陰性；7例GeneXpert Mtb/RIF陰性患者中6例臨床診斷淋巴結結核，抗結核治療有效，1例確診為淋巴結炎?？顾釛U菌涂片檢測5例陽性，陽性率 15.6%(5/32)，該5例GeneXpert Mtb/RIF檢測均陽性。結核菌培養(yǎng)1例陽性，陽性率3.1%(1/32)，行藥敏試驗提示對利福平耐藥，該例抗酸桿菌涂片陽性，且與GeneXpert Mtb/RIF檢測存在利福平耐藥基因突變相一致。結論 GeneXpert Mtb/RIF在淺表淋巴結結核的診斷中有較高的特異性和敏感性，優(yōu)于抗酸桿菌涂片和結核菌培養(yǎng)傳統(tǒng)診斷方法，值得臨床推廣應用。

[關鍵詞]GeneXpert Mtb/RIF；抗酸桿菌涂片；結核菌培養(yǎng)；診斷；淋巴結結核

結核病的有效控制在于對結核病患者的快速診斷與治療。淺表淋巴結結核主要見于頸部淋巴結結核，其次為腋窩淋巴結結核。頸部淋巴結結核是肺外結核中最為常見的結核病之一，通常表現(xiàn)為多個淋巴結腫大、而無明顯結核病的全身中毒癥狀及體征，因此其診斷取決于醫(yī)務人員對該病的警覺性以及實驗室和病理學檢查[1]。傳統(tǒng)的實驗室檢測診斷方法特異性和敏感性不盡人意，如AFB檢測雖然操作簡便、快速、經(jīng)濟，但靈敏性較低[2]；傳統(tǒng)固體培養(yǎng)法是結核病診斷的金標準，敏感性較涂片鏡檢法高，但耗時長，不能進行快速診斷；液體培養(yǎng)法也需1～2周才能獲得結果[3]。因此一種可以快速診斷結核病的實驗室方法對于臨床結核病的快速診斷顯得非常重要。近年來，WHO推薦利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增技術(Xpert Mtb/RIF)作為快速分子診斷技術用于臨床，目前主要用于肺結核痰液的檢測，對肺外結核病標本的檢驗，特別是頸部淋巴結結核的檢測，國內(nèi)尚未見報道。本研究擬通過對淋巴結穿刺液進行Xpert Mtb/RIF、抗酸桿菌涂片及結核菌培養(yǎng)3種檢測進行比較，了解Xpert Mtb/RIF在頸部淋巴結結核標本檢測中的敏感性和特異性，評價Xpert Mtb/RIF技術在淺表淋巴結結核診斷中的應用價值。

1資料與方法

1.1一般資料收集2015年4月至2016年1月我院結核及呼吸門診臨床疑診淺表淋巴結結核患者32例，其中疑診單純頸部淋巴結結核12例，淋巴結結核合并肺結核19例，腋窩淋巴結結核合并肺結核1例；男性13例，女性19例，年齡14～54歲。頸部淺表淋巴結經(jīng)B超檢查提示淋巴結有液化、壞死，或肉眼見膿腫和/或竇道形成。

1.2方法

1.2.1標本留取收集頸部及腋窩淋巴結結核患者淋巴結穿刺液標本0.05～3 mL，一式3份分別用于XPERT MTB/RIF、抗酸桿菌涂片和結核菌培養(yǎng)檢測。課題組2015年獲由中國疾病預防控制中心頒發(fā)的Xpert Mtb/RIF檢測能力驗證證書。

1.2.2檢測方法

1.2.2.1Xpert Mtb/RIF檢測用10 mL高壓滅菌的離心管，以1∶2 比例分別加入標本和標本處理液，上下顛倒混勻20次，室溫靜置15 min，使標本充分液化。利用移液槍將上清轉移至反應盒中，將反應試劑盒掃描二維碼，錄入信息，放入Gene Xpert儀器(美國Cepheid 公司生產(chǎn))中，2 h后讀取結果。結果判斷：依照探針的循環(huán)閾值，當內(nèi)參探針循環(huán)閾值≤38時檢測為陽性，>38則為無效， 提示標本的DNA 提取不合格或含有PCR 抑制物。5個探針中至少2個探針循環(huán)閾值≤38即為檢測到MTB，可進一步按照探針循環(huán)閾值對結核分枝桿菌DNA進行半定量。閾值<16為高含量，閾值為16～22為中等含量，閾值為22～28為低含量，閾值>28為極低含量。檢測利福平耐藥的基礎在于結核分枝桿菌特異性分子早期閾值和晚期閾值之差，即△閾值。系統(tǒng)設置的結果判斷標準為△閾值>3.5提示對利福平常見耐藥基因存在突變，△閾值<3.5提示對利福平常見耐藥基因未見突變。由于終止循環(huán)數(shù)為38個循環(huán)，當早期探針閾值>34.5或晚期探針閾值>38時，利福平耐藥結果為不確定。

1.2.2.2抗酸桿菌涂片涂片自然干燥后，經(jīng)火焰固定，加石碳酸復紅溶液蓋滿玻片，染色5 min，水洗。加酸性酒精溶液蓋滿玻片，脫色1～2 min，水洗。 加亞甲基藍溶液，染色30 s，水洗干燥后，鏡檢。 結果判定按照中國防癆協(xié)會基礎專業(yè)委員會制訂的實驗室檢查規(guī)程進行[4]。

1.2.2.3結核分枝桿菌固體培養(yǎng)法取4倍體積的4%NaOH溶于淋巴結穿刺液標本中，間隙振動搖勻15 min，使臨床標本充分液化，1 000 rpm 5 min；用一次性無菌吸管取沉淀2～3滴，均勻分布于酸性培養(yǎng)基斜面的上、中、下部，蓋緊蓋子，將接種標本的培養(yǎng)基管斜放入37 ℃培養(yǎng)箱中，分別于接種后第3、7天觀察，1周后每周觀察1次，并記錄相關結果。

1.2.2.4結核分枝桿菌藥敏試驗(比例法)用接種環(huán)取一環(huán)培養(yǎng)基上的單克隆菌落，磨菌器研磨后與標準麥氏管比對并制成1 mg/mL菌懸液，梯度稀釋為兩個濃度，分別為2～10 mg/mL和4～10 mg/mL，最后接種到含有濃度為40 μg/mL利福平的羅氏固體培養(yǎng)基和空白對照管培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)4～8周，觀察結果。

1.3統(tǒng)計分析使用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，使用配對χ2檢驗計算Xpert Mtb/RIF與抗酸桿菌涂片及結核菌培養(yǎng)在敏感性上是否存在差異，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

32例可疑淺表淋巴結結核患者中，單純頸部淋巴結結核11例，單純淋巴結炎1例；頸部淋巴結結核合并肺結核19例，腋窩淋巴結結核合并肺結核1例。

32例淋巴結穿刺液標本中，25例Xpert Mtb/RIF檢測陽性，7例陰性，陽性率 78.1%(25/32)；1例結核菌培養(yǎng)陽性，31例陰性，陽性率 3.1%(1/32)，Xpert Mtb/RIF與結核菌培養(yǎng)二者比較，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=37.31，P<0.05)；5例抗酸桿菌涂片陽性(+～++++)，27例陰性，陽性率15.6%(5/32)，該5例GeneXpert Mtb/RIF檢測均陽性，Xpert Mtb/RIF與抗酸桿菌涂片二者比較，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=25.10，P<0.05)。2例Xpert Mtb/RIF檢測存在利福平耐藥決定區(qū)基因突變，提示對利福平耐藥，其中1例傳統(tǒng)藥敏試驗提示利福平表型耐藥。

表13種檢測方法在32例淋巴結穿刺液中的應用比較

檢測方法陽性(例)陰性(例)陽性率(%)XpertMtb/RIF25778.1抗酸桿菌涂片52715.6結核菌培養(yǎng)1313.1

3討論

32例可疑淺表淋巴結結核患者，年齡14～54歲，最終診斷為淺表淋巴結結核31例。31例患者中，男性13例，女性18例?？傮w來看，結核病(包括肺結核和肺外結核)患者男女比例男性多于女性[5]，但在31例頸部淋巴結結核患者中，女性較男性多，提示女性對于頸部淋巴結結核可能存在一定的易感性，但由于標本量較少，后續(xù)需擴大樣本量進一步分析。

淋巴結結核目前的診斷主要依靠病理學診斷，對于液化壞死的淺表結巴結結核，其標本難以獲得結構較完整的組織行病理學檢查；傳統(tǒng)的涂片方法耗時較短，但陽性率低；培養(yǎng)方法雖然陽性率較涂片高，但是培養(yǎng)周期長，不能在短時間內(nèi)得到結果，難以為患者達到早期快速診斷和治療的目的。本研究收集可疑淺表淋巴結結核患者淋巴結穿刺液標本分別進行Xpert Mtb/RIF、結核菌涂片、傳統(tǒng)結核菌培養(yǎng)以及藥敏試驗檢測，評價3種檢測技術對診斷淺表淋巴結結核的應用價值。培養(yǎng)陽性的1例標本同時進行Xpert Mtb/RIF檢測仍陽性，以結核分枝桿菌培養(yǎng)為金標準，Xpert Mtb/RIF檢測結核分枝桿菌的特異性100%；Xpert Mtb/RIF的陽性率為78.1%，較陳海強等[6]在痰液中進行Xpert Mtb/RIF檢測的陽性率(59.2%)高。國外文獻[7]中在淋巴結結核細針穿刺標本進行Xpert Mtb/RIF檢測的陽性率(60.1%)，說明Xpert Mtb/RIF在應用于可疑肺外結核標本的診斷中相比于傳統(tǒng)的抗酸桿菌涂片具有更高的價值，并且能夠在短時間內(nèi)(2 h左右)得以診斷。本研究中結核分枝桿菌培養(yǎng)陽性率較低，其原因主要考慮有以下幾個方面：①在收集標本的過程中，有些標本量較少，在處理過程中經(jīng)過稀釋，導致培養(yǎng)陽性率降低；②部分患者在收集標本的時候已經(jīng)經(jīng)過抗結核治療，導致標本中菌量減少，培養(yǎng)陽性率低；③抗酸桿菌涂片及Xpert Mtb/RIF檢測陽性的標本中部分為死菌，因此雖然涂片和Xpert Mtb/RIF檢測陽性，但培養(yǎng)陰性。

傳統(tǒng)結核菌藥敏試驗一般需要4～8周，耗時長，不能及時的為可疑耐藥的結核病患者在制定治療方案方面提供依據(jù)。目前研究表明95%的利福平耐藥菌株在rpoB基因81 bp 區(qū)域(RRDR)存在基因突變[8]，而Xpert Mtb/RIF對于利福平耐藥決定區(qū)基因突變的檢測，耗時短，從基因型上了解結核菌有無利福平耐藥，在耐藥高發(fā)地區(qū)從一定程度上能夠為臨床患者是否對利福平耐藥提供依據(jù)，為患者治療方案的制定提供幫助。本研究32例淋巴結穿刺液標本中，Xpert Mtb/RIF檢測存在利福平耐藥基因突變2例，其中1例標本在傳統(tǒng)藥敏試驗中同時存在利福平表型耐藥，提示利福平耐藥表型與基因型之間存在一定的關聯(lián)性，與國外文獻報道相符合[9]。但是目前該檢測只能針對利福平的耐藥相關基因進行檢測，尚不能完成其他抗結核藥耐藥相關基因的檢測，且結核分枝桿菌表型與基因型耐藥雖然有一定的相關性，但基因型耐藥并不能完全代表表型耐藥，研究表明利福平表型耐藥，但在利福平耐藥決定區(qū)未發(fā)現(xiàn)突變[10]，因此，Xpert Mtb/RIF可快速檢測是否有利福平基因型耐藥，但在臨床工作中仍需結合患者病史及結核菌藥敏試驗為患者制定合理的治療方案。

綜上所述，Xpert Mtb/RIF作為一種分子診斷技術，在頸部及腋窩淋巴結結核的診斷方面具備快速、特異和敏感的診斷優(yōu)勢，其臨床應用能夠有效縮短淋巴結結核患者的診斷時間，提高診斷效率，優(yōu)于抗酸桿菌涂片和結核菌培養(yǎng)傳統(tǒng)診斷方法，值得臨床推廣應用。

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[收稿2016-04-18;修回2016-05-10]

(編輯：王福軍)

[基金項目]中國全球基金耐多藥結核病規(guī)范化診療項目(NO：CHN-S10-G14-T)。

[通信作者]陳玲，女，博士，教授，碩士生導師，研究方向：肺部感染和結核病的基礎與臨床研究，E-mail:Lingjuncd@163.com。

[中圖法分類號]R522

[文獻標志碼]A

[文章編號]1000-2715(2016)03-0275-04

Efficiency of GeneXpert Mtb/RIF, AFB and culture on diagnosis of patients with superficial tuberculosis of lymph nodes

WangXiao,WenQiang,YueJianbo,CaoZhimin,HuangLu,YanHong,ZhangJianyong,ChenLing

(Second Department of Respiratory Medicine, Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099，China)

[Abstract]Objective Comparative efficiency of GeneXpert Mtb/RIF, AFB and culture on diagnosis of patients with superficial tuberculosis of lymph nodes.Methods 32 samples of puncture fluids of lymph node from patients with suspicious tuberculous lymphadenitis were collected in the outpatients for TB and respiratory diseases of the second department of respiratory medicine in Affiliated Hospital of Zunyi Medical University from April 2015 to January 2016, each sample was triplicated for assays of GeneXpert MTB/RIF, AFB and mycobacterium tuberculosis culture, respectively.Results 25 (78.1%) out of 32 samples were positive and 7 were negative in GeneXpert Mtb/RIF assay, in the seven negative samples one was lymphnoditis and the others were tuberculous lymphadenitis. 5 (15.6%) were positive and 17 were negative in AFB assay, the positive 5 samples in AFB were consistent with the results of GeneXpert Mtb/RIF. 1 (3.1%) was positive and 31 were negative in culture method, the further assay of drug susceptibility test for the positive samples showed this clinic strain was resistant to Rifampicin,consistent with the result of GeneXpert Mtb/RIF.Conclusion the technique of GeneXpert Mtb/RIF reveals a higher sensibility and specificity than the methods of AFB and culture in diagnosis of tuberculous lymphadenitis and has application values in the future.

[Key words]GeneXpert Mtb/RIF；AFB；tubercle bacillus culture；diagnosis；tuberculous lymphadenitis