顧延會，符丹丹，饒習(xí)敏，歐陽瑤

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，貴州 遵義　563099)

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基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

CCL20及其受體CCR6在COPD氣道內(nèi)及外周血的變化及意義

顧延會，符丹丹，饒習(xí)敏，歐陽瑤

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，貴州 遵義563099)

[摘要]目的 研究CCL20、CCR6在COPD大鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)及外周血中的含量及CCL20抗體治療后的變化，以了解CCL20/CCR6趨化軸在COPD發(fā)病過程中的可能作用機(jī)制及CCL20抗體的治療作用。方法 30只Wistar大鼠隨機(jī)分為正常組、COPD組及CCL20治療組，每組10只，采用煙熏4周及氣道內(nèi)注入脂多糖(LPS)2次的方法制備COPD組模型，CCL20治療組模型于造模前第1天腹腔內(nèi)注入CCL20抗體，余處理同COPD組。3組大鼠均于4周后處死取其肺組織行病理HE染色，同時采用ELISA方法測定BALF及外周血中CCL20、CCR6的含量。結(jié)果 COPD組大鼠肺組織病理顯示符合人類COPD特征性病理改變，CCL20治療組肺組織病理顯示其病變性質(zhì)較COPD組減輕。CCL20治療組大鼠BALF中CCL20及CCR6含量均高于正常對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但低于COPD組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。CCL20治療組大鼠外周血中CCL20的含量高于正常對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但與COPD組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；外周血中CCR6的含量在3組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 CCL20及其受體CCR6可能參與COPD發(fā)病及進(jìn)展過程，CCL20抗體可影響CCL20及CCR6在氣道內(nèi)的變化，可改善COPD大鼠一般狀態(tài)及病理損傷進(jìn)展。

[關(guān)鍵詞]慢性阻塞性肺疾??；Wistar大鼠；CCL20；CCR6

慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD)是一種常見病、多發(fā)病，死亡率高，其發(fā)病機(jī)制不明，尚無特效治療藥物[1]。CC亞族趨化因子配體20(CC chemokine ligand 20，CCL20)是近來發(fā)現(xiàn)的一種CC趨化因子，主要表達(dá)在肝臟、肺臟及外周血細(xì)胞，與其唯一受體CC趨化因子受體6(CC chemokine receptor 6，CCR6)特異性結(jié)合，可能參與氣道的慢性炎癥及免疫反應(yīng)過程，即一方面刺激機(jī)體發(fā)生適當(dāng)?shù)拿庖叻磻?yīng)，抵御微生物入侵，另一方面介導(dǎo)病理學(xué)組織損傷，那么CCL20/CCR6在COPD發(fā)病過程中的可能起著重要作用[2-3]。本文就CCL20、CCR6在COPD大鼠BALF及外周血中的含量及CCL20抗體干預(yù)后的變化進(jìn)行研究，以深入了解COPD的可能發(fā)病機(jī)制及CCL20抗體的治療作用。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)對象及分組SPF級雄性Wistar大鼠30只，體重(200±20)g，由重慶第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，用隨機(jī)數(shù)字法將其分為3組：正常組、COPD組和CCL20治療組,每組10只。

1.2主要試劑脂多糖(E.coli055:B5)由美國Sigma公司生產(chǎn)；MIP-3α(G-20)由美國santa公司生產(chǎn)；大鼠巨噬細(xì)胞炎性蛋白3α(MIP-3α/CCL20)ELISA試劑盒、大鼠趨化因子受體6 ELISA試劑盒由美國B&D公司生產(chǎn)，上海西塘生物科技有限公司提供。

1.3模型制備COPD組大鼠于第1天、第15天氣道內(nèi)注入LPS溶液(200 μg/200 μL)0.2 mL，第2天至第28天(除外第15天)于自制煙熏箱內(nèi)予被動吸煙，上午、下午各1次，每次12支，約30 min，2次至少間隔2 h呼吸正常空氣。CCL20治療組大鼠于第1天注LPS前腹腔注射CCL20單克隆抗體(100 μg/只)，余處理同COPD組。正常組大鼠未予任何干預(yù)。

1.4實(shí)驗(yàn)標(biāo)本獲取及處理3組大鼠均于4周后麻醉、固定、獲取外周血并處死，并立即結(jié)扎右肺，取下葉組織約1cm×1cm×1cm行組織病理HE染色；同時回收左側(cè)肺BALF標(biāo)本(回收率>80%)，離心后取上清液備用，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測定BALF中CCL20、 CCR6的含量。

2結(jié)果

2.13組大鼠一般狀況正常組大鼠一般狀況良好，體重增加迅速。COPD組大鼠隨著煙熏時間延長，一般狀況逐漸變差，主要表現(xiàn)在毛發(fā)無光澤，消瘦，神情倦怠，活動減少，且行動緩慢。CCL20治療組大鼠一般狀況較健康組差，但較COPD組明顯見好。3組大鼠第28天體重變化有差異(F=7.38，P<0.05)；因方差齊，兩兩比較用LSD法，結(jié)果見表1。

表13組大鼠第28天體重比較 (n=10)

組別體重(g)正常組324.18±12.89COPD組242.31±14.71*CCL20治療組300.03±12.68#

*與正常組比較，P<0.05；#與COPD組比較，P<0.05。

2.23組大鼠第28天肺組織病理學(xué)改變正常組：肺泡結(jié)構(gòu)正常連續(xù)，支氣管管壁未見腺體及炎性細(xì)胞浸潤。COPD組：肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡壁變薄或斷裂，肺泡腔擴(kuò)大，部分融合，支氣管黏膜上皮脫落，管壁及周圍見大量單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤。CCL20治療組：小支氣管管壁及周圍少量淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤，余同COPD組。具體見圖1～3及既往發(fā)表文章[4-5]。

2.33組大鼠外周血中CCL20及CCR6的含量3組大鼠外周血CCL20總體比較有差異(F=12.78，P<0.05)；因方差齊，兩兩比較用LSD法，COPD組及CCL20治療組大鼠外周血中CCL20含量均高于正常對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05，但CCL20治療組與COPD組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；外周血中CCR6的含量在3組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.78，P>0.05)，具體見表2。

表23組大鼠外周血中CCL20及CCR6的含量(n=10)

組別CCL20CCR6正常組22.25±6.05311.12±29.78COPD組69.35±14.37*264.89±45.34CCL20治療組68.71±18.02*280.94±30.07

*與正常組相比，P<0.05。

2.43組大鼠BALF中CCL20及CCR6的含量3組大鼠BALF中CCL20及CCR6含量總體比較均有差異(F=32.92，54.65，P均<0.05)；因方差齊，兩兩比較用LSD法，COPD組及CCL20治療組大鼠BALF中CCL20及CCR6含量均高于正常對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；COPD組BALF中CCL20及CCR6含量均高于CCL20治療組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，具體見表3。

表33組大鼠BALF中CCL20及CCR6的含量(n=10)

組別CCL20CCR6正常組11.70±8.8043.57±5.51COPD組40.48±19.22*105.81±2.73*CCL20治療組32.04±10.52*#79.84±11.23*#

*與正常組比較，P<0.05；#與COPD組比較，P<0.05。

3討論

COPD是一種氣道慢性炎癥性疾病[1]，其發(fā)病機(jī)制與多種因素相關(guān)，目前認(rèn)為長期接觸有害顆粒，如香煙煙霧，可導(dǎo)致氣道的慢性炎癥，進(jìn)而出現(xiàn)不可逆的氣流受限和肺功能逐年下降，然而吸煙停止后此過程仍持續(xù)存在并進(jìn)展，可見免疫因素參與COPD進(jìn)展。故由此可見COPD發(fā)病及加重過程中炎癥反應(yīng)及免疫反應(yīng)共同起著重要的作用，其中趨化因子及其受體參與其中，本課題組既往研究發(fā)現(xiàn)CCL20、CCR6[4,6-9]及其他因子[10]通過影響氣道內(nèi)樹突狀細(xì)胞(DCs)變化參與COPD免疫反應(yīng)及機(jī)體炎癥反應(yīng)過程。

趨化因子是一類對炎癥細(xì)胞有激活、趨化和遷移作用，同時介導(dǎo)免疫反應(yīng)的小分子多肽。CCL20是CC趨化因子中的一種，其具有專一的受體CCR6，其主要表達(dá)在未成熟樹突狀細(xì)胞(iDCs)、B細(xì)胞、T細(xì)胞及多種腫瘤細(xì)胞[11]。CCL20通過趨化CCR6+細(xì)胞向抗原出現(xiàn)的組織部位定向遷移。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)CCL20/CCR6在炎癥反應(yīng)性疾病、免疫性疾病及腫瘤疾病，如肝炎、動脈粥樣硬化、結(jié)腸癌、胰腺癌等疾病中均起著重要作用，且研究發(fā)現(xiàn)CCL20可通過CCR6對iDCs進(jìn)行選擇性趨化，煙霧及炎癥刺激可引起DCs在氣道及肺組織內(nèi)的募集[7-9]，進(jìn)而影響氣道慢性炎癥性疾病如COPD、支氣管哮喘的發(fā)生、發(fā)展。既往研究發(fā)現(xiàn)敲除CCR6基因可通過阻斷CCL20/CCR6軸而減少CCL20、CCR6在氣道內(nèi)的變化，從而減緩COPD進(jìn)展，但敲除人類CCR6基因可行性小。本實(shí)驗(yàn)研究通過煙熏和炎癥刺激大鼠制造COPD模型，并通過選定CCL20抗體是否能通過抑制CCL20/CCR6軸阻止CCL20及CCR6在氣道內(nèi)的聚集，進(jìn)而深入研究人類COPD的發(fā)病機(jī)制及可能有效治療措施。

本次實(shí)驗(yàn)研究正常組、COPD組和CCL20治療組大鼠一般情況及肺組織病理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著煙熏時間延長及LPS刺激影響，COPD組大鼠一般狀況逐漸變差，取其肺組織行病理切片HE染色顯示肺氣腫表現(xiàn)及大量單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤等炎癥表現(xiàn)，符合人類COPD一般狀態(tài)及病理改變情況。3組比較，CCL20治療組大鼠一般狀況結(jié)果均提示較健康組差，但較COPD組明顯見好；病理結(jié)果均提示肺氣腫程度及肺泡周圍炎癥細(xì)胞浸潤程度均較健康組加重，但較COPD組有所減輕。提示煙霧或炎癥刺激可引起氣道內(nèi)炎癥，且經(jīng)過反復(fù)煙熏及LPS刺激導(dǎo)致氣道重建、全身炎癥反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致COPD不可逆的進(jìn)展，CCL20抗體可能改善COPD大鼠一般狀態(tài)并延緩病理損傷過程。

本實(shí)驗(yàn)中CCL20治療組大鼠BALF中CCL20及CCR6含量均高于正常對照組，但低于COPD組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與既往人體痰液研究[9]中CCL20、CCR6在COPD誘導(dǎo)痰中含量高于正常對照組相符，同時提示氣道內(nèi)CCL20、CCR6的含量變化受CCL20抗體的影響同步增減，可見CCL20抗體可能影響氣道局部CCL20、CCR6的變化。外周血中CCL20含量高于正常對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但與COPD組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；外周血中CCR6的含量在3組變化不大，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示CCL20抗體不影響外周血中CCR6的變化，可影響外周血中CCL20的變化。故CCL20抗體可能通過影響外周血中CCL20進(jìn)而影響到氣道內(nèi)CCL20、CCR6的變化。

總之，煙霧或炎癥刺激可引起氣道內(nèi)炎癥，且經(jīng)過反復(fù)煙熏及LPS刺激導(dǎo)致氣道重建、全身炎癥反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致COPD不可逆的進(jìn)展，CCL20及其受體CCR6可能參與COPD發(fā)病過程，可通過CCL20抗體改變CCL20及CCR6在氣道內(nèi)的變化，同時改善COPD大鼠一般狀態(tài)及延緩病理損傷進(jìn)展，為人類COPD的進(jìn)一步防治提供依據(jù)。

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[收稿2016-03-13;修回2016-04-11]

[基金項(xiàng)目]國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(NO：81460008)；貴州省科學(xué)技術(shù)基金資助項(xiàng)目(NO：黔科合J字LKZ(2012)08)；貴州省省長基金資助項(xiàng)目(NO：黔科合SY字[2009]3053)。

[通信作者]歐陽瑤，女，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，研究方向：COPD發(fā)病機(jī)制，E-mail:ouyangyao116@sohu.com。

[中圖法分類號]R563.3

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號]1000-2715(2016)03-0266-04

The changes of CCL20 and its receptor CCR6 in COPD airway and peripheral blood and the therapeutic effect of CCL20 antibodies

GuYanhui,FuDandan,RaoXimin,OuyangYao

(Department of Respiratory Medicine， Affiliated Hospital of Zunyi Medical University，Zunyi Guizhou 563099，China)

[Abstract]Objective To study the contents of CCL20 and CCR6 in COPD rats broncho-alveolar lavage fluid (BALF) and peripheral blood, and the therapeutic effect of CCL20 antibodies, in order to understand the possible mechanism of CCL20 / CCR6 chemotaxis on the pathogenesis of COPD.Methods 30 Wistar rats were randomly divided into normal group (n=10), COPD group (n=10) and treatment with CCL20 antibody group (n=10). The rats of COPD group were established via cigarette inhalation for 4 weeks and intratracheal lipopolysaccharide (LPS) solution twice totally, and there were intraperitoneal injection of CCL20 antibody in the treatment of CCL20 groups on the first day. The pathomorphology of rats' lung and bronchiole were investigated by HE staining after 4 weeks, while the contents of CCL20 and CCR6 were analyzed with ELISA in the BALF and peripheral blood.Results The changes of pathology of the COPD group of rat lung tissue were the same as those of COPD patients, and the treatment of CCL20 antibody reduced lesions in the COPD group. The contents of CCL20 and CCR6 in BALF of CCL20 antibody group were significantly increased compared with the normal control group (P<0.05), but were significantly decreased compared with the COPD group, there was a difference statistically significant (P< 0.05). The contents of CCL20 in the peripheral blood CCL20 antibody group were significantly increased compared with the normal control group, but there was no difference compared with the COPD group; the contents of CCR6 in peripheral blood in three groups had little changes, there were no differences.Conclusion CCL20 and its receptor CCR6 may participate in COPD pathogenesis process, CCL20 antibody can change the contents of CCL20 and CCR6 in the airway，and can improve the general status and pathologic progression of COPD rats.

[Key words]Chronic Obstructive Pulmonary Disease; Wistar rat;C-C chemokine ligand 20;CC chemokine receptor 6