楊 紅，張 勇，何 琦，李 俊，張 雄，彭 松

（1.畢節(jié)市農(nóng)業(yè)經(jīng)營管理站，貴州 畢節(jié) 551700；2.貴州大學高原山地動物遺傳育種與繁殖省部共建教育部重點實驗室/貴州大學動物科學學院/貴州省動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，貴州 貴陽 550025；3.貴陽市花溪區(qū)農(nóng)業(yè)局，貴州 貴陽 550025）

3個雞種NKX2-5基因多態(tài)性與脛長的關聯(lián)性分析

楊 紅1，張 勇2，何 琦3，李 俊2，張 雄2，彭 松2

（1.畢節(jié)市農(nóng)業(yè)經(jīng)營管理站，貴州 畢節(jié) 551700；2.貴州大學高原山地動物遺傳育種與繁殖省部共建教育部重點實驗室/貴州大學動物科學學院/貴州省動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，貴州 貴陽 550025；3.貴陽市花溪區(qū)農(nóng)業(yè)局，貴州 貴陽 550025）

以貴州特有雞種高腳雞、矮腳雞和百宜黑雞為試驗對象，利用PCR-SSCP和DNA測序等方法檢測了NKX2-5 基因T563C、C675T位點在3個試驗雞群中不同基因型與脛長的關聯(lián)性。T563C與脛長關聯(lián)分析表明，高腳雞群體中TT基因型個體脛長顯著高于CC型，百宜黑雞群體中TT基因型顯著高于CT型，矮腳雞群體中不同基因型個體間脛長差異不顯著；C675T突變位點在3個雞種中只有CC和CT兩種基因型，且各雞種不同基因型個體間脛長差異不顯著。

NKX2-5 基因；雞；脛長；SSCP；多態(tài)性

楊紅，張勇，何琦，等.3個雞種NKX2-5基因多態(tài)性與脛長的關聯(lián)性分析［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學，2016，43（6）：156-162.

NKX2-5基因是NK-2基因家族中被發(fā)現(xiàn)的第5個基因，因此命名為NKX2-5［1］。人NKX2-5基因?qū)π呐K發(fā)育具有非常重要的作用，也是最早的心臟前體細胞分化標志之一，在心臟前體細胞分化、傳導系統(tǒng)和方式分隔的形成、維持正常成熟心臟功能起著關鍵作用［2-3］。NKX2-5基因參與了心臟發(fā)生及發(fā)育的每個過程，其正常表達對心室和心房發(fā)育、房室瓣形成、動脈干分隔、心臟的環(huán)化及房室傳導維持均有著重要作用［4-5］。陳丹盈［6］在NKX2-5/TBX5/GATA4等基因在雞、鵪鶉及其屬間雜交種胚胎心臟發(fā)育過程中的表達研究中報道，NKX2-5在禽類心臟的發(fā)育及成熟具有調(diào)控作用。也有報道稱，NKX2-5基因在調(diào)節(jié)組織分化所需的組織特異性基因表達和決定發(fā)育的時空類型上具有重要作用［7］。關于雞NKX2-5基因?qū)γ劰前l(fā)育影響的研究報道較為少見，孫艷發(fā)等［8］在雞脛長和脛圍的全基因組關聯(lián)分析中，發(fā)現(xiàn)了1個與雞脛長達到5%全基因組水平顯著關聯(lián)的基因，即位于13號染色體上的NKX2-5基因，另有4個潛在基因，分別為FAM48A、CLSTN2、 GABRG2 、HOXB3。

我們前期在不同雞品種NKX2-5基因外顯子1中檢測到兩個SNP位點，分別為T563C和C675T，且均為錯義突變。其中，T563C位點導致其編碼的絲氨酸（Ser）變?yōu)楦彼幔≒ro），C675T位點導致其編碼的丙氨酸（Ala）變?yōu)槔i氨酸（Val）［9］，為進一步研究該基因在不同雞種中的差異性，確定高腳雞遺傳機制，特展開本試驗。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

109份高腳雞血樣采自貴州省安順市普定縣坪上鄉(xiāng)硝洞高腳雞保種場及周邊村寨；99份矮腳雞血樣采自貴州省黔西南州興義市興牧畜禽水產(chǎn)科技服務中心矮腳雞養(yǎng)殖場；69份百宜黑雞血樣采自其中心產(chǎn)區(qū)貴州省貴陽市烏當區(qū)百宜鄉(xiāng)。各雞群健康且為自然散養(yǎng)。于雞翅下靜脈采血3～5 mL，裝于肝素鈉抗凝管中并充分混勻，冰盒帶回實驗室-20℃低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

主要試劑：TBE緩沖液、DEPC處理水（實驗室自備）；血液基因組DNA提取試劑盒、核酸染料、DL2000 DNA Marker等均購自上海生工生物工程技術服務有限公司。

試驗儀器：Bio-rad C1000 TouchTM Thermal Cycler PCR儀、北京六一儀器廠DYCZ-24F電泳儀、Bio-radIQ5伯樂熒光定量PCR儀、伯樂ChemidocTMXRS+凝膠成像儀、Thermo NANODROP 2000微量分光光度計、Eppendorf 各型號移液器。

1.2 雞脛長測量

根據(jù)中華人民共和國農(nóng)業(yè)部發(fā)布的《家禽生產(chǎn)性能名詞術語和度量統(tǒng)計方法》（NY/T 823-2004）中脛長測量方法進行測量，用卡尺測量脛骨上關節(jié)到第3趾與第4趾間的垂直距離。

1.3 DNA提取和檢測

利用血液基因組DNA提取試劑盒進行DNA提取。將DNA樣品用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，用凝膠成像系統(tǒng)觀察，成像保存，并用核酸濃度測量儀測量其具體濃度。

1.4 PCR擴增

1.4.1 引物設計與合成 根據(jù)GenBank 中已發(fā)布的NKX2-5基因序列（登錄號： NC_006100.3），采用Primer Premier 5.0、Oligo 6.0等軟件，設計T563C和C675T多態(tài)位點擴增引物（表1）。

表1 PCR-SSCP 引物及擴增條件

1.4.2 PCR擴增體系及條件 本試驗采用10 μL PCR反應體系：DNA模板1 μL，上下游引物各1 μL，2×Taq PCR Master Mix 5 μL，ddH2O 2 μL。PCR反應條件：94～95℃進行預變性5 min；94～95℃變性30 s，59～62℃退火30～40 s，72℃延伸40～60 s，共30～32個循環(huán)；72 ℃延伸5～7 min；4℃保存。將PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)成像并保存。

1.5 SSCP

1.5.1 聚丙烯酰胺凝膠制備 利用本試驗所設計引物所擴增的PCR產(chǎn)物均適用于10%聚丙烯酰胺凝膠。本試驗根據(jù)膠板大小需要150 mL凝膠體系，含60 mL 30%聚丙烯酰胺、10×TBE 15 mL、ddH2O 44.1 mL、10% APS 816 μL、TEMED 48 μL。

1.5.2 PCR產(chǎn)物樣品處理 取7 μL PCR產(chǎn)物和7 μL變性緩沖液充分混勻后短暫離心。置于沸水中變性10 min取出，置于冰盤中移至-20℃冰箱中冰浴20 min。

1.5.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染 220 V預電泳30 min，使凝膠孔進一步沉聚。用微量進樣器將變性后的PCR產(chǎn)物全部加到膠孔中，同時加入5 μLDNA Marker 作參照。加樣結(jié)束后打開電源，220 V高壓電泳10 min使條帶分開，再將電壓調(diào)至120 V電泳過夜（12～14 h），直至溴酚藍條帶接近凝膠下緣。之后進行剝膠、銀染、顯影、脫色、照相保存。

1.6 多態(tài)片段測序

根據(jù)PCR-SSCP分析結(jié)果，將不同帶型個體的PCR產(chǎn)物送北京諾賽基因公司測序。

1.7 相關軟件及統(tǒng)計方法

引物設計軟件：Premier Primer 6.0、Oligo 6.0等軟件，NCBI Primer-blast（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）。序列分析軟件：DNAStar軟件（SeqMan、MegAlign、Editseq）等。常規(guī)統(tǒng)計軟件：SAS（9.0），SPSS（18.0）等。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA提取結(jié)果

試劑盒提取雞基因組DNA后，用含核酸染料的1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖1。電泳條帶清晰明亮，整齊無拖尾，說明所提取的基因組DNA完整、無降解和污染，可用于后續(xù)PCR反應。

圖1 高腳雞、矮腳雞和百宜黑雞基因組DNA電泳檢測結(jié)果

2.2 PCR擴增結(jié)果

根據(jù)所設計的PCR引物進行PCR擴增，用含核酸染料的1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果（圖2）擴增產(chǎn)物條帶清晰，無非特異性產(chǎn)物，可用于測序分析。

圖2 PCR擴增產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果

2.3 NKX2-5 基因T563C位點遺傳變異分析

2.3.1 PCR-SSCP分型和測序結(jié)果 針對NKX2-5基因T563C位點設計特異性引物N1（表1）對該位點進行PCR-SSCP分析，在高腳雞、矮腳雞和百宜黑雞NKX2-5基因T563C位點處檢測到2個等位基因，分別為T和C，存在3種基因型，分別定義為TT、CT和CC（圖3）。

圖3 NKX2-5基因T563C位點PCR-SSCP電泳圖譜

隨機挑選不同品種不同帶型樣本共9個，將其PCR產(chǎn)物送至北京諾賽基因組研究中心有限公司進行切膠純化測序。運用SeqMan軟件分析測序結(jié)果拼接后進行BLAST比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TT基因型個體序列與與GenBank上所公布的序列（登錄號： NC_006100.3）一致，定義為野生型，CC基因型則定義為突變型，CT基因型定義為雜合型（圖4）。

2.3.2 群體遺傳變異分析 對所發(fā)現(xiàn)的T563C位

點在3個雞種中進行群體遺傳參數(shù)統(tǒng)計分析。由表2可知，在高腳雞和矮腳雞群體中，3種基因型頻率的分布為CT ＞ TT ＞ CC，CT為優(yōu)勢基因型。而在百宜黑雞群體中，3種基因型頻率的分布為TT ＞CT ＞CC，TT為優(yōu)勢基因型。在3個受試雞群體中，T為優(yōu)勢等位基因，有效等位基因數(shù)均接近2，說明該等位基因在群體中分布均勻，3個群體中的雜合度分別為0.491、0.462和0.461，表明該SNP位點在3個群體中的變異較大。多態(tài)信息含量（PIC）均介于0.25～0.50 之間，為中度多態(tài)，說明該遺傳標記位點提供的遺傳信息比較合理，可以應用?？ǚ竭m合性檢驗顯示，3個試驗群體中的該基因座處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P ＞ 0.05）。

2.3.3 T563C位點與雞脛長性狀的關聯(lián)性分析 采用SPSS18.0軟件對高腳雞、矮腳雞和百宜黑雞NKX2-5 基因T563C位點不同基因型與其對應的脛長性狀進行關聯(lián)分析。由表3可知，在高腳雞群體中，CC基因型個體脛骨最長，其次為TT基因型，CT基因型最短，其中CC基因型個體平均脛長顯著高于CT型；在矮腳雞群體中，TT基因型脛長最長，其次為CC基因型，CT基因型最短，但差異不顯著；在百宜黑雞群體中，TT基因型個體平均脛長最大，其次為CC基因型，CT基因型最短，其中TT基因型個體脛長顯著高于CT基因型。

圖4 NKX2-5基因T563C位點測序結(jié)果

表2 NKX2-5基因T563C位點基因型頻率、等位基因頻率和群體遺傳特性

表3 NKX2-5基因T563C位點與不同雞品種脛長（mm）的關聯(lián)分析

2.4 NKX2-5 基因C675T位點遺傳變異分析

2.4.1 PCR-SSCP分型和測序結(jié)果 針對C675T位點設計特異性引物N2（表1），運用PCRSSCP檢測C675T位點在3個群體中的多態(tài)性。發(fā)現(xiàn)了2種基因型，分別命名為CC和CT，電泳圖譜見圖5。

挑選不同帶型不同品種共6個樣品PCR產(chǎn)物委托北京諾賽基因組研究中心有限公司進行切膠純化測序。將測序結(jié)果運用SeqMan 軟件進行比對分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CC基因型個體與GenBank上所公布的序列（登錄號： NC_006100.3）一致，定義為野生型，TT基因型定義為突變型，則CT基因型為雜合型，測序結(jié)果見圖6。

2.4.2 群體遺傳學分析 對所發(fā)現(xiàn)的C675T位點在3個雞種中進行群體遺傳參數(shù)統(tǒng)計分析。由表4可知，在3個受試群體中，3種基因型的分布為CC＞CT，無TT基因型分布，CC為優(yōu)勢基因型。在3個雞群中，有效等位基因數(shù)均顯著小于實際等位基因數(shù)，說明該等位基因在群體中分布較為不均勻，3個群體中的雜合度分別為0.018、0.239 和0.104，表明該SNP位點在3個群體中的變異較小。多態(tài)信息含量（PIC）均小于0.25 之間，表現(xiàn)為低度多態(tài)，說明該遺傳標記位點提供的所反映的遺傳變異信息較低少，在應用時需要謹慎考慮。卡方適合性檢驗顯示，3個試驗群體中的該基因座處于Hardy-Weinberg不平衡狀態(tài)（P＜0.05）。

2.4.3 C675T位點與雞脛長性狀的關聯(lián)性分析 采用SPSS 18.0軟件對高腳雞、矮腳雞和百宜黑雞NKX2-5 基因C675T位點不同基因型與其對應的脛長性狀進行關聯(lián)分析，由表5可知，各品種不同基因型個體之間脛長差異不顯著。

圖5 NKX2-5基因C675T位點PCR-SSCP電泳圖譜

圖6 NKX2-5基因C675T位點測序結(jié)果

3 討論

3.1 基因SNP位點的檢測方法

核苷酸多態(tài)性是指在基因組上單個核苷酸的變異而引起的一種二等位基因或二態(tài)的遺傳變異，其包括置換、顛換、缺失和插入，具有數(shù)量多和多態(tài)性豐富等特點。從理論上看，每個SNP位點都可有4種不同變異形式，但實際多發(fā)生2種，即轉(zhuǎn)換和顛換，兩者之比為1∶2。SNP在基因組中分布比較廣泛，在人類基因組中每300 bp就會出現(xiàn)1次單核苷酸多態(tài)性。通過SNP發(fā)現(xiàn)與疾病相關基因突變位點較為容易，而有些SNP雖然不直接參與疾病基因的表達，但其與某些疾病基因相鄰，對疾病基因的表達有間接誘導作用。因此，SNP成為了疾病診斷以及開展畜禽遺傳變異研究的一種重要遺傳標記。

表4 NKX2-5基因C675T位點基因型頻率、等位基因頻率和群體遺傳特性

表5 NKX2-5基因C675T位點與不同雞品種脛長（mm）的關聯(lián)分析

3.2 NKX2-5基因的群體遺傳結(jié)構(gòu)及其與雞脛長性狀的關聯(lián)分析

真核生物的基因由外顯子和內(nèi)含子組成，外顯子部分序列所構(gòu)成的編碼區(qū)內(nèi)核苷酸的變異可能會引起mRNA二級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進而影響其生物功能［10］。本試驗在高腳雞、矮腳雞和百宜黑雞3個雞品種NKX2-5基因外顯子1中檢測到兩個錯義突變，分別為T563C和C675T。試驗所檢測到的兩個錯義突變位點均導致了mRNA二級結(jié)構(gòu)的改變，當T563C發(fā)生T突變?yōu)镃時，二級結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯改變，自由能增加，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性降低；當C675T發(fā)生C突變?yōu)門時二級結(jié)構(gòu)也發(fā)生了改變，自由能增加，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性也有一定程度的降低。

在試驗群體中，T563C位點處于中度多態(tài)（0.25＜PIC＜0.5），多態(tài)信息含量豐富度偏低，表明試驗群體的遺傳多樣性較低，具有較高的遺傳一致性。同時該基因座在3個試驗群體中均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P＞0.05），說明3個試驗群體在選擇中均不易受外界干擾，該位點能提供較為合理的遺傳信息。所有受試群體中，有效等位基因數(shù)均接近2，相對較高，試驗群體的雜合度也較高，表明該等位基因在群體中分布較為均勻且在群體中變異較大，這可能是由于試驗群體未受過高強度的選育而導致的。C675T位點在試驗群體中處于低度多態(tài)（PIC ＜0.25），多態(tài)信息含量較為單一，表明試驗群體的遺傳多樣性很低，其遺傳一致性很高。且在3個受試群體中均只存在CC 和CT兩種基因型，無TT基因型存在，這有可能是由于TT型基因純合致死使得受試群體中均無TT基因型出現(xiàn)。該基因座在受試群體中處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P ＞ 0.05），說明3個試驗群體在選擇中均不易受外界的干擾，該位點可提供較為合理的遺傳信息。在3個受試群體中有效等位基因數(shù)和雜合度均較低，表明該等位基因在群體中分布較為不均勻，這可能是因為該基因的保守性較大而導致的。

脛骨性狀的研究多集中在數(shù)量性狀基因座上［11-12］，而脛的發(fā)育與生長階段密切相關，不同發(fā)育階段的脛長和脛圍受不同QTL的影響［13］；Ankra-Badu 等［14］將影響9周齡脛長和脛圍的QTL定位在1、4和26號染色體上。孫艷發(fā)等［8］在雞脛長和脛圍的全基因組關聯(lián)分析中，報道了1個與雞脛長達到5%全基因組水平顯著關聯(lián)的基因，即位于13號染色體上的NKX2-5基因。NKX2-5基因在調(diào)節(jié)組織分化所需的組織特異性基因表達和決定發(fā)育的時空類型上具有重要作用［5］。有研究報道NXK2-5基因為促甲狀腺激素（TSH）受體基因，與人類甲狀腺發(fā)育不全（TD）有關［15］。且在人類胚胎發(fā)育早期階段，NKX2-5基因在咽喉部和甲狀腺芽的中央位置有表達［16］，雖然后期階段其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在甲狀腺內(nèi)消失，但其對甲狀腺的發(fā)育作用不可忽略。在動物實驗組，敲除NKX2-5基因的小鼠在胚胎中甲狀腺芽與未敲除NKX2-5基因的小鼠相比較而言明顯變小，證明了NKX2-5基因?qū)τ诩谞钕侔l(fā)育的重要性［17］。McElhinney等［1］報道了NKX2-5基因的12種突變與先天性甲狀腺功能減低癥（CH）相關。于曉霞等［18］也報道了伴甲狀腺異位的先天性甲狀腺功能減低癥患兒的NKX2-5基因發(fā)生了突變。

本研究分析了T563C、C675T 2個位點不同基因型與3個受試雞品種群體脛長性狀的相關性。在T563C位點上，發(fā)現(xiàn)高腳雞CC基因型個體脛長顯著高于TT基因型個體，矮腳雞各基因型個體脛長性狀差異不顯著（P ＞ 0.05），百宜黑雞TT基因型顯著高于CT基因型。從這一結(jié)果可以看出，高腳雞脛長性狀較高個體與矮腳雞、百宜黑雞不一致，這可能是由于不同雞種的脛骨在發(fā)育過程中遺傳機制不同而引起的。對于C675T位點而言，高腳雞和百宜黑雞群體中CC基因型個體脛長性狀較高，矮腳雞群體中為CT基因型個體脛長較高。

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（責任編輯 崔建勛）

Polymorphism and association analysis of NKX2-5 gene with shank length in three chickens

YANG Hong1，ZHANG Yong2，HE Qi3，LI Jun2，ZHANG Xiong2，PENG Song2
（1.Bijie City Agricultural Management Station of Guizhou，Bijie 551700，China；2.Key Laboratory of Animal Genetics，Breeding and Reproduction in the Plateau Mountainous Region，Ministry of Education/College of Animal Science，Guizhou University/Guizhou Key Laboratory of Animal Genetics，Breeding and Reproduction，Guiyang 550025，China；3.Huaxi Agricuhure Bureau of Guiyang，Guiyang 550025，China）

Gaojiao chicken，Aijiao chicken and Baiyi black chicken in Guizhou province were used as experimental subjects in this study.SNPs of NKX2-5 genes were detected in three chicken vareties by PCR-SSCP and DNA sequencing technologies.The 2 SNPs were detected in the 3 chicken groups，T563C，C675T sites of NKX2-5 gene were missense mutations，The relevance between T563C site of NKX2-5 gene and chicken shank length showed that，TT genotype was significantly higher than CC genotype among Gaojiao chicken groups（P ＜ 0.05），TT genotype was significantly higher than CT genetype in Baiyi black chicken groups（P ＜ 0.05），uhile no significant level aruong 3 genotypes in Aijiao chicken.The C675T site of NKX2-5 had only CC and CT genotypes，and there was no significant level in different genotypes of 3 vareties.

NKX2-5 gene；chicken；shank length；SSCP；polymorphism

S813.3；Q343.1+5

A

1004-874X（2016）06-0156-07

10.16768/j.issn.1004-874X.2016.06.027

2016-03-01

貴州省農(nóng)業(yè)動植物育種專項（黔農(nóng)育專字［2012］10號）；浙江大學基本科研業(yè)務費專項（2012XZZX003-1）

楊紅（1990-），女，碩士，E-mail：15085933126@139.com

張勇（1975-），男，博士，副教授，E-mail：as.yzhang@gzu.edu.cn