黃勛和，張金楓，譚坤鳳，李麗芝，李威娜，鐘福生

（嘉應(yīng)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，廣東 梅州 514015）

五華三黃雞MHC-B區(qū)域復(fù)合微衛(wèi)星位點LEI0258遺傳多樣性與進(jìn)化研究

黃勛和，張金楓，譚坤鳳，李麗芝，李威娜，鐘福生

（嘉應(yīng)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，廣東 梅州 514015）

應(yīng)用MHC-B區(qū)域復(fù)合微衛(wèi)星位點LEI0258研究五華三黃雞的遺傳多樣性與進(jìn)化地位。147份樣品共檢測到48個等位基因，長度范圍為181～495 bp。等位基因251（0.0952）、275（0.0850）和310 （0.0816）頻率最高。DNA測序鑒定出44個等位基因，其中42個為首次發(fā)現(xiàn)。觀察雜合度、期望雜合度和多態(tài)信息含量分別為0.830、0.927和0.952。9個等位基因與15種已知MHC血清型相匹配?；趥?cè)翼區(qū)變異信息的中介網(wǎng)絡(luò)圖將44個等位基因分為7個進(jìn)化枝，其中3個進(jìn)化枝存在于紅原雞中，提示五華三黃雞起源于紅原雞。研究結(jié)果表明，微衛(wèi)星LEI0258適用于雞群體遺傳多樣性、血清型鑒定和進(jìn)化研究。

多態(tài)性；主要組織相容性復(fù)合體；LEI0258；五華三黃雞；進(jìn)化；血清學(xué)

黃勛和，張金楓，譚坤鳳，等.五華三黃雞MHC-B區(qū)域復(fù)合微衛(wèi)星位點LEI0258遺傳多樣性與進(jìn)化研究［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，43（6）：163-168.

主要組織相容性復(fù)合體（Major histocompatibility complex，MHC）是基因組編碼細(xì)胞免疫相關(guān)蛋白的基因。雞MHC位于16號染色體上，由兩個獨立的 B區(qū)和Y區(qū)組成［1］。B區(qū)對宿主許多傳染性疾?。ㄈ珩R可氏?。┑目剐曰蛞赘行缘扔嘘P(guān)［2］。傳統(tǒng)采用血清學(xué)的方法對MHC進(jìn)行分型，但由于不同群體的血清型存在較大差異，該技術(shù)難以廣泛推廣［3-4］。而位于B區(qū)的微衛(wèi)星位點LEI0258被認(rèn)為與血清型顯著關(guān)聯(lián)后［5-6］，涌現(xiàn)出一系列基于LEI0258多態(tài)性、進(jìn)化與免疫的研究，豐富了LEI0258的基礎(chǔ)理論，加強了對生產(chǎn)實踐的指導(dǎo)作用［7-12］。

五華三黃雞是原產(chǎn)于廣東省梅州市五華縣的優(yōu)良小型肉用地方品種［13］。由于外來品種的大量引進(jìn)和自身生長速度慢、繁殖性能較低等缺點，目前五華三黃雞只少量分布于五華縣的邊遠(yuǎn)山區(qū)。為了科學(xué)保護(hù)和合理利用五華三黃雞，近年來開展了資源調(diào)查、品種特性、保種選育、遺傳資源與進(jìn)化等研究，取得了一定的成果［14-19］，但抗病相關(guān)的基礎(chǔ)研究尚屬空白。本研究利用微衛(wèi)星位點LEI0258分析五華三黃雞的遺傳多樣性，探討LEI0258等位基因與MHC血清型的關(guān)系，進(jìn)一步了解LEI0258的進(jìn)化動態(tài)，為五華三黃雞保種選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料共147份樣品，來源于五華三黃雞原產(chǎn)地五華縣棉洋、安流、龍村、硝芳、周江、梅林和譚下7個鄉(xiāng)鎮(zhèn)偏遠(yuǎn)山區(qū)農(nóng)戶自孵自養(yǎng)的無明顯親緣關(guān)系的個體，采集時間為2012年10月至2013年11月，樣品類型為背部帶羽髓羽毛?；蚪MDNA采用試劑盒HiPure Tissue DNA Mini Kit （美基生物，廣州）提取，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 PCR擴增與基因分型

微衛(wèi)星位點LEI0258使用引物L(fēng)EI0258F：5' -CACGCAGCAGAACTTGGTAAGG-3' 和LEI0258R：5' -AGCTGTGCTCAGTCCTCAGTGC-3' 擴增［6］。正向引物5' 端添加了熒光標(biāo)記FAM。PCR反應(yīng)體系為20 μL，含10×PCR buffer 2μL，dNTP mixture （2.5 mmol/L）1.6 μL，引物（20 μmol/L）各0.2μL，rTaq DNA聚合酶（Takara，大連）1 U，DNA模板50 ng。擴增條件為94℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s、63℃退火1 min、72℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后在ABI 3730分析儀上進(jìn)行基因型判定，基因分型工作由無錫翼和應(yīng)用生物技術(shù)有限公司完成。

1.3 微衛(wèi)星測序

基于基因分型結(jié)果，每個等位基因挑選1個以上樣品進(jìn)行測序。具體挑選原則為：如果等位基因只為1個樣品所有，只挑選該樣品進(jìn)行測序；如果等位基因為多個樣品所共有，則挑選不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)的樣品進(jìn)行測序。待測樣品PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，割膠回收需要測序的片段，連接T載體（Takara，大連），然后轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，在LB培養(yǎng)基中進(jìn)行過夜培養(yǎng)，再使用LEI0258引物進(jìn)行PCR鑒定，最后送廣州艾基生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

等位基因數(shù)（NA）、觀察雜合度（HO）、期望雜合度（HE）和多態(tài)信息含量（PIC）通過軟件Cervus 3.0.3［20］計算。序列由軟件BioEdit［21］編輯處理，并輔以人工校驗。微衛(wèi)星側(cè)翼序列用于多態(tài)性分析，同時使用軟件SplitsTree 4.10構(gòu)建中介網(wǎng)絡(luò)圖（median-joining network）［22］。

2 結(jié)果與分析

2.1 LEI0258基因型多態(tài)性

147份樣品共檢測到48個等位基因，長度范圍為181～495 bp。其中251頻率最高（0.0952），其次是275（0.0850）、310（0.0816）和495 （0.0782），多個等位基因只出現(xiàn)1次（表1）。在樣品量接近的情況下，不同等位基因在不同群體中出現(xiàn)的頻率不盡相同，例如205和251在周江群體多于梅林群體，495在譚下群體多于其他群體。有些等位基因只出現(xiàn)在某個群體中，例如206、261 和334只分布于譚下群體中，217、336、372、407 和425僅分布于梅林群體中。

五華三黃雞群體微衛(wèi)星LEI0258遺傳變異水平見表2。在五華三黃雞7個群體中，HO均明顯低于HE，說明可能存在空位點。但HE、HO和PIC均高于0.8，高于先前的微衛(wèi)星研究［18］，表明五華三黃雞保持著較高的遺傳變異水平。

2.2 LEI0258核苷酸多態(tài)性

挑選 1 2 1個片段進(jìn)行 D N A測序，獲得44個等位基因，片段長度從182～489 bp不等，其中42個是首次發(fā)現(xiàn)（表3）。大部分測序鑒定的等位基因長度要小于基因分型的結(jié)果，只有等位基因182、193、194、205、206和217與測序結(jié)果一致（表 3）。LEI0258有兩個重復(fù)單元R13（CTATGTCTTCTTT）和R12 （CTTTCCTTCTTT），重復(fù)次數(shù)分別為1～18和2～27，呈現(xiàn)此消彼長的關(guān)系。重復(fù)區(qū)上游有77 bp（包括引物序列），下游75 bp。上游發(fā)現(xiàn)6個變異位點，以轉(zhuǎn)換為主，-29、-30出現(xiàn)“TT”缺失的現(xiàn)象。下游發(fā)現(xiàn)4個變異位點，以顛換為主。下游11～18“ATTTTGAG”的多態(tài)現(xiàn)象與Han等［9］和Chazara等［10］的報道相同，但與Fulton等［5］報道的“ATTTGAGG”不一致。9個等位基因（194、205、295、309、345、381、393、420、443）對應(yīng)于15種血清型，分別是B1、B5、B6、B10、B13.1、B13.2、B14、B17、B24、B26、B34、B62、B76、BW3 和BW11（表3）。

表1 五華三黃雞群體微衛(wèi)星LEI0258等位基因頻率

表2 五華三黃雞群體微衛(wèi)星LEI0258的遺傳變異分析

表3 五華三黃雞微衛(wèi)星LEI0258位點等位基因多態(tài)性

2.3 LEI0258側(cè)翼區(qū)中介網(wǎng)絡(luò)圖分析

去掉微衛(wèi)星LEI0258重復(fù)區(qū)后，基于側(cè)翼區(qū)的變異信息構(gòu)建中介網(wǎng)絡(luò)圖（圖1）。44個等位基因分為7個進(jìn)化枝（A～G），每個進(jìn)化枝含1～23個等位基因，B、C和F只有1個等位基因，D則有17個，而R13大于1的等位基因全部在進(jìn)化枝D中。進(jìn)化枝A、D和G同樣存在于紅原雞中。

圖1 基于五華三黃雞LEI0258位點側(cè)翼區(qū)變異信息的中介網(wǎng)絡(luò)圖

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，五華三黃雞微衛(wèi)星位點LEI0258顯示出極高的多態(tài)性，與該群體的遺傳資源現(xiàn)狀相符，說明LEI0258適用于評估雞群體遺傳多樣性水平。同時LEI0258與MHC血清型顯著關(guān)聯(lián)，通過研究LEI0258單倍型，可快速鑒定血清型，降低研究成本和提高效率。

3.1 LEI0258多態(tài)性

本研究獲得五華三黃雞微衛(wèi)星位點LEI0258等位基因44個，其中42個未在其他群體發(fā)現(xiàn)［5，8-10］。Han等［9］發(fā)現(xiàn)了21個LEI0258的新等位基因，等位基因489只存在于中國地方雞群體中，稀有等位基因可作為鑒定雞品種和監(jiān)測雞群體保護(hù)動態(tài)的依據(jù)。本研究發(fā)現(xiàn)的新等位基因可能是五華三黃雞群體所特有的，可作為品種鑒定的潛在分子標(biāo)記，但需要進(jìn)一步確認(rèn)。

五華三黃雞LEI0258表現(xiàn)出極高的多態(tài)性（HO＞0.83，PIC＞0.95），高于許多地方雞種如會寧雞、靜寧雞、絲羽烏骨雞和商品雞［10，12］。五華三黃雞其他微衛(wèi)星研究同樣表現(xiàn)出高多態(tài)性［18］，說明該品種仍保留著較高的遺傳多樣性，具有很大的保護(hù)潛力與利用價值，這得益于五華三黃雞封閉的自然環(huán)境和飼養(yǎng)模式。因此，微衛(wèi)星位點LEI0258可作為研究雞群體遺傳多樣性的候選分子標(biāo)記。

3.2 LEI0258與血清型

MHC血清型類型的豐富程度與疾病抵抗能力正相關(guān)［7，23-24］。由于可獲得的血清型信息有限，并且五華三黃雞新發(fā)現(xiàn)的等位基因較多，許多等位基因的血清型無法確定。9個等位基因與15種已知血清型相對應(yīng)，這些血清型大部分來源于白來航雞，并且已在其他雞群體中得到驗證［5，9，24］。剩余35個等位基因?qū)?yīng)的血清型尚未鑒定，因此將來需要開展五華三黃雞MHC血清型鑒定工作，從而為抗病研究提供理論依據(jù)。

3.3 LEI0258與進(jìn)化

LEI0258是非典型性的微衛(wèi)星位點，由兩個重復(fù)單元R13和R12組成，兩者不同的組合形成了不同的等位基因。同時側(cè)翼區(qū)存在大量的插入缺失（indels）和堿基突變（SNPs），表現(xiàn)出極高的多態(tài)性［5，7-12］。目前NCBI數(shù)據(jù)庫上LEI0258等位基因有80個，加上本研究新發(fā)現(xiàn)的42個，共122個，遠(yuǎn)高于其他微衛(wèi)星位點。由于側(cè)翼區(qū)的變異速率低于重復(fù)區(qū)，因而側(cè)翼區(qū)的變異信息可作為劃分等位基因的依據(jù)。然而，盡管會出現(xiàn)片段長度和重復(fù)單元相同而被劃分為不同的等位基因的現(xiàn)象，但Chazara等［10］指出中介網(wǎng)絡(luò)圖更多反映的是等位基因之間的關(guān)系，而非系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。同時，E 等［11］鑒定出LEI0258在-30～43之間存在重組現(xiàn)象，可能在MHC的進(jìn)化過程中發(fā)揮重要的作用。因為MHC處于與抗病能力密切相關(guān)編碼區(qū)，無疑會受到選擇的壓力，因而LEI0258也可能處于選擇和進(jìn)化動態(tài)中［11］。

中介網(wǎng)絡(luò)圖將44個等位基因分為7個進(jìn)化枝，重復(fù)單元R13大于1的等位基因全部分布在進(jìn)化枝D中。進(jìn)化枝A、D和G存在于紅原雞中，說明五華三黃雞可能起源于紅原雞，與線粒體基因組的研究結(jié)論相一致［17］。

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（責(zé)任編輯 崔建勛）

Diversity and evolution of the highly tandem repeat LEI0258 with in MHC-B region in Wuhua three-yellow chicken

HUANG Xun-he，ZHANG Jin-feng，TAN Kun-feng，LI Li-zhi，LI Wei-na，ZHONG Fu-sheng
（School of Life Sciences，Jiaying University，Meizhou 514015，China）

To investigate the polymorphism and evolution of Wuhua three-yellow chicken，the tandem repeat LEI0258 located within the B region of chicken major histocompatibility complex （MHC-B region） was applied.A total of 48 alleles ranging from 181 to 495 bp in 147 samples were found.Three alleles，251 （0.095），275 （0.0850），and 310 （0.0816） were the most frequency in this breed.Forty-two of 44 alleles defined by DNA sequencing was novel for Wuhua three-yellow chicken.The LEI0258 showed high levels of polymorphism，with 0.830，0.927 and 0.952 for observed heterozygosity，expected heterozygosity and polymorphic information content，respectively.Nine alleles were corresponding to 15 available serotypes.The 44 alleles were classified into seven clusters，based on the SNPs and indels found within the sequences flanking the repeats，of which three was also found in red fowl jungle，indicating that Wuhua three-yellow chicken was of origin from red fowl jungle.The results presented herein suggested that LEI0258 could be used as a candidate molecular marker for uncover genetic diversity，serology and evolution in chicken.

polymorphism；major histocompatibility complex；LEI0258；Wuhua three-yellow chicken；evolution；serology

S831.2；Q346+5

A

1004-874X（2016）06-0163-06

10.16768/j.issn.1004-874X.2016.06.028

2016-03-20

廣東省自然科學(xué)基金（2014A03030 7018）；嘉應(yīng)學(xué)院“創(chuàng)新強校工程”項目（CQX019）；廣東省公益研究與能力建設(shè)項目（2015A020208020，2016A030303068）；嘉應(yīng)學(xué)院重點科技計劃項目（2015KJM03）

黃勛和（1982-），男，博士，講師，E-mail：hxh826@126.com

鐘福生（1958-），男，博士，教授，E-mail：zfs@jyu.edu.cn